CN113893268B - 金针菇子实体膳食纤维、提取方法及其在制备减重药物或治疗肥胖症药物中的应用 - Google Patents
金针菇子实体膳食纤维、提取方法及其在制备减重药物或治疗肥胖症药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种金针菇子实体膳食纤维的提取方法，其将金针菇子实体净制后，用乙醇浸提，残渣晾干，然后用2‑8%氢氧化钠溶液于60‑80℃浸提，过滤，滤渣洗至中性，烘干，即得。本发明使用高脂饲料建立大鼠肥胖模型，测定大鼠体重、Lee’s指数、BMI和脏器指数；并通过HE染色法观察大鼠脂肪组织和肝脏的病理学变化。通过以上检测指标综合评价金针菇子实体膳食纤维的减重作用。实验结果证明：金针菇子实体膳食纤维可以有效降低大鼠体重、Lee’s指数、BMI和脏器指数，缓解造模形成的脏器损伤，且无毒副作用。因此，本发明金针菇子实体膳食纤维可被用来制备治疗/预防肥胖症保健品或药物。
Description
技术领域
本发明属于医药和/或保健品技术领域，具体涉及一种金针菇子实体膳食纤维、提取方法及其在减重方面的研究。
背景技术
肥胖已经成为危害全球人类健康的疾病之一，11亿成年人和10％的儿童现在被归类为超重或肥胖，平均预期寿命已经缩短。肥胖的主要不良后果是心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和诱发多种癌症等，肥胖主要表征是腰围变粗，体重超出正常水平，不断积累的脂肪会损害机体的健康。脂肪组织是由脂肪细胞、基质前脂肪细胞、免疫细胞和内皮细胞组成的异质性混合物，是一个复杂的分泌系统，由脂肪分泌的因子我们统称为脂肪因子，其主要原因是膳食摄入量和能量消耗失衡等。
金针菇(Flammulina velutipes)是担子菌亚门口蘑科金钱菌属真菌，研究发现金针菇具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和辅助改善记忆的功效。膳食纤维(Dietary fiber,DF)被营养学家称为“第七大营养素”，金针菇膳食纤维含量非常丰富，但未见关于金针菇子实体膳食纤维的减重作用的报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于治疗肥胖症的金针菇子实体膳食纤维，其治疗效果显著，且无毒副作用。
本发明还提供了上述金针菇子实体膳食纤维的提取方法及其在减重方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种金针菇子实体膳食纤维的提取方法，其将金针菇子实体净制后，用乙醇浸提，残渣晾干，然后用2-8％氢氧化钠溶液于60-80℃浸提以提取金针菇子实体膳食纤维，过滤，滤渣洗至中性，烘干，即得。
具体的，可以用体积浓度60-80％的乙醇浸提1-3次，每次浸提2-4d，以充分除去小分子物质。优选的，浸提2次，每次浸提3d。
进一步优选的，可以按料液比1kg：4-7L加入体积浓度60-80％的乙醇。
具体的，可以按料液比1kg：15-25L加入质量浓度2-8％氢氧化钠溶液，于70℃浸提40-60min。为了能提取获得更多的金针菇膳食纤维，优选按料液比1kg：20L加入质量浓度6％氢氧化钠溶液。
具体的，烘干温度为50-70℃，优选60℃烘干。
本发明提供了采用上述提取方法提取获得的金针菇子实体膳食纤维。
本发明还提供了上述金针菇子实体膳食纤维在制备减重药物或治疗肥胖症药物中的应用。
进一步的，应用时，金针菇子实体膳食纤维的用量为1～2g/kg。如，可以是1g/kg、1.5g/kg、2g/kg等。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明从金针菇子实体中提取获得金针菇子实体膳食纤维，并通过测定金针菇子实体膳食纤维对肥胖症大鼠体重、Lee’s指数、BMI和脏器指数的影响，分析其可能的减重机制。实验结果证明：金针菇子实体膳食纤维可降低大鼠体重、Lee’s指数、BMI和脏器指数，且无毒副作用。因此，本发明金针菇子实体膳食纤维可被用来制备治疗/预防肥胖症保健品或药物。
附图说明
图1为金针菇子实体膳食纤维的红外图谱；
图2为金针菇子实体膳食纤维的粒径分布图谱；
图3为金针菇子实体膳食纤维的X-射线衍射图谱；
图4为金针菇子实体膳食纤维对大鼠体重的影响；
图5为金针菇子实体膳食纤维对大鼠BMI指数(A)和Lee’s指数(B)的影响；
图6为不同组别大鼠肝脏组织的病理学观察；
图7为不同组别大鼠脂肪组织的病理学观察。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
一种金针菇子实体膳食纤维，其经下述提取方法提取获得，具体为：
将干燥的金针菇子实体5kg净制、剪碎，然后加入体积浓度70％乙醇25L浸提2次，每次浸提3d。残渣晾干后，称重剩余2593.9g，按照料液比1g：20mL加入质量浓度6％氢氧化钠溶液于70℃浸提50min，过滤，滤渣用蒸馏水洗至中性，60℃烘干，称重得1365g金针菇膳食纤维；打粉，过80目筛，备用。
下述以实施例1制备所得金针菇子实体膳食纤维进行相关试验。
理化性质的测定
1，持水力的测定：
准确称取250mg金针菇子实体膳食纤维，置于离心管中，加去离子水10mL，室温下振摇24h，3 000r/min离心15min，取出后，弃去上清液并用滤纸吸干离心管壁残留水分，称重。
持水力/(g/g)＝(样品湿重-样品干重)/样品干重
2，持油力的测定：
准确称取250mg金针菇子实体膳食纤维，置于离心管中，加10mL花生油，室温下振摇24h，3000r/min离心15min，取出后，弃去上层油并用滤纸吸干沉淀表面的油珠，称重。
持油力/(g/g)＝(样品湿重-样品干重)/样品干重
3，膨胀力的测定：
准确称取250mg金针菇子实体膳食纤维，置于10mL量筒中，加入5.0mL蒸馏水，摇匀后放置24h，读取量筒中膳食纤维的体积，计算每克纤维的膨胀体积(mL/g)。
溶胀性/(mL/g)＝(溶胀后膳食纤维体积-样品体积)/样品干重
主要成分含量测定：
1，纤维素：
纤维素含量测定参照GB/T 2677.10-1995《食品中纤维素含量测定》进行。称取1g左右金针菇子实体膳食纤维，置于250mL锥形瓶中，加25mL硝酸乙醇混合液(硝酸：95％乙醇＝1：4)，装上冷凝回流器，沸水浴1h，不断震荡，直至纤维变白后过滤，并用10ml硝酸乙醇混合液洗涤残渣及锥形瓶，再用热水不断洗涤直至滤渣不显酸性，最后用乙醇洗涤数次。所得滤渣烘干至恒重，称重。滤渣重即为纤维素总量，除以样品质量即为纤维素含量。
2，木质素：
参考文献测定方法，称取金针菇子实体膳食纤维0.5g，加入20mL 72％H2SO4，在室温下静置4-6h，然后转移到三角烧瓶中，加入去离子水200mL，然后100℃下回流2-2.5h。后用90℃热水漂洗过滤，洗涤3-5次，于100℃烘干，称重，即得木质素量。除以样品质量计算出每克样品所含木质素含量。
3，半纤维素测定：
制定标准曲线：分别吸取0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL的标准葡萄糖工作溶液置于20mL具塞玻璃试管中，用蒸馏水补至1.0mL。向试液中加入1.0mL苯酚溶液，然后快速加入5.0mL硫酸，静置10min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20min，490nm测吸光度。以葡聚糖或葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线，为y＝2.056x-0.0048。
参考文献测定方法，取0.2g金针菇子实体膳食纤维渣于烧杯中，加入10mL质量分数80％硝酸钙溶液，置电炉上加热，小火煮沸5min，冷却后离心；将沉淀用热水冲洗3次，然后向沉淀中加10mL浓度为2mol/L的盐酸，盖上玻盖，混匀，置沸水浴中，不时搅拌下沸腾45min；冷却后离心，水解后得到的糖溶液上清液移入100mL容量瓶中，将沉淀冲洗3次，洗涤液并入容量瓶中；向容量瓶中加1滴酚酞，用2mol/L氢氧化钠中和至显玫瑰色，稀释至刻度，随后将其过滤至烧杯中，弃去初滤液。所得滤液按照苯酚硫酸法用酶标仪在490nm下测得吸光度值，结果代入标准曲线求得样品测定液中的含糖量后，结果代入以下公式得半纤维素含量。
结果计算：
样品中糖含量以质量分数ω计，单位以克每百克(g/g)表示，公式如下：
ω＝((m1*V1)/(m2*V2))*0.9*10-6
式中：
m1—从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，单位为微克(μg)；
V1—样品定容体积，单位尾毫升(mL)；
V2—比色测定时所移取样品测定液的体积，单位为毫升(mL)；
m2—样品质量，单位为克(g)；
0.9—葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。
计算结果保留至小数点后两位。
4，傅里叶红外光谱分析：
取干燥金针菇子实体膳食纤维1mg和KBr(光谱级)100mg研磨，研磨后压成透明的薄片，使用空白KBr作为背景，扫描次数为20次和分辨率为4cm-1，扫描范围4000-400cm-1。
5，X-射线衍射扫描：
将金针菇子实体膳食纤维研磨成粉末状，利用D8 ADVANCE衍射仪(德国布鲁克AXS有限公司)测定平菇水不溶性膳食纤维X-射线衍射图谱。测试条件为：Cu靶，Ka射线，管压40kv，管流40mA，发射狭缝和衍射狭缝选10，受光狭缝0.3mm，波长1.5418A，扫描范围2θ＝5°～80°，扫描速度18.59°/min，步长0.04°，积分时间0.2，石墨滤波片。
6，粒径分布测定：
采用纳米粒度(DLS)仪(英国马尔文仪器有限公司)进行测试，实验室温度为25℃，溶剂水的折射率n＝1.332，入射波长λ＝632.8nm，样品测试持续时间300s。
理化性质及含量测定结果分析：
金针菇子实体膳食纤维主要由纤维素、木质素和半纤维素组成，还含有一些水分、蛋白质、脂肪等；其含量测定如表1所示，纤维素含量最高为63.22％，半纤维素含量最低为0.39％；膳食纤维结构中具有大量的亲水基团，因此具有较强的持水力，因来源不同，持水力大约是其自身重量的1.5～25倍。持水力、持油力和溶胀力是常用来评价膳食纤维质量的三个指标，由结果可知，膳食纤维的持水力和溶胀力是其质量的7倍左右，其测定结果如表1所示。
表1金针菇子实体膳食纤维的组成及性质
金针菇子实体膳食纤维的红外结果如图1所示，由图谱可以看出：在3362cm-1为O-H键的伸缩振动，2922cm-1为C-H键的伸缩振动，认为是纤维素和半纤维素的典型结构的存在；1652cm-1处附近出现的小尖峰是由于半纤维素羰基中C＝O非对称收缩振动形成的，吸收水在1652cm-1处出现了特征吸收带，肩峰在1558cm-1处，这可能与木质素中的芳香族苯、糖醛酸中的-COOH的C-O拉伸和多酚有关，红外图谱分析证明了样品的可靠性。
使用origin绘制金针菇子实体膳食纤维粒径分布图谱，如图2所示，在1mg/mL浓度下，粒径较大，分布不均匀(一般要求PDI低于0.2)。
X-射线衍射可表征膳食纤维晶体的结构类型和结晶度。金针菇子实体膳食纤维的XRD图谱如图3所示，衍射角2θ在15°～25°范围内主要是纤维素和半纤维素衍射峰，膳食纤维具有典型的纤维素Ⅰ型晶体结构，纤维素Ⅰ型晶体可以向纤维素Ⅱ型晶体转化。X-射线衍射图谱中的峰越尖表明样品的结晶度越高，在19.83°出现强衍射峰，为纤维素Ⅰ型的特征衍射峰，进一步证实了样品的可靠性。
大鼠金针菇子实体膳食纤维应用实验
一、试验动物
SPF级的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重220-250g。购买于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2019-0002。实验前适应性饲养1周(温度25±2℃，光照12h/d，湿度40～45％)，喂养标准饲料，自由饮水。
二、实验试剂与仪器
金针菇子实体于2021年5月由河南龙丰实业股份有限公司提供；
ME104分析天平(METTLER TOLEDO)；
FMB40全自动雪花制冰机(上海比朗仪器有限公司)；
MDF-U33V医用低温箱(普和希株式会社)；
高脂饲料(物料编号：Boaigang-1135DM，北京博爱港生物技术有限公司)；
奥利司他胶囊(舒尔佳)(生产批号：084200708，鲁南制药集团山东新时代药业)。
三、实验方法：
70只4～5周龄SD大鼠，适应性饲养1周，随机取出8只作为空白组(BC)，其余进行高脂饲料造模，对照组动物以基础饲料喂养，其它小组即造模组大鼠喂食高脂饲料，每周记录大鼠体重。造模周期为8周，肥胖模型以模型组中大鼠体重超过空白对照组大鼠平均体重20％，则视为造模成功。按体重随机分为5组(n＝8)：模型对照(MC)组、阳性对照(PC)组、高剂量(HD)组、中剂量(MD)组和低剂量(LD)组，各组之间重量水平无统计学差异。每天上午9：00开始灌胃、喂食，记录每天摄食量。空白组与模型组以1mL/100g体重灌胃生理盐蒸馏水。阳性对照组每天以10mg/(kg.d)的剂量将奥利司他胶囊用蒸馏水打成混悬液，以1mL/100g灌胃给药。膳食纤维高、中、低剂量组分别按2g/kg、1.5g/kg和1g/kg，1mL/100g每天2次灌胃给药，给药6周。实验结束后禁食不禁水12h，取血室温放置1h，3500rpm下离心15min，分离得到血清样品，并对大鼠进行解剖处理，取附睾脂肪、肾周脂肪、肝脏、肾脏、取盲肠内容物。
四、指标测定
1、体重、脏器指数和摄食量测定
每组大鼠从喂食第一天开始称重，每周记录一次体重，共7次。取附睾脂肪、肾周脂肪和肝脏，冷生理盐水清洗，称重，计算大鼠脂肪指数和肝脏指数。
脂肪指数＝胸腺重量(g)/体重(g)；
肝脏指数＝脾脏重量(g)/体重(g)。
2、Lee’s指数和BMI的测定
在末次给药后测定大鼠的体重和身长，计算Lee’s指数和BMI。计算公式：
BMI＝体重(g)/体长^2(cm)
3、HE染色法
将小鼠肝脏和脂肪部位用预冷的生理盐水冲洗干净，将其放入4％的多聚甲醛溶液中，固定24h，之后脱水，常规石蜡包埋，切片。采用苏木素-伊红染色5min，脱水，用中性树胶封片。
五、统计学分析方法
采用IBM SPSS Statistics 26进行统计分析，实验结果表示为平均值±标准偏差表示。采用单因素方差分析(ANOVA)。
六、金针菇子实体膳食纤维减重的结果与分析
1、金针菇子实体膳食纤维对大鼠体重、Lee’s指数和BMI指数的影响
体重是衡量肥胖模型药物变化的最直接的指标，BMI指数作为肥胖的测定指标被国内外认可度很高，Lee’s指数也是用来评价肥胖级数的常用指标。金针菇子实体膳食纤维对大鼠体重的影响如图4所示，给予高脂饲料8周，与BC组大鼠体重相比，MC、PC、HD、MD和LD大鼠体重具有极显著性增加(P<0.001)，且体重超过20％，说明肥胖模型造模成功。与MC组相比，给予金针菇子实体膳食纤维的HD、MD和LD组大鼠体重明显下降(P<0.01)，说明金针菇子实体膳食纤维起到减重的作用，且减重效果优于PC组。
金针菇子实体膳食纤维对大鼠BMI指数和Lee’s指数的影响如图5所示，与MC组相比，给予金针菇子实体膳食纤维的HD、MD、LD组的BMI和Lee’s指数均具有显著性差异(P<0.001or P<0.01or P<0.05)，进一步说明金针菇子实体膳食纤维可以有效降低肥胖大鼠的体重。
2、金针菇子实体膳食纤维对大鼠体脂比和肝脏指数的影响
肥胖症状的大鼠，脂肪细胞的体积会增大，身体脂肪异位堆积严重，各个组织的重量都会增加。当肝脏从血液中摄取的脂肪酸和自己内部合成的脂肪酸速率大于脂肪酸的氧化和输出的速率就会堆积合成甘油三酯，非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指肝细胞中脂肪的积累超过肝脏重量5％。大鼠的脏器重量及脏器指数如表2所示，与MC组相比，给予金针菇子实体膳食纤维的HD、MD、LD组的的肝脏重量和肝脏指数均具有显著性差异(P<0.01)，说明金针菇子实体膳食纤维有良好的减轻肝脏脂肪沉积的效果。与MC组相比，给予金针菇子实体膳食纤维的HD、MD、LD组的附睾脂肪重量和肾周脂肪重量均具有显著性差异(P<0.01)，说明金针菇子实体膳食纤维可降低大鼠的内脏脂肪，具有显著的减肥的作用。
表2金针菇子实体膳食纤维对大鼠肝脏及肝脏指数和脂肪及体脂比的影响
注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
3、金针菇子实体膳食纤维对大鼠摄食量的影响
对大鼠每周所食饲料进行称重统计，结果如表3所示，在大鼠的整个喂养过程中，MC组的摄食量增加率为6.25％，相对于HD、MD、LD组较低，可能与大鼠的体重有关；HD组摄食量增加率最大为67.22％，可能与金针菇子实体膳食纤维有关；HD、MD、LD组的摄食量增加，但体重下降，说明金针菇子实体膳食纤维可能通过吸附脂肪来降低大鼠的体重。
表3金针菇子实体膳食纤维对大鼠摄食量的影响
注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4、金针菇膳食纤维对大鼠脂肪组织和肝脏病理变化的影响
肝脏组织切片如图6可知，BC组小鼠肝细胞排列紧密，结构完整，界限清晰，肝细胞索呈放射状，未见脂肪空泡，无脂肪变性；MC组小鼠肝细胞体积显著增大，脂肪空泡比较多，细胞结构不太完整，呈现出典型的脂肪肝症状；PC组的脂肪空泡减少，细胞体积也在减小，与MC组相比，HD、MD组肝细胞索呈放射状，未见脂肪空泡，LD组区别不明显，脂滴依然清晰可见。可以得出膳食纤维可以改善高脂带来的损伤。由于脂肪肝的病理状态下，会再造成一定的肝损伤，因此在高脂饮食下，金针菇子实体膳食纤维可以通过降低肝脏中的脂肪含量来对肝功能起到保护作用。
脂肪组织是体内脂肪积累的器官，与肥胖的发生有着密切的联系。脂肪组织结果如图7所示，MC组的小鼠脂肪细胞体积明显大于BC组，表明高脂肪饮食可促进脂肪滴在脂肪细胞中积聚。PC、HD组与MC组相比，脂肪细胞的体积明显减小，MD、LD组与MC组相比，脂肪细胞体积略变小，但不是特别明显。可见，金针菇子实体膳食纤维可以通过减小大鼠的脂肪细胞大小来降低肥胖，防止脂肪在脂肪细胞中的积累可能是抑制肥胖发生的重要机制。
以上结果表明，金针菇子实体膳食纤维可通过降低大鼠体重、肝脏指数和体脂比、肝脏中的脂肪沉积，改变脂肪组织中细胞的大小而发挥减重的作用。
Claims (1)
1.一种金针菇子实体膳食纤维在制备减重药物或治疗肥胖症药物中的应用，其特征在于，将干燥的金针菇子实体净制、剪碎，然后加入体积浓度70%乙醇25 L浸提2次，每次浸提3d；残渣晾干后，按照料液比1g：20 mL加入质量浓度6%氢氧化钠溶液于70℃浸提50 min，过滤，滤渣用蒸馏水洗至中性，60℃烘干，即得;
所述金针菇子实体膳食纤维主要由纤维素、木质素和半纤维素组成，还含有一些水分、蛋白质、脂肪；纤维素含量为63.22%，半纤维素含量为0.39%。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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