CN116391618B - 一种药用苦木组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种药用苦木组培快繁方法，属于植物组培技术领域。本发明方法包括以下步骤：(1)外植体选择；(2)外植体灭菌；(3)初代诱导培养；(4)继代增殖培养；(5)生根培养；(6)炼苗移栽。本发明将灭菌后的外植体接种于初代诱导培养基中，诱导培养成初始芽，再将初始芽接种于继代增殖培养基中，获取继代丛芽，再剪取单芽接种于生根培养基中诱导生根，经过培养后，获取组培生根苗，经炼苗移栽后，获取出圃组培苗。本发明实现了高效诱导、增殖、生根，芽诱导率、增殖系数和生根率高，苗木质量好，培育周期短，从而降低苦木组培产业化育苗中的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种药用苦木组培快繁方法。
背景技术
苦木(Picrasma quassioides)俗名熊胆树、黄楝树、苦皮树、苦檀木、苦树等，为苦木科(Simaroubaceae)苦木属(Picrasma)落叶或常绿乔木或灌木，树皮通常有苦味，叶互生，有时对生，通常成羽状复叶，少数单叶，自然生长于海波1000m左右山坡、山谷、山地杂木林中，主要分布于黄河流域以南各省区，以广东、广西最多。苦木全株可入药，其茎、枝、叶、根内含苦木素、异苦木素、苦树素、苦木酮碱等十几种生物碱、苦味素类及黄酮类等，具有抑菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用，对呼吸系统，消化系统和泌尿系统的感染、外伤感染和脓肿等有显著疗效；兽医用苦木皮治牛咳嗽胃炎、大小肠热症、炭疽病等，民间还有以苦树作土农药，杀灭蔬菜及园林害虫。此外，苦木可作为石山绿化植物，因此，具有极高的科研、生态以及药用价值。
随着现代医学技术的发展，临床用药需求量越来越大，但自然状态下，苦木生长速度缓慢，产量十分低。目前苦木多以野生为主，极少人工栽培，在经济利益的刺激下，林农大量砍伐野生资源，甚至连根挖走，苦木资源几乎遭毁灭性破坏，自然更新小苗很少，其遗传品质严重枯竭。现单靠野生资源已远远不能满足国内外市场的需求，为保证苦木资源的可持续利用，筛选出优良种源甚至无性系进行人工种植是必然趋势。传统苦木苗木繁育方式主要有两种：一种是有性繁殖(种子繁殖)，苦木系杂性异株，有的是单性花，不结实，有两性花的，结实很少，种子有休眠期，促萌芽较困难，因此种子繁殖难以满足生产应用的需求；种子培育的苗木生产上林份分化大，林相参差不齐，无法实现规模利用。另一种无性繁殖(分株繁殖)，在幼根上发出新芽，形成独立的新植株，其繁殖速度慢，根的数量受限，成活率难以保证。
通过组培繁育苗木，能够在短时间内繁育出大量具有优良性状并且一致的苗木，不受繁殖季节等因素的限制，因此，苦木组培快速繁育方法的研究与应用是开展苦木规模化人工种植的关键。目前关于苦木组织培养研究方面报道很少，专利公开号CN 107593459A公开了一种苦木组培快繁的技术，该技术以苦木细嫩孢子叶为外植体，经过外植体消毒、GGB诱导、增殖、分化、生根，得到生根苗，但该技术存在着育苗周期长的问题，在GGB诱导培养时，需培养22天外植体才长出根毛；在增殖培养时，GGB培养32天才明显增大；在GGB分化培养时，需培养32天才分化出不定芽；且诱导生根时需培养22天，育苗历经周期长。
然而苦木在组织培养中还存在以下几方面的问题：一是组培继代芽增殖过程中，褐化和玻璃化现象严重，芽尖易枯褐坏死；二是诱导率和增殖系数偏低、组培苗木培育周期长，难以应用其进行规模化繁育苗木。因此，急需一种育苗周期短、增殖系数和生根率高、苗木质量好的苦木组培快速繁育方法，为苦木大规模苗木生产、人工种植利用提供技术支撑具有重要的意义。
发明内容
针对以上问题，本发明提供一种药用苦木组培快繁方法，通过外植体选择、外植体灭菌、初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养、炼苗移栽，实现了高效诱导、增殖、生根，芽诱导率、增殖系数和生根率高，培育周期短，苗木质量好。
本发明通过以下技术方案实现：
一种药用苦木组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择：选择健壮、无病虫害、性状优良、含生物碱高的苦木植株进行伐桩或者环割促萌，待枝条萌芽长至1～2cm长时，喷施体积浓度0.3～0.5％多菌灵溶液，10～15天后于晴天采集当年生、活力旺盛的萌芽条作为外植体；
(2)外植体灭菌：将外植体剪去叶片和叶柄，保留5～6cm的萌芽条，将外植体表面清洗干净后，进行灭菌处理，灭菌结束后，吸干水分，备用；
(3)初代诱导培养：将灭菌后的外植体剪去茎段芽两端及创伤面，修剪成带1～2个的茎节或腋芽的茎段，以斜插式接种于初代诱导培养基上，每瓶1株，先暗培养5～10天，在温度为23～26℃、光照强度为1500～2500LX、光照时间为10～12h/d下继续培养5～10天，获取初始芽；
(4)继代增殖培养：待初始芽高为3～6cm，剪掉老叶片，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1～2cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中，每瓶5～8株，连续培养20～25天，获取继代丛芽；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部的愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2～3个芽的小丛芽接种在继代增殖培养基中培养，每瓶5～8株/丛；
(5)生根培养：从继代丛芽中选取生长健壮、芽高≥1cm的单芽，在无菌条件下垂直插入配制好的生根培养基中，进行生根培养，每瓶插10～15株，培养15～20天，获取生长健壮的组培生根苗；
(6)炼苗移栽：待组培生根苗的根系长度≥1cm、根数3条以上时，将生长健壮的组培生根苗移到室外育苗大棚中进行炼苗5～10天，之后用清水洗掉根部培养基，移栽入已消毒好的基质育苗容器中，并进行苗木管理。
进一步地，步骤(3)中，所述初代诱导培养基包括以下组分：改良MS、0.3～0.5mg/L6-BA、0.4～0.6mg/L NAA、0.4～0.6mg/L KT、3～5g/L琼脂、28～32g/L糖，pH为5.8～6.2。
进一步地，步骤(4)中，所述继代增殖培养基包括以下组分：改良MS、0.1～0.3mg/L6-BA、0.1～0.3mg/L NAA、0.4～0.6mg/L IAA、0.7～0.9mg/L KT、3～5g/L琼脂、28～32g/L糖、0.01～0.02mg/L核黄素、0.005～0.02mg/L抗坏血酸，pH为5.8～6.2。
进一步地，步骤(5)中，所述生根培养基包括以下组分：1/2改良MS、0.4～0.6mg/LIBA、0.7～0.9mg/L IAA、0.04～0.06g/L活性炭、3～5g/L琼脂、14～16g/L糖，pH为5.8～6.2。
进一步地，所述改良MS包括以下组分：680～720mg/L NH4NO3、1400～1500mg/LKNO3、430～450mg/L CaCl2·2H2O、360～380mg/L MgSO4·7H2O、26～28mg/L FeSO4·7H2O、36～38mg/L Na2-EDTA、21～23mg/L MnSO4·4H2O、7～9mg/L ZnSO4·7H2O、0.02～0.03mg/LCoCl2·6H2O、0.02～0.03mg/L CuSO4·5H2O、0.1～0.2mg/L NaMoO4·2H2O、0.7～0.9mg/LKI、5～7mg/L H3BO3、0.4～0.6mg/L烟酸、0.4～0.6mg/L盐酸吡哆醇、0.3～0.5mg/L盐酸硫胺素、90～110mg/L肌醇、1～3mg/L甘氨酸、240～250mg/L KH2PO4、450～470mg/LCa(NO3)2·4H2O、740～760mg/L花宝一号。
进一步地，步骤(4)和步骤(5)中，所述培养的控制条件均为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000Lx，光照时间12～16h/d。
进一步地，步骤(2)中，所述灭菌处理具体步骤为：将外植体表面清洗干净后，先放入体积浓度为2～3％的洗洁精中震荡浸泡10～15min，再放入体积浓度为4～6％的次氯酸钠溶液消毒25～30min，无菌水冲洗3～5次，然后密闭在无菌培养皿中，放在7～9℃下冷藏15～16h，然后在超净工作台上，放入体积浓度为70～75％的酒精溶液中浸泡10～30s，最后放入体积浓度为0.1～0.2％的HgCl2溶液中震荡浸泡8～12min。
进一步地，步骤(6)中，所述育苗基质由黄泥、蛭石、泥炭土按照体积比1:1～2:3混合组成。
进一步地，步骤(6)中，所述苗木管理的方法为：将苗木置于带遮阴网的苗圃内，每天早晚各喷淋水1～2次；7天后，用浓度为0.3～0.5％的复合肥(15-15-15)水溶液喷淋，每10天喷淋1～2次；移栽后一周内，透光度保持在40～50％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至80～90％。
进一步地，步骤(6)中，所述苗木移栽前3天，用体积浓度为0.5～1.0％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去高锰酸钾溶液。
进一步地，步骤(6)中，所述育苗容器为直径7～9cm、高9～12cm的无纺布袋。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
1、本发明方法通过外植体选择、灭菌、初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养、炼苗移栽，实现了高效诱导、增殖、生根，育苗周期短，苗木质量好，可规模化生产，为保护苦木资源日益匮乏和推广人工栽培利用，具有良好的生态效益和经济效益。
2、本发明的组培快繁方法，打破常规采用种子繁殖的方式，解决了种子结实低、繁育效率低的问题，建立了苦木组培快速繁育苗技术体系。由于外植体采自苦木优良单株，其组培苗保持了母本优良的遗传性状，可促进苦木种苗生产的良种化和无性系化。
3、本发明建立了无菌离体再生体系，采用以芽繁芽的方式进行，不需要诱导愈伤组织再分化出芽，节省了组培的步骤和时间，使组培过程更加简化。通过筛选各阶段的最佳培养基和培养条件，各阶段的培养基使用不同的组分，整体发挥作用，芽长势良好，初始芽诱导率达93.6～98％，连续培养20～25天的继代丛芽，增殖系数6.5～8.1，经过多代培养增殖系数稳定，15天的生根率达100％，根长2.0～3.0cm，根系数量为5～8条，根系粗壮，移栽成活率达90.5～98.0％，可在短期内获得大量苦木组培苗。
4、本发明的改良MS中增加了钙磷离子含量，可以减少铝毒害对苦木的茎、叶、根生长发育产生的抑制作用，并减弱铝毒害对光合作用的抑制，增加苦木叶片中叶绿素含量的合成，增强光合作用，从而促进苦木芽分化与增殖、苗高生长与生物量积累；改良MS中添加了花宝1号，有使根、茎强壮的作用，同时也能促进根、茎和叶的生长，从而缩短育苗周期和提高苗木质量。
5、本发明的外植体经过15～16h低温冷藏预处理、初代诱导培养先暗培养5～10天、培养温度为23～26℃等处理，均能显著减少外植体的褐变，芽生长活力旺盛，因外植体在低温及黑暗条件下进行短期处理和培养，可有效抑制酚类物质氧化。
附图说明
图1为实施例1中苦木组培茎段诱导出芽图。
图2为实施例1中苦木继代增殖培养瓶苗图。
图3为实施例1中苦木组培生根培养瓶苗瓶底照图。
图4为实施例1中苦木组培生根瓶苗图。
图5为实施例1中苦木苗木移栽成活容器苗图。
图6为对比例1中苦木继代增殖培养瓶苗图。
图7为对比例2中苦木继代增殖培养瓶苗图。
图8为对比例3中苦木继代增殖培养瓶苗图。
图9为对比例4中苦木继代增殖培养瓶苗图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。
以下实施例1-3中，预先配制改良MS，用量如下表：
| NH4NO3 | 700mg/L |
| KNO3 | 1450mg/L |
| CaCl2·2H2O | 440mg/L |
| MgSO4·7H2O | 370mg/L |
| KH2PO4 | 250mg/L |
| FeSO4·7H2O | 27.8mg/L |
| Na2-EDTA | 37.3mg/L |
| MnSO4·4H2O | 22.3mg/L |
| ZnSO4·7H2O | 8.6mg/L |
| CoCl2·6H2O | 0.025mg/L |
| CuSO4·5H2O | 0.025mg/L |
| NaMoO4·2H2O | 0.15mg/L |
| KI | 0.83mg/L |
| H3BO3 | 6.2mg/L |
| 烟酸 | 0.5mg/L |
| 盐酸吡哆醇(VB6) | 0.5mg/L |
| 盐酸硫胺素(VB1) | 0.4mg/L |
| 肌醇 | 100mg/L |
| 甘氨酸 | 2mg/L |
| Ca(NO3)2·4H2O | 460mg/L |
| 花宝1号 | 750mg/L |
实施例1
一种药用苦木组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择：选择健壮、无病虫害、性状优良、含生物碱高的苦木植株进行伐桩或者环割促萌，待枝条萌芽长至1～2cm长时，喷施体积浓度0.5％多菌灵溶液，每7天喷施1次，10～15天后于晴天采集当年生、活力旺盛的萌芽条作为外植体；
(2)外植体灭菌：将外植体剪去叶片和叶柄，保留5cm的萌芽条，清水冲洗表面泥沙，并用软毛毛刷刷洗，清洗干净后，先放入体积浓度为2％的洗洁精中震荡浸泡15min，流水冲洗30min，再放入体积浓度为5％的次氯酸钠溶液消毒30min，无菌水冲洗5次，然后密闭在无菌培养皿中，放在8℃下冷藏16h，然后在超净工作台上，放入体积浓度为75％的酒精溶液中浸泡30s，最后放入体积浓度为0.1％的HgCl2溶液中震荡浸泡12min，无菌水冲洗5次，灭菌结束后，放在灭菌的滤纸上吸干水分；
(3)初代诱导培养：将灭菌后的外植体的两端分别剪掉2mm，并修剪成带2芽的茎段，然后斜插入配制好的初代诱导培养基中培上，每瓶1株，所述初代诱导培养基包括以下组分：改良MS、0.4mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、0.5mg/L KT、4g/L琼脂、30g/L糖，pH为6，暗培养8天，在温度23℃、光照强度2000LX、光照时间11h/d下继续培养8天，获取初始芽，诱导率98.0％；苦木组培茎段诱导出芽图如图1所示；
(4)继代增殖培养：待初始芽高为3～6cm，在超净台上将老叶剪掉，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1～2cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中，每瓶8株，连续培养20天，获取继代丛芽，增殖系数为8.1；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部的愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2～3个芽的小丛芽接种在继代增殖培养基中培养，每瓶5株/丛，继代增殖培养基包括以下组分：改良MS、0.2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、0.5mg/L IAA、0.8mg/LKT、4g/L琼脂、30g/L糖，0.015mg/L核黄素、0.01mg/L抗坏血酸，pH为6；培养控制条件为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000Lx，光照时间12～16h/d；苦木继代增殖培养瓶苗图如图2所示；
(5)生根培养：从继代丛芽中选取生长健壮、芽高≥1cm的单芽，在无菌条件下垂直插入配制好的生根培养基中，进行生根培养，每瓶插10株，生根培养基包括以下组分：1/2改良MS、0.5mg/L IBA、0.8mg/L IAA、0.05g/L活性炭、4.0g/L琼脂、15g/L糖，pH＝5.8～6.2；培养条件控制为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000Lx，光照时间12～16h/d，8天开始长根，15天生根率100％，根长2～3cm，根系数量10条；苦木组培生根培养瓶苗瓶底照图如图3所示，苦木组培生根瓶苗图如图4所示；
(6)炼苗移栽：待组培生根苗的根系长度≥1cm、根数3条以上时，将生长健壮的组培生根苗移到室外育苗大棚中进行炼苗5天，之后用清水洗掉根部培养基，移栽入已消毒好的基质育苗容器中；移栽前一天，用体积浓度为0.5％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去药液；苗木置于带遮阴网的苗圃内，每天早晚各喷淋水一次；移栽后一周内，透光度保持在50％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至80％；7天后，用浓度为0.5％的复合肥(15-15-15)水溶液喷淋，每10天喷淋1次，移栽成活率98.0％；苦木苗木移栽成活容器苗图如图5所示。
实施例2
一种药用苦木组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择：选择健壮、无病虫害、性状优良、含生物碱高的苦木植株进行伐桩或者环割促萌，待枝条萌芽长至1～2cm长时，喷施体积浓度0.5％多菌灵溶液，每7天喷施1次，10～15天后于晴天采集当年生、活力旺盛的萌芽条作为外植体；
(2)外植体灭菌：将外植体剪去叶片和叶柄，保留6cm的萌芽条，清水冲洗表面泥沙，并用软毛毛刷刷洗，清洗干净后，先放入体积浓度为3％的洗洁精中震荡浸泡15min，流水冲洗30min，再放入体积浓度为4％的次氯酸钠溶液消毒30min，无菌水冲洗5次，然后密闭在无菌培养皿中，放在7℃下冷藏16h，然后在超净工作台上，放入体积浓度为70％的酒精溶液中浸泡30s，最后放入体积浓度为0.1％的HgCl2溶液中震荡浸泡10min，无菌水冲洗5次，灭菌结束后，放在灭菌的滤纸上吸干水分；
(3)初代诱导培养：将灭菌后的外植体的两端分别剪掉2mm，并修剪成带2芽的茎段，然后斜插入配制好的初代诱导培养基中培上，每瓶1株，所述初代诱导培养基包括以下组分：改良MS、0.3mg/L 6-BA、0.4mg/L NAA、0.4mg/L KT、3.5g/L琼脂、28g/L糖，pH为6，暗培养5天，在温度24℃、光照强度1500LX、光照时间10h/d下继续培养10天，获取初始芽，诱导率95.3％；
(4)继代增殖培养：待初始芽高为3～6cm，在超净台上将老叶剪掉，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1～2cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中，每瓶5株，连续培养22天，获取继代丛芽，增殖系数为7.6；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部的愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2～3个芽的小丛芽接种在继代增殖培养基中培养，每瓶8株/丛，继代增殖培养基包括以下组分：改良MS、0.1mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、0.4mg/L IAA、0.7mg/LKT、4g/L琼脂、28g/L糖、0.015mg/L核黄素、0.01mg/L抗坏血酸，pH为5.8，培养控制条件为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000Lx，光照时间12～16h/d；
(5)生根培养：从继代丛芽中选取生长健壮、芽高≥1cm的单芽，在无菌条件下垂直插入配制好的生根培养基中，进行生根培养，每瓶插12株，生根培养基包括以下组分：1/2改良MS、0.4mg/L IBA、0.7mg/L IAA、0.04g/L活性炭、3.5g/L琼脂、15g/L糖，pH＝5.8，培养条件控制为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000Lx，光照时间12～16h/d，12天开始长根，15天生根率93.3％，根长1～2cm，根系数量5条；
(6)炼苗移栽：待组培生根苗的根系长度≥1cm、根数3条以上时，将生长健壮的组培生根苗移到室外育苗大棚中进行炼苗7天，之后用清水洗掉根部培养基，移栽入已消毒好的基质育苗容器中；移栽前一天，用体积浓度为0.5％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去药液；苗木置于带遮阴网的苗圃内，每天早晚各喷淋水一次；移栽后一周内，透光度保持在40％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至85％；7天后，用浓度为0.5％的复合肥(15-15-15)水溶液喷淋，每10天喷淋1次，移栽成活率90.5％。
实施例3
一种药用苦木组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择：选择健壮、无病虫害、性状优良、含生物碱高的苦木植株进行伐桩或者环割促萌，待枝条萌芽长至1～2cm长时，喷施体积浓度0.5％多菌灵溶液，每7天喷施1次，10～15天后于晴天采集当年生、活力旺盛的萌芽条作为外植体；
(2)外植体灭菌：将外植体剪去叶片和叶柄，保留5.5cm的萌芽条，清水冲洗表面泥沙，并用软毛毛刷刷洗，清洗干净后，先放入体积浓度为2.5％的洗洁精中震荡浸泡15min，流水冲洗30min，再放入体积浓度为6％的次氯酸钠溶液消毒30min，无菌水冲洗5次，然后密闭在无菌培养皿中，放在9℃下冷藏16h，然后在超净工作台上，放入体积浓度为75％的酒精溶液中浸泡30s，最后放入体积浓度为0.1％的HgCl2溶液中震荡浸泡8min，无菌水冲洗5次，灭菌结束后，放在灭菌的滤纸上吸干水分；
(3)初代诱导培养：将灭菌后的外植体的两端分别剪掉2mm，并修剪成带2芽的茎段，然后斜插入配制好的初代诱导培养基中培上，每瓶1株，所述初代诱导培养基包括以下组分：改良MS、0.5mg/L 6-BA、0.6mg/L NAA、0.6mg/L KT、5g/L琼脂、32g/L糖，pH为6.2，暗培养10天，在温度26℃、光照强度2000LX、光照时间11h/d下继续培养10天，获取初始芽，诱导率93.6％；
(4)继代增殖培养：待初始芽高为3～6cm，在超净台上将老叶剪掉，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1～2cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中，每瓶8株，连续培养25天，获取继代丛芽，增殖系数为6.5；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部的愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2～3个芽的小丛芽接种在继代增殖培养基中培养，每瓶8株/丛，继代增殖培养基包括以下组分：改良MS、0.3mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、0.6mg/L IAA、0.9mg/LKT、5g/L琼脂、32g/L糖，0.015mg/L核黄素、0.01mg/L抗坏血酸，pH为6.2。培养控制条件为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000Lx，光照时间12～16h/d；
(5)生根培养：从继代丛芽中选取生长健壮、芽高≥1cm的单芽，在无菌条件下垂直插入配制好的生根培养基中，进行生根培养，每瓶插15株，生根培养基包括以下组分：1/2改良MS、0.6mg/L IBA、0.9mg/L IAA、0.06g/L活性炭、5g/L琼脂、15g/L糖，pH＝6.2，培养条件控制为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000Lx，光照时间12～16h/d，10天开始长根，15天生根率95.4％，根长1～2.5cm，根系数量6条；
(6)炼苗移栽：待组培生根苗的根系长度≥1cm、根数3条以上时，将生长健壮的组培生根苗移到室外育苗大棚中进行炼苗10天，之后用清水洗掉根部培养基，移栽入已消毒好的基质育苗容器中；移栽前一天，用体积浓度为0.5％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去药液；苗木置于带遮阴网的苗圃内，每天早晚各喷淋水一次；移栽后一周内，透光度保持在50％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至90％；7天后，用浓度为0.5％的复合肥(15-15-15)水溶液喷淋，每10天喷淋1次，移栽成活率93.6％。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中含有的改良MS中均缺少花宝1号(750mg/L)，其余的培养过程和条件均与实施例1的相同。苦木继代增殖培养瓶苗图如图6所示。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中含有的改良MS中均缺少Ca(NO3)2·4H2O(460mg/L)，其余的培养过程和条件均与实施例1的相同。苦木继代增殖培养瓶苗图如图7所示。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，对比例3的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中含有的改良MS中KH2PO4的量为170mg/L，其余的培养过程和条件均与实施例1的相同。苦木继代增殖培养瓶苗图如图8所示。
对比例4
对比例4与实施例1的区别在于，对比例4的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基采用的是“公开号CN 107593459 A、发明名称为一种苦木组培快繁的技术”的技术方案中公开的培养基，其余培养过程和条件均与实施例1的相同。苦木继代增殖培养瓶苗图如图9所示。
分别采用本发明实施例1-3及对比例1-4的组培方法对苦木进行培养，将培养过程中得到的数据进行对比。数据统计：初始芽诱导率＝(诱导出初始芽的外植体数/接种外植体总数)×100％；增殖系数＝芽生长到可供切割成高度0.5-1cm的芽数/接种时单芽总数；生根率＝(生根芽数/接种总芽数)×100％；组培瓶苗出苗周期＝继代增殖周期+生根时间。
统计实施例1-3及对比例1—4中苦木的芽诱导率、增殖系数、继代增殖周期、生根时间、生根率、移栽成活率、组培瓶苗出苗周期，统计结果如下表1所示：
表1各组培方法的育苗效果对比
由上表统计的数据可知，实施例1为最优实施例，培养效果如图1-图5所示。实施例2和实施例3的培养基配方对激素含量进行了调整。分别与实施例2和实施例3相比，实施例1中的芽诱导率分别提高2.7％和4.4％，增殖系数分别提高0.5和1.6，生根时间分别减少4天和2天，生根率分别提高6.7％和4.6％，移栽成活率分别提高7.5％和4.4％，组培瓶苗出苗周期分别减少6天和7天，根系数量均较少，说明激素对苗木生长的影响存在一定的阈值，过低或过高浓度的激素对芽的诱导、增殖、生根时间、生根率等都会产生抑制作用，不利于苗木的生长。本发明通过大量试验筛选出组培苗不同生长阶段最优激素组合，使苗木生长健壮，质量较优。
在与实施例1的其他培养条件相同的基础上，对比例1的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中含有的改良MS中均缺少花宝1号(750mg/L)。与对比例1相比，实施例1的初始芽诱导率提高8.9％、增殖系数提高2.3、继代增殖周期减少10天、生根时间减少14天、生根率提高16.2％、移栽成活率提高18.3％、组培瓶苗出苗周期减少24天。
在与实施例1的其他培养条件相同的基础上，对比例2的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中含有的改良MS中均缺少Ca(NO3)2·4H2O(460mg/L)。与对比例2相比，实施例1的初始芽诱导率提高14.9％、增殖系数提高2.9、继代增殖周期减少8天、生根时间减少10天、生根率提高12.8％、移栽成活率提高16.0％、组培瓶苗出苗周期减少18天。
在与实施例1的其他培养条件相同的基础上，对比例3的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中含有的改良MS中KH2PO4的量为170mg/L。与对比例3相比，实施例1的初始芽诱导率提高12.6％、增殖系数提高3.6、继代增殖周期减少8天、生根时间减少12天、生根率提高11.3％、移栽成活率提高13.8％、组培瓶苗出苗周期减少20天。
在与实施例1的其他培养条件相同的基础上，对比例4的初代诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基采用的是“公开号CN 107593459 A、发明名称为一种苦木组培快繁的技术”的技术方案中公开的培养基。与对比例4相比，实施例1的初始芽诱导率提高26.4％、增殖系数提高4.1、继代增殖周期减少30天、生根时间减少18天、生根率提高19.9％、移栽成活率提高24.1％、组培瓶苗出苗周期减少48天。
与对比例1、对比例2、对比例3和对比例4相比，实施例1中在初始芽诱导率、增殖系数、继代增殖周期、生根时间、生根率、移栽成活率、组培瓶苗出苗周期等效果方面均有所提高，差异最显著的是增殖系数和增殖芽的长势，效果图为(如实施例1的图2、对比例1的图6、对比例2的图7、对比例3的图8、对比例4的图9)。
本发明实施例1为最优实施例，获得的继代丛芽出芽数较多，芽株健壮，长势较好(图2)；组培生根苗根系多且健壮(图3、图4)；组培苗移栽后成活率98％，且长势较好(图5)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种药用苦木组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体选择：选择健壮、无病虫害、性状优良、含生物碱高的苦木植株进行伐桩或者环割促萌，待枝条萌芽长至1～2 cm长时，喷施体积浓度0.3～0.5%多菌灵溶液，10～15天后于晴天采集当年生、活力旺盛的萌芽条作为外植体；
（2）外植体灭菌：将外植体剪去叶片和叶柄，保留5～6 cm的萌芽条，将外植体表面清洗干净后，进行灭菌处理，灭菌结束后，吸干水分，备用；
（3）初代诱导培养：将灭菌后的外植体剪去茎段芽两端及创伤面，修剪成带1～2个的茎节或腋芽的茎段，以斜插式接种于初代诱导培养基上，每瓶1株，先暗培养5～10天，再在温度为23～26℃、光照强度为1500～2500 LX、光照时间为10～12 h/d下继续培养5～10天，获取初始芽；所述初代诱导培养基为：改良MS、0.3～0.5 mg/L 6-BA、0.4～0.6 mg/L NAA、0.4～0.6 mg/L KT、3～5 g/L琼脂、28～32 g/L糖，pH为5.8～6.2；
（4）继代增殖培养：待初始芽高为3～6 cm，剪掉老叶片，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1～2 cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中，每瓶5～8株，连续培养20～25天，获取继代丛芽；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部的愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2～3个芽的小丛芽接种在继代增殖培养基中培养，每瓶5～8株/丛；所述继代增殖培养基为：改良MS、0.1～0.3 mg/L 6-BA、0.1～0.3 mg/L NAA、0.4～0.6 mg/L IAA、0.7～0.9 mg/L KT、3～5 g/L琼脂、28～32 g/L糖、0.01～0.02 mg/L核黄素、0.005～0.02 mg/L抗坏血酸，pH为5.8～6.2；
（5）生根培养：从继代丛芽中选取生长健壮、芽高≥1 cm的单芽，在无菌条件下垂直插入配制好的生根培养基中，进行生根培养，每瓶插10～15株，培养15～20天，获取生长健壮的组培生根苗；所述生根培养基为：1/2改良MS、0.4～0.6 mg/L IBA、0.7～0.9 mg/L IAA、0.04～0.06 g/L 活性炭、3～5 g/L琼脂、14～16 g/L糖，pH为5.8～6.2；
（6）炼苗移栽：待组培生根苗的根系长度≥1 cm、根数3条以上时，将生长健壮的组培生根苗移到室外育苗大棚中进行炼苗5～10天，之后用清水洗掉根部培养基，移栽入已消毒好的基质育苗容器中，并进行苗木管理；
所述改良MS为：680～720 mg/L NH4NO3、1400～1500 mg/L KNO3、430～450 mg/LCaCl2·2H2O、360～380 mg/L MgSO4·7H2O、26～28 mg/L FeSO4·7H2O、36～38 mg/L Na2-EDTA、21～23 mg/L MnSO4·4H2O、7～9 mg/L ZnSO4·7H2O、0.02～0.03 mg/L CoCl2·6H2O、0.02～0.03 mg/L CuSO4·5H2O、0.1～0.2 mg/L NaMoO4·2H2O、0.7～0.9 mg/L KI、5～7mg/L H3BO3、0.4～0.6 mg/L烟酸、0.4～0.6 mg/L盐酸吡哆醇、0.3～0.5 mg/L盐酸硫胺素、90～110 mg/L肌醇、1～3 mg/L甘氨酸、240～250 mg/L KH2PO4、450～470 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、740～760 mg/L花宝一号。
2.根据权利要求1所述的药用苦木组培快繁方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（5）中，所述培养的控制条件均为：温度为25±3℃，光照强度2500～9000 Lx，光照时间12～16 h/d。
3.根据权利要求1所述的药用苦木组培快繁方法，其特征在于，步骤（2）中，所述灭菌处理具体步骤为：将外植体表面清洗干净后，先放入体积浓度为2～3%的洗洁精中震荡浸泡10～15 min，再放入体积浓度为4～6%的次氯酸钠溶液消毒25～30 min，无菌水冲洗3～5次，然后密闭在无菌培养皿中，放在7～9℃下冷藏15～16 h，然后在超净工作台上，放入体积浓度为70～75%的酒精溶液中浸泡10～30 s，最后放入体积浓度为0.1～0.2% 的HgCl2溶液中震荡浸泡8～12 min。
4.根据权利要求1所述的药用苦木组培快繁方法，其特征在于，步骤（6）中，所述育苗基质由黄泥、蛭石、泥炭土按照体积比1:1～2:3混合组成。
5.根据权利要求1所述的药用苦木组培快繁方法，其特征在于，步骤（6）中，所述苗木管理的方法为：将苗木置于带遮阴网的苗圃内，每天早晚各喷淋水1～2次；7天后，用浓度为0.3～0.5%的复合肥水溶液喷淋，每10天喷淋1～2次；移栽后一周内，透光度保持在40～50％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至80～90％。
6.根据权利要求1所述的药用苦木组培快繁方法，其特征在于，步骤（6）中，所述育苗容器为直径7～9 cm、高9～12 cm的无纺布袋。
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