CN116218861B - 一种胡子鲇actb2基因及其引物和应用 - Google Patents

一种胡子鲇actb2基因及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胡子鲇actb2基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了用于扩增所述胡子鲇actb2基因的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。还进一步公开了上述胡子鲇actb2基因作为胡子鲇内参基因的应用以及所述actb2基因或引物在胡子鲇性别分化与发育调控相关基因筛选或研究中的应用。本发明利用分析软件对actb2基因的稳定性进行评价，actb2基因在胡子鲇成鱼不同组织和雌雄性腺不同发育时期中最稳定。本发明所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，具有很高的稳定性、可靠性和重复性，为胡子鲇性别分化与发育调控相关功能基因的精确定量提供有力支持。

Description

一种胡子鲇actb2基因及其引物和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种胡子鲇actb2基因及其引物和应用。
背景技术
胡子鲇(Clarias fuscus)又称塘虱鱼，属鲇形目(Siluriformes)、胡子鲇科(Clariidae)、胡子鲇属(Clarias)，其适应性强，营养价值高，肉质细嫩。胡子鲇具有明显的性别生长二态性，同等养殖条件下，雄鱼生长速度显著快于同龄雌鱼，且雌鱼上市时性腺指数过高问题突出。研究胡子鲇性别分化与发育的分子调控机制，具有重要的理论价值和现实意义。
理想的内参基因应该是在不同组织、不同生长阶段及不同环境条件下保持表达水平恒定。然而，目前尚未成功报道适用于所有不同条件的内参基因。因此，根据实验条件和实验材料筛选合适的内参基因，已成为应用实时荧光定量PCR进行基因功能分析的重要前提。
鉴于胡子鲇不同组织、性腺不同发育时期的内参基因尚未报道，为进一步研究胡子鲇性别分化与发育相关功能基因的表达调控，有必要对该物种性别调控研究的内参基因进行筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胡子鲇actb2基因。
本发明的目的还在于提供用于扩增上述胡子鲇actb2基因的引物。
本发明的最后一个目的在于提供上述胡子鲇actb2基因作为胡子鲇内参基因的应用以及上述引物在分析胡子鲇成鱼不同组织和胡子鲇雌雄性腺不同发育时期表达模式的实时荧光定量PCR实验中的应用等。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种胡子鲇actb2基因，所述胡子鲇actb2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明通过从胡子鲇转录组数据获得胡子鲇actb2基因，利用BestKeeper、GeNorm和NormFinder等分析软件对该基因的稳定性进行评价，表明该基因适用于胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织基因表达研究，并用该基因为基础设计了实时荧光定量PCR引物，为后续胡子鲇成鱼不同组织和不同时期的雌雄性腺相关功能基因的精确定量及功能研究奠定基础。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：用于扩增上述胡子鲇actb2基因的引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的碱基序列如SEQ IDNO：2所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
该胡子鲇actb2基因是在分析胡子鲇转录组数据基础上，以胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织的cDNA为模板，以所述胡子鲇actb2基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier 6.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；
具体引物序列为：
正向引物5'-AGGCTGGATTCGCTGGAGATGAT-3'(如SEQ ID NO：2所示)；
反向引物5'-TGGTGACAATACCGTGCTCAATGG-3'(如SEQ ID NO：3所示)。
本发明利用所述实时荧光定量PCR引物，采用BestKeeper、GeNorm和NormFinder分析软件对胡子鲇actb2基因的稳定性进行评价，表明胡子鲇actb2基因在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织中最稳定，可以作为研究胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织相关基因表达的内参基因。
本发明所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，具有很高的稳定性、可靠性和重复性，为胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织相关功能基因的精确定量提供有力支持，提高了研究的稳定性、重复性和可靠性。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述胡子鲇actb2基因作为胡子鲇内参基因的应用。
所述应用包括：所述胡子鲇actb2基因在胡子鲇成鱼不同组织中以及在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期表达稳定。
本发明还提供了所述引物在分析胡子鲇成鱼不同组织和胡子鲇雌雄性腺不同发育时期表达模式的实时荧光定量PCR实验中的应用。
本发明还进一步提供了所述胡子鲇actb2基因在胡子鲇成鱼不同组织和雌性性腺不同发育时期相关基因筛选或研究中的应用；以及所述引物在胡子鲇性别分化与发育调控相关基因筛选或研究中的应用。
本发明具有以下优点：
(1)本发明利用分析软件对actb2基因的稳定性进行评价，本发明提供的胡子鲇actb2基因在胡子鲇成鱼不同组织和雌雄性腺不同发育时期中最稳定，可以作为内参基因使用，为该物种性别分化和发育调控相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据，还可进一步在胡子鲇成鱼不同组织和雌雄性腺不同发育时期相关基因筛选或研究中的应用；
(2)本发明所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，扩增效率高，具有很高的稳定性、可靠性和重复性，可以应用在胡子鲇成鱼不同组织和胡子鲇雌雄性腺不同发育时期表达模式的实时荧光定量PCR实验的分析中，为胡子鲇性别分化与发育调控相关功能基因的精确定量提供有力支持。
(3)本发明胡子鲇actb2基因填补了胡子鲇性别分化与发育调控机制研究中没有合适内参基因的现状。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中实施例1主要组织(脑、肌肉、皮肤、性腺、肝脏、脾脏、肾脏、肠、心脏、胃和鳃)的cDNA模板混合样的1％琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本发明中实施例1主要组织(脑、肌肉、皮肤、性腺、肝脏、脾脏、肾脏、肠、心脏、胃和鳃)混合样的溶解曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。除非特别说明，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。
实施例1胡子鲇actb2基因获得，引物设计和特异性检测
(1)提取胡子鲇肌肉组织DNA组织，通过三代测序技术获取胡子鲇性腺转录组数据并对基因进行功能注释，从注释基因序列中获得胡子鲇actb2基因核苷酸序列，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则，采用Primer Premier 6.0设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为180bp(胡子鲇actb2基因核苷酸序列划线部分)，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物。
其中：
正向引物5'-AGGCTGGATTCGCTGGAGATGAT-3'(如SEQ ID NO：2所示)；
反向引物5'-TGGTGACAATACCGTGCTCAATGG-3'(如SEQ ID NO：3所示)。胡子鲇actb2基因核苷酸序列如下(如SEQ ID NO：1所示)：ATGCAAAAAGAACAATACGTTTTCACTTTATCATGCAGCGATATTAAACTAAAAGGAATTATTTTATTTTCAGCCATGGATGATGAAATCGCCGCACTGGTTGTTGACAACGGATCCGGTATGTGCAAGGCTGGATTCGCTGGAGATGATGCTCCCCGTGCTGTCTTCCCATCCATTGTGGGTCGCCCAA GACACCAGGGTGTGATGGTTGGTATGGGACAGAAGGACAGCTATGTTGGTGATGAGGCTCAGAGCAAAAGAGGTAT CCTGACCCTGAAGTACCCCATTGAGCACGGTATTGTCACCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCATCATACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTTGCCCCTGAGGAGCACCCTGTCCTGCTTACCGAGGCTCCCCTGAACCCCAAAGCCAACAGGGAAAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTTGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGGTCGTACCACTGGTATTGTGATGGACTCCGGTGATGGTGTGACCCACACTGTGCCCATCTATGAAGGTTATGCCCTGCCCCATGCCATCCTCCGTCTGGACCTGGCTGGCCGTGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTGACCGAGAGAGGCTACAGCTTCACCACCACAGCCGAGAGAGAAATTGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTCTGCTACGTCGCTCTTGACTTCGAGCAGGAGATGGGCACCGCCGCCTCTTCCTCCTCTCTGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCCGACGGACAGGTCATCACCATTGGCAATGAGAGGTTCAGGTGCCCTGAGGCTCTCTTCCAGCCATCTTTCCTGGGTATGGAGTCCTGTGGAATCCACGAGACCACCTTCAACTCCATCATGAAGTGCGATGTGGATATCCGTAAGGATCTGTATGCCAACACTGTACTGTCTGGTGGTACCACCATGTACCCTGGCATTGCAGACAGGATGCAGAAGGAGATCACATCCCTGGCCCCCAGCACAATGAAAATCAAGATCATTGCCCCACCTGAGCGTAAATACTCTGTCTGGATTGGAGGTTCCATCCTGGCCTCCCTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGATGAGTCTGGGCCCTCCATCGTCCACCGCAAATGCTTCTAA 1203。
(2)总RNA提取和cDNA的合成：参照TRIZOL试剂说明书提取胡子鲇成鱼不同组织(脑、肌肉、精巢、卵巢、皮肤、肝脏、脾脏、肾脏、肠、心脏、胃、鳃)总RNA。使用Thermo NanoDrop2000C(Thermo Scientific)测定总RNA浓度和纯度，选择在260/280nm处的吸光度比为1.8-2.0左右的RNA样品。通过1％琼脂糖凝胶电泳评估总RNA完整性。依据耐高温全预混第一链cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)使用说明合成cDNA，等量混合所有组织cDNA模板-20℃冰箱保存备用。
(3)PCR扩增：以经步骤(2)处理所得的cDNA为模板，并以步骤(1)中获得的引物对进行常规PCR扩增反应，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：
PCR反应体系：反应总体积为10μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)5μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、模板cDNA1μL、和ddH20 3μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃下延伸10min；于4℃下保存。
所得PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示；由图1可知，PCR扩增得到一条单一条带，没有发现引物二聚体和非特异性扩增(图1)，经测序大小为180bp，符合预期大小，表明该引物特异性较好、可信度高，可用于qRT-PCR分析。
(4)qRT-PCR检测：以经步骤(2)处理所得的cDNA为模板，并以步骤(1)中获得的引物进行qRT-PCR扩增反应。利用LightCycler480_实时定量PCR仪，按照染料法荧光定量预混试剂盒进行PCR扩增，PCR反应的反应体系与反应程序如下：
PCR反应体系为：Green qPCR SuperMix 5μL、Nuclease-freeWater 3μL、cDNA模板1μL、正、反向引物各0.5μL，总体积为10μL。
PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，45个循环；延伸阶段收集信号，从65℃到95℃，采集熔解曲线荧光信号。
反应的结果如图2所示，其中Rn指荧光强度，从图2可以看出，该胡子鲇actb2基因表现出单峰熔解曲线，说明引物具有很高的特异性，并且扩增曲线重复性好，说明qRT-PCR结果准确可靠，可以用于表达稳定性分析。
实施例2胡子鲇actb2基因在成鱼不同组织中的表达稳定性分析
选择胡子鲇成鱼4尾，经MS-222麻醉后，剖取脑、肌肉、皮肤、性腺、肝脏、脾脏、肾脏、肠、心脏、胃和鳃组织，于液氮中速冻后于-80℃下保存。提取样品组织RNA，并按照耐高温全预混第一链cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)使用说明合成cDNA，-20℃冰箱保存备用。
以合成的样品cDNA为模板，以13个候选内参基因actb1、actb2、ef1a、rpl13a、rpl13、eef1b2、ccdc124、cfl1、nm23、eif3g、rap1a、ikbkg和ywhab，从胡子鲇性腺转录组注释基因中获取序列后遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计而成的荧光定量引物对(表1)进行qRT-PCR扩增反应。
表1内参基因及其引物序列
qRT-PCR扩增体系与扩增程序如下：
PCR扩增体系为：Green qPCR SuperMix 5μL、Nuclease-freeWater 3μL、cDNA模板1μL、正、反向引物各0.5μL，总体积为10μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，45个循环；最后4℃保存。
利用BestKeeper、GeNorm、NormFinder和RefFinder等软件对13个候选内参基因的稳定性进行评估。GeNorm软件通过计算每个内参基因的稳定值(M)来筛选出稳定性较好的内参基因，当M<1.5时，被认为可以作为内参基因，M值越小，稳定性越高。NormFinder软件通过计算待选内参基因的稳定值(SV)，将SV值最小的基因作为最稳定基因。BestKeeper软件通过计算Ct值的标准偏差(SD)来筛选最稳定的内参基因，其中SD值越小，稳定性越好；反之，稳定性越差。RefFinder软件能够整合上述3种分析方法，对各基因单独使用3种分析方法评价时的排名计算几何平均值，得出综合排名情况，以筛选出稳定性较好的内参基因。
GeNorm分析结果表明，在成鱼各组织(脑、肌肉、皮肤、性腺、肝脏、脾脏、肾脏、肠、心脏、胃和鳃)中，actb2和rpl13的稳定性最好，cfl1的稳定性最差(表2)；Normfinder分析结果表明，在成鱼各组织中，表达最为稳定的内参基因是actb2，表达最不稳定的是eef1b2(表3)；Bestkeeper分析结果表明，在成鱼各组织中，表达最为稳定的候选内参基因是actb1，最不稳定的内参基因是ikbkg(表4)；整合上述3种分析方法，得出13个内参基因成鱼组织中表达的稳定性排名为：
actb2>rpl13>cfl1>rap1a>ef1a>rpl13a>ikbkg>eif3g>nm23>actb1>eef1b2>ywhab>ccdc124(表5)。因此，确定actb2是成鱼组织中最稳定的内参基因。
实施例3内参基因actb2在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期表达稳定性分析
选择胡子鲇成鱼4尾，经MS-222麻醉后，剖取脑、肌肉、皮肤、性腺、肝脏、脾脏、肾脏、肠、心脏、胃和鳃组织，于液氮中速冻后于-80℃下保存。提取样品组织RNA，并按照耐高温全预混第一链cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)使用说明合成cDNA，-20℃冰箱保存备用。
以合成的样品cDNA为模板，以13个候选内参基因actb1、actb2、ef1a、rpl13a、rpl13、eef1b2、ccdc124、cfl1、nm23、eif3g、rap1a、ikbkg和ywhab，从胡子鲇性腺转录组注释基因中获取序列后遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计而成)的荧光定量引物对(表1)进行qRT-PCR扩增反应，扩增体系与扩增程序如下：PCR扩增体系为：Green qPCR SuperMix 5μL、Nuclease-free Water 3μL、cDNA模板1μL、正反向引物各0.5μL，总体积为10μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，45个循环；最后4℃保存。
利用BestKeeper、GeNorm、NormFinder和RefFinder等软件对13个候选内参基因的稳定性进行评估。
GeNorm分析结果表明，胡子鲇雌雄性腺不同发育时期中，rpl13和actb1的稳定性最好，ikbkg的稳定性最差(表2)；Normfinder分析结果表明，在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期中，表达最为稳定的内参基因是actb2和actb1，表达最不稳定的是eef1b2(表3)；Bestkeeper分析结果表明，在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期中，表达最为稳定的候选内参基因是actb2，最不稳定的内参基因是nm23(表4)；整合上述3种分析方法，得出13个内参基因在雌雄性腺不同发育时期中表达的稳定性排名为：actb2>rpl13>actb1>cfl1>rap1a>ef1a>rpl13a>ikbkg>eif3g>nm23>eef1b2>ywhab>ccdc124(表5)，因此，确定actb2是胡子鲇雌雄性腺不同发育时期中最稳定的内参基因。
表2GeNorm软件分析13个候选内参基因在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织表达稳定性
表3NormFinder软件分析13个候选内参基因在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织的表达稳定性
表4
BestKeeper软件分析13个候选内参基因在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织的表达稳定性
表5 13个候选内参基因在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成鱼不同组织的表达稳定性的综合评价。
综上，本发明提供了一种适用于胡子鲇成鱼不同组织和雌雄性腺不同发育时期的基因表达研究的内参基因actb2及其实时荧光定量PCR引物。本发明的内参基因可在胡子鲇雌雄性腺不同发育时期及成年不同组织中稳定表达，所设计的实时荧光定量PCR引物用于胡子鲇相关目的基因定量表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

Claims (3)

1.一种胡子鲇actb2基因，其特征是：所述胡子鲇actb2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
2.权利要求1所述胡子鲇actb2基因作为胡子鲇内参基因的应用。
3.权利要求1所述胡子鲇actb2基因作为内参基因在胡子鲇成鱼不同组织和雌雄性腺不同发育时期相关基因筛选或研究中的应用。
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