CN116106452A - 一种甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法、通过该方法构建的特征图谱及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法、通过该方法构建的特征图谱及其应用。该特征图谱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％V/V磷酸溶液为流动相B，按梯度洗脱程序洗脱，检测波长为325nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。特征图谱中呈现7个特征峰，与绿原酸对应的色谱峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间分别为：0.53(峰1)、1.17(峰3)、2.91(峰4)、3.06(峰5)；与槲皮苷对应的色谱峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间为：0.99(峰6)；以上相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。本方法建立了甜叶菊配方颗粒的特征图谱，专属性强，能够进行多成分质量的控制，对该品种进行全面的质量评价。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法、通过该方法构建的特征图谱及该特征图谱的应用。
背景技术
甜叶菊基源为菊科植物甜叶菊Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl.的干燥叶。春夏秋季采收成熟果实，除去茎枝，摘取叶片，干燥。具有生津止渴、养阴潜阳的功效，常用于消渴、头晕。
中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，经中医临床配方后，供患者即冲即服的颗粒，是一种统一规格、统一剂量、统一质量标准的新型配方用药。中药配方颗粒为中药饮片的延伸形式，失去了饮片所特有的性状及显微特性。
目前，关于甜叶菊配方颗粒缺乏相对应的质量检测方法，公开的关于甜叶菊药材和饮片的检测方法中，均是单独对绿原酸或糖苷类的含量检测。单一成分的含量检测，专属性不强，不仅不能从整体上检测或控制其质量，而且多法并行检测，会耗费更多的资源和时间，增加检测成本和应用难度。
因此，需要建立一种全面的、多成分、能够整体质量评价的甜叶菊质量控制检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，提供一种甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法、通过该方法构建的特征图谱及其应用，建立了甜叶菊配方颗粒的特征图谱，以便进行全面的质量评价，该方法加专属性强，能够进行多成分质量的控制。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)制备甜叶菊对照药材参照物溶液、甜叶菊配方颗粒供试品溶液和指标性成分的对照品溶液；
2)将步骤1)中制备的对照药材参照物溶液、供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪进行色谱分析，得到相应的液相色谱图；
3)以步骤2)中得到对照品溶液的液相色谱图作为对照，同时参照药材参照物溶液的液相色谱图，从步骤2)中得到的供试品溶液的液相色谱图中选择共有峰，构建甜叶菊配方颗粒特征图谱。
优选的，所述甜叶菊对照药材参照物溶液的制备方法为：取甜叶菊对照药材1g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。
优选的，所述对照品溶液的制备方法为：取绿原酸对照品、新绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、槲皮苷对照品，精密称定，加50％甲醇分别制成每1ml含0.1mg、0.1mg、0.1mg、0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
优选的，所述供试品溶液的制备方法为：将甜叶菊配方颗粒研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
优选的，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％V/V磷酸溶液为流动相B，按梯度洗脱程序洗脱，检测波长为325nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。
优选的，梯度洗脱程序为：
0→18min，流动相A的体积百分比为80％→77％，流动相B的体积百分比为20％→23％；
18→18.01min，流动相A的体积百分比为77％→68％，流动相B的体积百分比为23％→32％；
18.01→45min，流动相A的体积百分比为68％→65％，流动相B的体积百分比为32％→35％；
45→45.01min，流动相A的体积百分比为65％→55％，流动相B的体积百分比为35％→45％；
45.01→60min，流动相A的体积百分比为55％，流动相B的体积百分比为45％。
第二方面，本发明提供了一种甜叶菊配方颗粒特征图谱，其通过上述构建方法而获得。
优选的，所述特征图谱中呈现7个特征峰，与绿原酸对应的色谱峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间分别为：0.53(峰1)、1.17(峰3)、2.91(峰4)、3.06(峰5)；与槲皮苷对应的色谱峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间为：0.99(峰6)；以上相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。
第三方面，本发明提供了上述甜叶菊配方颗粒特征图谱在甜叶菊配方颗粒的检测中的应用，通过待测甜叶菊配方颗粒的液相色谱图与上述甜叶菊配方颗粒特征图谱进行对比，可以实现准确、快速的质量检测。
本发明的有益效果是：
1、本发明所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法、通过该方法构建的特征图谱，获了的甜叶菊配方颗粒特征图谱，确认了绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、槲皮苷4个特征峰，并选择绿原酸峰和槲皮苷峰作为特征图谱的参考峰，确定了甜叶菊配方颗粒各特征峰的相对保留时间，能够进行多成分质量的控制，进行全面的质量评价。
2、甜叶菊配方颗粒为甜叶菊中药饮片的延伸形式，失去了甜叶菊饮片所特有的性状及显微特性，本发明提供的甜叶菊配方颗粒特征图谱应用检测方法，能够对甜叶菊配方颗粒整体的化学成分进行鉴别，专属性强。
附图说明
图1为对照品、对照药材与供试品特征图谱对比；
图2为15批甜叶菊配方颗粒特征图谱；
图3为甜叶菊配方颗粒对照特征图谱。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面通过实施方式对本发明创造作进一步的详细说明。
仪器与试药
仪器：高效液相色谱仪(赛默飞Ultimate3000)、超声波清洗机(DL-480E，上海之信)、电子天平(BT125D、AE200，塞多利斯)、医用离心机(YDZ5-WS，湖南湘仪)。
试药：甲醇(色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司)，水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。
对照品：新绿原酸(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：ST06230120，含量：98.0％)；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201716，含量：96.8％)；隐绿原酸(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：ST07850120，含量：98.0％)；槲皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：111538-201606，含量：90.6％)。
对照药材：甜叶菊对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121238-200603)。
样品：甜叶菊配方颗粒(批号：YK2205001，来源：浙江景岳堂药业有限公司实验室自制)。
实施例一：
甜叶菊配方颗粒特征图谱测定方法构建
1.色谱条件
色谱柱：Ecllpse Plus C18，4.6mm×250mm，5um
流动相：甲醇(A)-0.1％磷酸(B)
检测波长：325nm
流速：1ml/min
柱温：30℃
进样量：10μl
2.对照药材参照物溶液制备：取甜叶菊对照药材1g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。
对照品溶液的制备方法为：取绿原酸对照品、新绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、槲皮苷对照品，精密称定，加50％甲醇分别制成每1ml含0.1mg、0.1mg、0.1mg、0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
3.供试品溶液制备：取甜叶菊配方颗粒0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.特征峰指认
精密称取隐绿原酸对照品10.86mg、绿原酸对照品11.66mg、新绿原酸对照品9.90mg，置25ml容量瓶中，加50％甲醇适量溶解，50％甲醇定容至刻度，摇匀，分别制成隐绿原酸对照品母液(425.7μg/ml)、绿原酸对照品母液(451.5μg/ml)、新绿原酸对照品母液(388.1μg/ml)；精密称取槲皮苷对照品7.34mg，置50毫升容量瓶中，加50％甲醇适量溶解，50％甲醇定容至刻度线，摇匀，制成槲皮苷对照品母液(133.0ug/ml)。精密量取隐绿原酸对照品母液3ml、绿原酸对照品母液3ml和新绿原酸对照品母液3ml置10ml容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液(新绿原酸116.4μg/ml、绿原酸135.4μg/ml、隐绿原酸127.7μg/ml)。
精密称取样品(批号：YK2205001)0.1016g，照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液。
精密吸取槲皮苷对照品母液10μl、对照品混合溶液10μl，供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
甜叶菊配方颗粒供试品色谱图中1号峰、2号峰、3号峰、7号峰分别与新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和槲皮苷对照品色谱峰图谱保留时间一致，结果见图1。
实施例二：
甜叶菊配方颗粒特征图谱对照特征图谱的建立
取15批甜叶菊配方颗粒按照实施例一的色谱方法进行检测，获得15批甜叶菊配方颗粒特征图谱，如图2，采用中药色谱特征图谱相似度评价系统生成甜叶菊配方颗粒的对照特征图谱，如图3，确认共有峰7个，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应。与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间(即峰1、峰3、峰4、峰5的保留时间分别与S1峰保留时间的比值)；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间。其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.53(峰1)、1.17(峰3)、2.91(峰4)、3.06(峰5)、0.99(峰6)，结果见表1～2。
表115批甜叶菊配方颗粒共有峰相对保留时间结果表
表2对照特征图谱相对保留时间结果表
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算15批甜叶菊颗粒的相似度，结果见表3。
表315批甜叶菊配方颗粒相似度结果表
根据上述结果可见，15批甜叶菊配方颗粒特征图谱相似度均在0.95以上。
实施例三：
甜叶菊配方颗粒特征图谱测定方法学验证
1.精密度考察
精密称取样品(批号：YK2205001)0.50292g，照“供试品溶液的制备”项下方法制成供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录共有峰保留时间，重复6次，与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间及RSD值；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间及RSD值，结果见表4。
表4精密度相对保留时间结果表
结果表明，仪器进样精密度良好。
2.稳定性试验
精密称取样品(批号：YK2205001)0.50292g，照“供试品溶液的制备”项下方法制备。分别于0、2、4、6、8、10、18、24小时精密吸取供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪，与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间及RSD值；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间及RSD值，结果见表5。
表5稳定性相对保留时间结果表
结果表明，溶液24小时内稳定性良好。
3.重复性试验
取同一供试品(批号：YK2205001)6份，照“供试品溶液的制备”项下方法制备，精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录共有峰保留时间，与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间及RSD值；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间及RSD值，结果见表6。
表6重复性相对保留时间结果表
结果表明，该方法重复性较好。
4.耐用性试验
(1)柱温耐用性
依照规定的色谱条件，改变柱温±5℃，取样品(批号：YK2205001)，照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录共有峰保留时间，与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间及RSD值；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间及RSD值，结果见表7。
表7柱温耐用性相对保留时间结果表
(2)波长耐用性
依照规定的色谱条件，改变波长±5nm，取样品(批号：YK2205001)，照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录共有峰保留时间，与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间及RSD值；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间及RSD值结果见表8。
表8波长耐用性相对保留时间结果表
(3)流速耐用性
依照规定的色谱条件，改变流速±0.1ml/min，取样品(批号：YK2205001)，照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录共有峰保留时间，与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间及RSD值；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间及RSD值，结果见表9。
表9流速耐用性相对保留时间结果表
结果表明，本方法在色谱条件柱温25℃～35℃、检测波长320～330nm、流速0.9～1.1ml/min范围内均可适用。
5.中间精密度试验
依照规定的色谱条件，改变仪器及色谱柱，取样品(批号：YK2205001)，照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录共有峰保留时间，与绿原酸参照物色谱峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间及RSD值；与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间及RSD值，结果见表10。
表10仪器及色谱柱耐用性相对保留时间结果表
结果表明，该方法重现性结果良好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备甜叶菊对照药材参照物溶液、甜叶菊配方颗粒供试品溶液和指标性成分的对照品溶液；
2)将步骤1)中制备的对照药材参照物溶液、供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪进行色谱分析，得到相应的液相色谱图；
3)以步骤2)中得到对照品溶液的液相色谱图作为对照，同时参照药材参照物溶液的液相色谱图，从步骤2)中得到的供试品溶液的液相色谱图中选择共有峰，构建甜叶菊配方颗粒特征图谱。
2.根据权利要求1所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，所述甜叶菊对照药材参照物溶液的制备方法为：取甜叶菊对照药材1g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。
3.根据权利要求1所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法为：取绿原酸对照品、新绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、槲皮苷对照品，精密称定，加50％甲醇分别制成每1ml含0.1mg、0.1mg、0.1mg、0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：将甜叶菊配方颗粒研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.根据权利要求1所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％V/V磷酸溶液为流动相B，按梯度洗脱程序洗脱，检测波长为325nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
6.根据权利要求5所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：
0→18min，流动相A的体积百分比为80％→77％，流动相B的体积百分比为20％→23％；
18→18.01min，流动相A的体积百分比为77％→68％，流动相B的体积百分比为23％→32％；
18.01→45min，流动相A的体积百分比为68％→65％，流动相B的体积百分比为32％→35％；
45→45.01min，流动相A的体积百分比为65％→55％，流动相B的体积百分比为35％→45％；
45.01→60min，流动相A的体积百分比为55％，流动相B的体积百分比为45％。
7.一种甜叶菊配方颗粒特征图谱，其特征在于，通过权利要求1-6中任一项所述的构建方法而获得。
8.根据权利要求7所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱，其特征在于，所述特征图谱中呈现7个特征峰，与绿原酸对应的色谱峰为S1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间分别为：0.53(峰1)、1.17(峰3)、2.91(峰4)、3.06(峰5)；与槲皮苷对应的色谱峰为S2峰，计算峰6与S2峰的相对保留时间为：0.99(峰6)；以上相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。
9.根据权利要求7或8所述的甜叶菊配方颗粒特征图谱在甜叶菊配方颗粒的检测中的应用。
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