CN116077736A - 基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架及其制备方法，将甲基丙烯酸改性明胶和无机纳米颗粒复合得到有机/无机溶液，将聚氧化乙烯加入有机/无机溶液混合均匀后通过乳化得到微球。通过降低乳化体系的温度得到物理交联的微球；将微球浸泡于含有光引发剂的溶液后高速离心，去掉上层液体得到紧密堆积的微球，将堆积微球用光交联后得到微球支架。在生理环境下，PEO的溶出使微球内部具有贯通的微孔，微球之间的大孔和微球和内部的微孔形成多尺度孔道结构，有利于氧气、营养物质及代谢产物的传输；同时也利于细胞的浸润，铺展和增殖；有利于血管和新生组织的长入。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架及其制备方法。
背景技术
在临床上，一旦超过临界尺寸，骨缺损便无法自我愈合，需要进行外科手术治疗。传统的外科骨科手术创伤大、术中容易感染、病人舒适度低，因此基于可注射骨修复材料的微创手术受到了越来越多的青睐。此外，针对临床上深度较大或者不规则的骨缺损，可注射骨修复材料能够完美填充，且与周围组织紧密结合。因此，可注射骨修复材料的开发得到了越来越多的重视。由于水凝胶具有较高的含水量以及类似天然细胞外基质的纳米纤维网络结构，在组织再生方面受到了广泛关注。然而，传统的可注射水凝胶内部孔隙为纳米级，不利于氧气、营养物质和代谢产物的传输，限制细胞的浸润，阻碍血管和新生组织的长入。这些缺点极大地限制了可注射水凝胶在骨组织再生领域中的运用。因此，开发一种可注射的、具有大孔结构的水凝胶以实现组织的再生修复非常重要。
目前，制备可注射多孔水凝胶的方法主要为致孔剂法，气体发泡法等。但这些方法往往存在添加剂容易残留、毒性较大、孔隙不均匀且难贯通等缺点。此外，上述方法制备的多孔材料孔径尺寸单一，缺乏多尺度孔道结构。相对于具有单一尺寸孔结构的材料，同时具有大孔和微孔的材料更有利于营养物质的传输和血管的长入。因此，如何制备具有多尺度孔道结构的可注射水凝胶支架是目前需要解决的技术问题。
发明内容
提供一种基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，解决现有技术中可注射水凝胶材料缺乏多尺度孔道结构，传质效率低的问题。
本发明采用的技术方案如下：
基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架，通过以下制备方法获得，所述的制备方法包括以下步骤：
步骤1.用甲基丙烯酸酐对明胶进行化学改性，冻干后得到甲基丙烯酸明胶(GelMA)海绵；
步骤2.将步骤1中制得的GelMA溶解于去离子水，加入不同含量的无机纳米颗粒后超声分散得到均匀的溶液；
步骤3.聚氧化乙烯(PEO)溶解于去离子水中，按比例加入到步骤2的溶液中混合均匀；
步骤4.将步骤3的溶液滴加到含有乳化剂的油相中搅拌形成微球，接着将整个乳化体系放置于冰水浴上搅拌，再用冰丙酮分离出乳化体系中的微球后洗涤、抽滤、挥干；
步骤5.将步骤4中制得的微球浸泡于含有光引发剂的PBS缓冲溶液中，溶胀后离心去掉上层清液，将下层高浓度的微球转移到模具中，光交联后得到微球支架。
所述步骤1中的GelMA的接枝度为20％-50％。
进一步地，所述步骤2中的GelMA的质量浓度为10-20％，无机纳米颗粒为如羟基磷灰石、生物活性玻璃、蒙脱土中的一种，无机纳米颗粒的浓度为1％-10％。
进一步地，所述步骤3中PEO溶液的质量浓度为0.5-1.5％，PEO和GelMA的体积比为0.2～1：1。
进一步地，所述步骤4乳化剂为司盘80和吐温80中的一种或两种的结合。乳化剂的含量为油相体积的0.5％-2％。油相为液体石蜡油、玉米油、环己烷中的一种。
进一步地，所述步骤4中所述搅拌速度为150-500转/分钟，搅拌时间为2-10分钟。
进一步地，所述步骤5中的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(I2959)、1-羟基环己基-苯基甲酮中的一种。
进一步地，所述步骤5中的离心速度为8000-12000转/分钟，离心时间为2-5分钟。
进一步地，所述步骤5中引发光为紫外光或蓝光中的一种。
本发明所述的上述制备方法制成的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架，该支架在蓝光交联前可以通过21G的注射器针头挤出。该支架具有三维贯通的多尺度孔道结构：微球与微球之间具有大孔间隙，孔径为50-200微米；微球内部具有贯通的微孔，孔径为1-10微米。通过添加无机纳米颗粒，可以提高支架的力学性能，抗降解性能和骨诱导性能。
本发明获得的支架具有一定的力学强度，在交联后能够保持结构的完整性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法简单，设计合理，其原料明胶来源广泛，价格低廉，具有优异的生物相容性和生物降解性。微球与微球之间的间隙形成贯通的大孔，微球内部因PEO的溶出具有贯通的微孔，微球之间的大孔和微球内部的微孔使水凝胶支架具有多尺度孔道结构，有利于氧气、营养物质及代谢产物的传输；同时也利于细胞的浸润、铺展和增殖；有利于血管和新生组织的长入。通过改变微球的直径，可以调节大孔孔径的尺寸。通过改变GelMA溶液的浓度和无机纳米颗粒的含量，可以实现微球强度的调节，以适应不同组织部位对材料力学性能的需求。
附图说明
图1为实施例1负载羟基磷灰石纳米粒子的多孔复合微球的激光共聚焦照片。
图2为实施例1使用21G注射器针头注射堆积多孔微球的照片。
图3为普通块体水凝胶和实施例1具有多尺度孔道结构水凝胶支架的液体传质能力图像。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明所述的具有多尺度孔道结构的水凝胶支架的制备方法做进一步说明。
实施例1：
(1)将10g明胶和200mL去离子水混合后置于50℃水浴锅中搅拌20分钟，得到透明均一的明胶溶液。将12.5mL甲基丙烯酸酐缓慢加入明胶溶液中，同时用氢氧化钠调节溶液pH，使其pH稳定在7.5-8.0之间，反应3h后将所得溶液透析，将透析后的溶液冷冻干燥，得到白色GelMA海绵。
(2)将1.5g GelMA溶解于5mL去离子水中，加入500mg纳米羟基磷灰石颗粒后超声分散；
(3)将50mg的PEO溶解5mL去离子水，将5mL去离子水加入(2)中的溶液后搅拌分散均匀；
(4)将0.5mL司盘加入50mL液体石蜡油中搅拌均匀。在200转每分钟的搅拌速度下将(3)中的溶液缓慢滴入液体石蜡中，搅拌5分钟。接着将乳化体系快速转移到冰水混合浴上，搅拌30分钟。加入冰丙酮后搅拌30分钟，过滤得到微球，用冰丙酮洗涤微球三次，在通风橱中挥干丙酮，得到干燥的微球。
(5)取200mg上述干燥微球，加入含有0.1％LAP的PBS溶液低温浸泡3个小时，在低温下10000转/分钟离心5分钟，去掉上层多余的液体，得到高浓度的微球。将微球转移到注射器中，用21G针头将微球注入模具，蓝光照射1.5分钟后得到微球支架。将微球支架在37℃的PBS中浸泡24h，得到具有多尺度孔道结构的微球支架。
如图1为实施例负载羟基磷灰石纳米粒子的多孔复合微球的激光共聚焦照片。如图2为实施例使用21G注射器针头注射堆积多孔微球的照片。如图3为普通块体水凝胶和实施例具有多尺度孔道结构水凝胶支架的液体传质能力图像。
实施例2：
(1)将10g明胶和200mL去离子水混合后置于50℃水浴锅中搅拌20分钟，得到透明均一的明胶溶液。将8mL甲基丙烯酸酐缓慢加入明胶溶液中，同时用氢氧化钠调节溶液pH，使其pH稳定在7.5-8.0之间，反应3h后将所得溶液透析，将透析后的溶液冷冻干燥，得到白色GelMA海绵。
(2)将2g GelMA溶解于5mL去离子水中，加入100mg纳米生物活性玻璃颗粒后超声分散；
(3)将50mg的PEO溶解5mL去离子水，将5mL去离子水加入(2)中的溶液后搅拌分散均匀；
(4)将0.5mL司盘和0.5mL吐温加入50mL环己烷中搅拌均匀。在300转每分钟的搅拌速度下将(3)中的溶液缓慢滴入环己烷中，搅拌5分钟。接着将乳化体系快速转移到冰水混合浴上，搅拌30分钟。加入冰丙酮后搅拌30分钟，过滤得到微球，用冰丙酮洗涤微球三次，在通风橱中挥干丙酮，得到干燥的微球。
(5)取200mg上述干燥微球，加入含有0.1％LAP的PBS溶液低温浸泡3个小时，在低温下10000转/分钟离心5分钟，去掉上层多余的液体，得到高浓度的微球。将微球转移到注射器中，用21G针头将微球注入模具，蓝光照射1.5分钟后得到微球支架。将微球支架在37℃的PBS中浸泡24h，得到具有多尺度孔道结构的微球支架。
实施例3
(1)将10g明胶和200mL去离子水混合后置于50℃水浴锅中搅拌20分钟，得到透明均一的明胶溶液。将12.5mL甲基丙烯酸酐缓慢加入明胶溶液中，同时用氢氧化钠调节溶液pH，使其pH稳定在7.5-8.0之间，反应3h后将所得溶液透析，将透析后的溶液冷冻干燥，得到白色GelMA海绵。
(2)将2g GelMA溶解于5mL去离子水中，加入500mg纳米羟基磷灰石颗粒后超声分散；
(3)将50mg的PEO溶解5mL去离子水，将2.5mL去离子水加入(2)中的溶液后搅拌分散均匀；
(4)将1mL司盘加入50mL液体石蜡油中搅拌均匀。在500转每分钟的搅拌速度下将(3)中的溶液缓慢滴入液体石蜡中，搅拌10分钟。接着将乳化体系快速转移到冰水混合浴上，搅拌30分钟。加入冰丙酮后搅拌30分钟，过滤得到微球，用冰丙酮洗涤微球三次，在通风橱中挥干丙酮，得到干燥的微球。
(5)取200mg上述干燥微球，加入含有0.5％I2959的PBS溶液低温浸泡3个小时，在低温下8000转/分钟离心3分钟，去掉上层多余的液体，得到高浓度的微球。将微球转移到注射器中，用21G针头将微球注入模具，紫外光照射0.5分钟后得到微球支架。将微球支架在37℃的PBS中浸泡24h，得到具有多尺度孔道结构的微球支架。
实施例4
(1)将10g明胶和200mL去离子水混合后置于50℃水浴锅中搅拌20分钟，得到透明均一的明胶溶液。将12.5mL甲基丙烯酸酐缓慢加入明胶溶液中，同时用氢氧化钠调节溶液pH，使其pH稳定在7.5-8.0之间，反应3h后将所得溶液透析，将透析后的溶液冷冻干燥，得到白色GelMA海绵。
(2)将2g GelMA溶解于5mL去离子水中，加入100mg纳米蒙脱土颗粒后超声分散；
(3)将50mg的PEO溶解5mL去离子水，将5mL去离子水加入(2)中的溶液后搅拌分散均匀；
(4)将1mL司盘加入50mL玉米油中搅拌均匀。在500转每分钟的搅拌速度下将(3)中溶液缓慢滴入液体石蜡中，搅拌10分钟。接着将乳化体系快速转移到冰水混合浴上，搅拌30分钟。加入冰丙酮后搅拌30分钟，过滤得到微球，用冰丙酮洗涤微球三次，在通风橱中挥干丙酮，得到干燥的微球。
(5)取200mg上述干燥微球，加入含有0.5％I2959的PBS溶液低温浸泡3个小时，在低温下8000转/分钟离心3分钟，去掉上层多余的液体，得到高浓度的微球。将微球转移到注射器中，用21G针头将微球注入模具，紫外光照射0.5分钟后得到微球支架。将微球支架在37℃的PBS中浸泡24h，得到具有多尺度孔道结构的微球支架。
实施例5
(1)将10g明胶和200mL去离子水混合后置于50℃水浴锅中搅拌20分钟，得到透明均一的明胶溶液。将12.5mL甲基丙烯酸酐缓慢加入明胶溶液中，同时用氢氧化钠调节溶液pH，使其pH稳定在7.5-8.0之间，反应3h后将所得溶液透析，将透析后的溶液冷冻干燥，得到白色GelMA海绵。
(2)将2g GelMA溶解于5mL去离子水中，加入500mg纳米羟基磷灰石后超声分散；
(3)将50mg的PEO溶解5mL去离子水，将3mL去离子水加入(2)中的溶液后搅拌分散均匀；
(4)在500转每分钟的搅拌速度下将(3)中的溶液缓慢滴入液体石蜡中，搅拌10分钟。接着将乳化体系快速转移到冰水混合浴上，搅拌30分钟。加入冰丙酮后搅拌30分钟，过滤得到微球，用冰丙酮洗涤微球三次，在通风橱中挥干丙酮，得到干燥的微球。
(5)取200mg上述干燥微球，加入含有0.5％I2959的PBS溶液低温浸泡3个小时，在低温下8000转/分钟离心3分钟，去掉上层多余的液体，得到高浓度的微球。将微球细胞混合物转移到注射器中，用21G针头将微球注入模具，蓝光照射1.5分钟后得到微球支架。将微球支架在37℃的PBS中浸泡24h，得到具有多尺度孔道结构的微球支架。
Claims (10)
1.基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.用甲基丙烯酸酐对明胶进行化学改性，冻干后得到甲基丙烯酸明胶GelMA海绵；
步骤2.将步骤1中制得的GelMA溶解于去离子水，加入无机纳米颗粒后超声分散得到均匀的溶液；
步骤3.将聚氧化乙烯PEO溶解于去离子水中，加入到步骤2的溶液中混合均匀；
步骤4.将步骤3的溶液滴加到含有乳化剂的油相中搅拌形成微球，接着将整个乳化体系放置于冰水浴上搅拌，再用冰丙酮分离出乳化体系中的微球后洗涤、抽滤、挥干；
步骤5.将步骤4中制得的微球浸泡于含有光引发剂的PBS缓冲溶液中，溶胀后离心去掉上层清液，将下层高浓度的微球转移到模具中，光交联后得到微球支架。
2.根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，其特征在于，步骤1中所述GelMA的接枝度为20％-50％。
3.根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，其特征在于，步骤2中的GelMA水溶液的质量浓度为10％-20％，无机纳米颗粒为羟基磷灰石、生物活性玻璃、蒙脱土中的一种，无机纳米颗粒的质量浓度为1％-10％。
4.根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，其特征在于，步骤3中PEO溶液的质量浓度为0.5-1.5％，PEO和GelMA的体积比为0.2～1：1。
5.根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，其特征在于，步骤4中油相为液体石蜡油、玉米油、环己烷中的一种，乳化剂为司盘80和吐温80中的一种或两种的结合；乳化剂的含量为油相体积的0.5％-2％。
6.根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，其特征在于，步骤4中乳化过程搅拌速度为150-500转/分钟，搅拌时间为2-10分钟。
7.根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，其特征在于，步骤4中光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(I2959)、1-羟基环己基-苯基甲酮中的一种。
8.根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，步骤5中的低温放置时间为30分钟到3小时，离心速度为8000-12000转/分钟，离心时间为2-5分钟。
9.根根据权利要求1所述的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架的制备方法，所述步骤5中引发光为紫外光或蓝光中的一种。
10.权利要求1-9任意一项所述的制备方法制成的基于多孔明胶复合微球的可注射骨修复支架。
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