CN116076631A - 一种调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料及其制备方法 - Google Patents
一种调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料及其制备方法。将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液混合，得到复合菌剂，将复合菌剂接种到固体培养基中进行厌氧发酵，厌氧发酵后再加入加州鲈预混合饲料和魔芋精粉，制粒获得调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料。本发明能够调控肠道微生物菌群结构，改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，同时能靶向调节加州鲈肠道菌群和代谢物，促进加州鲈对饲料中糖脂的利用率和营养的消化吸收，提高动物的饲料转化率，且可有效提高加州鲈对对饲料糖脂代谢的利用，减少腹腔脂肪蓄积，降低脂肪肝的发生，增强机体免疫能力，减少疾病发生，提高商品鱼经济和市场价值。
Description
技术领域：
本发明属于动物饲料领域，具体涉及一种调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料及其制备方法。
背景技术：
加州鲈(Micropterus salmoides)隶属鲈形目太阳鱼科(Ceutrarchidae)，又名大口黑鲈，为肉食性温水鱼类，我国重要的淡水养殖名特优品种，肉质鲜美，营养价值高。根据《2022中国渔业统计年鉴》显示，我国加州鲈养殖产量已经达到了70.21万吨，目前加州鲈已基本解决了从冰鲜鱼到配合饲料的养殖问题，但由于加州鲈本身对糖脂利用率差，摄食人工饲料易于导致加州鲈糖脂代谢紊乱，腹腔脂肪蓄积、肝脏肿大，严重的影响了加州鲈肉质品质及商品价值。肠道菌群是肠道屏障中的重要成员，影响着宿主的营养吸收、能量代谢以及免疫应答。机体营养代谢障碍和肠道菌群失调有着密切的联系，调节肠道微生物是调控机体营养代谢障碍重要方式。
饲料经过功能性微生物发酵饲喂养殖动物，通过功能性微生物及次生代谢产物靶向调节肠道菌群及代谢产物是预防或治疗机体营养代谢障碍疾病的非常有效的方法。
目前未见有关调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料制备方法相关专利。
发明内容：
本发明的目的是提供一种调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料及其制备方法。
本发明的调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料，其制备方法是：
将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液混合，得到复合菌剂，将复合菌剂接种到固体培养基中进行厌氧发酵，厌氧发酵后再加入加州鲈预混合饲料和魔芋精粉，制粒获得调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料；
所述的固体培养基是：按质量分数计，包括玉米粉10％-20％，豆粕35-55％，鱼粉25-45％，麦麸5-10％；混合后加水至水分含量为25-40％，混合均匀得到固体培养基。
优选，是将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液按照体积比1-3:1-3:4-8混合，得到复合菌剂，将复合菌剂按照固体培养基重量10-20％接种到固体培养基中，28-35℃恒温厌氧发酵，发酵时间为72-96h，厌氧发酵结束后，在厌氧发酵料中添加厌氧发酵料重量0.5％-1％加州鲈预混合饲料和0.1-0.5％的魔芋精粉，按不同生长阶段加州鲈饲料粒径要求，常温制软颗粒饲料。
优选，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液，其活菌数都在1.0×109cfu/mL以上。
优选，所述的枯草芽孢杆菌菌液的制备方法是：挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37±1℃摇床活化16-24h；然后将活化好的的菌液按体积比3-6％接种量接种到种子液体培养基中，37±1℃培养16-24h得到枯草芽孢杆菌种子液；
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰，0.03％，碳酸钙0.24％，pH7.0±0.2。
优选，所述的酿酒酵母菌液是挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28±1℃摇床活化20-24h；然后将活化好的菌液按体积比2-5％接种量接种到种子液体培养基中，28±1℃培养18-24h得到酿酒酵母种子液；
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖2％，蔗糖2％，大豆蛋白胨3％，酵母粉1％，磷酸氢二钾0.5％，尿素0.5％，pH6.0±0.2。
优选，所述的产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液是挑选产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种接种到MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18-26h，然后将活化的液体菌种以体积比3-6％的接种量转接到液体种子培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为60-80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为18-26h，制成种子液；
将种子液以体积比3-6％的接种量转接到含有产甘油脱水酶发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50-65％，发酵温度28-32℃，微氧培养，转速80-100rpm，控制整个发酵过程pH5.5-7.0，发酵时间18-25h后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油到菌液中，甘油浓度150-450mmol/L，甘油溶液和菌液体积比：1-5∶99-95，酶转化温度：28-32℃，时间1-5h，由此制备得到含罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液；
所述的MRS液体培养基，液体种子培养基，其每升制备方法均为：将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g加水至1000mL，pH6.8；
所述的产甘油脱水酶发酵培养基，每升制备方法为：将糖蜜25g、牛肉膏4g、酵母粉4g加入到水中，加水至1000ml，pH 6.0。
经罗伊氏菌素含量和罗伊氏乳杆菌活菌数检测，罗伊氏菌素含量120-200mmol/L，罗伊氏乳杆菌活菌数1.0×109cfu/mL～5.0×109cfu/mL。
本发明能够调控肠道微生物菌群结构，改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，同时能靶向调节加州鲈肠道菌群和代谢物，促进加州鲈对饲料中糖脂的利用率和营养的消化吸收，提高动物的饲料转化率，且可有效提高加州鲈对对饲料糖脂代谢的利用，减少腹腔脂肪蓄积，降低脂肪肝的发生，增强机体免疫能力，减少疾病发生，提高商品鱼经济和市场价值。
附图说明：
图1是实施例4的实验结果，每组柱形图从左至右分别为Ctr0、试验组I和II；
图2是肠道代谢物生物胺的含量；
图3是肠道代谢物锻炼脂肪酸含量，每组柱形图从左至右分别为Ctr0、试验组I；
图4是脂代谢含量，每组柱形图从左至右分别为Ctr0、试验组I和II；
图5是酶活图，每组柱形图从左至右分别为Ctr0、试验组I和II。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下使用的加州鲈预混合饲料，每1000kg由以下质量配比的原料配制而成：维生素A 0.8kg，维生素D3 0.24kg，维生素K3 2.16kg，dl-α-生育酚乙酸酯8.40kg，维生素B10.86kg，维生素B2 1.20kg，维生素B6 0.73kg，维生素B12 0.30kg，烟酰胺6.19kg，D-泛酸钙2.45kg，叶酸0.49kg，D-生物素0.60kg，L-抗坏血酸-2-磷酸酯20.57kg，肌醇3.67kg，乙氧基喹啉2.40kg，一水硫酸镁20.63kg，一水硫酸亚铁12.83kg，一水硫酸锌5.74kg，五水硫酸铜3.52kg，一水硫酸锰3.46kg，1％硫酸钴13.20kg，1％碘酸钙9.9kg，1％亚硒酸钠3.3kg，其余为沸石粉和稻壳粉质量各半，将上述原料混合均匀，即得加州鲈预混合饲料。其中，所述的1％硫酸钴、1％碘酸钙和1％亚硒酸钠均从广州志专饲料有限公司购买。
魔芋精粉购自湖北强森魔芋科技有限公司
以下使用的罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌GDMCC 1.614，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌株编号：GDMCC 1.614。
以下使用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌GDMCC 1.372，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌株编号：GDMCC 1.372。
以下使用的酿酒酵母为酿酒酵母GDMCC 2.167，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌株编号：GDMCC 2.167。
实施例1
1制备发酵菌种：制备枯草芽孢杆菌、酿酒酵母种子液、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液，其活菌数在1.0×109cfu/mL以上；
1.1枯草芽孢杆菌种子液的制备
挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37±1℃摇床活化16h；然后将活化好的菌液按体积比3％接种量接种到种子液体培养基中，37±1℃培养16h得到枯草芽孢杆菌种子液。
LB培养基(Luria-Bertani培养基)配方为：将胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g加入到1L蒸馏水中，调pH7.0，灭菌备用。
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰，0.03％，碳酸钙0.24％，溶剂为水，pH7.0±0.2，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
2.2产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种子液的制备
2.2.1挑选产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种接种到MRS液体种子培养基中，37±1℃静置培养18h，然后将活化的液体菌种以体积比3％的接种量转接到MRS液体发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为60％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为18h，制成种子液；
将种子液以体积比3％的接种量转接到含有产甘油脱水酶发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50％，发酵温度28℃，微氧培养，转速80rpm，用6mol/LNaOH调节pH，控制整个发酵产酶pH5.5，发酵时间18h后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油(甘油浓度150mmol/L)到菌液中，甘油溶液和菌液体积比：1∶99，酶转化温度：28℃，时间1h，由此制备得到含罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液。
所述的MRS培养基，种子培养基均为：在1L的体系里面，将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801mL、碳酸钙10g、加水至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。
所述的产甘油脱水酶发酵培养基为：在1L的体系里面将糖蜜25g，牛肉膏4g，酵母粉4g，加水至1000mL，pH 6.0，115℃灭菌30min。
2.3酿酒酵母种子液的制备
挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28±1℃摇床活化20h；然后将活化好的菌液按体积比2％接种量接种到种子液体培养基中，28±1℃培养18h得到酿酒酵母种子液。
PDA液体培养基配方为：去皮马铃薯200g、切碎煮汁过滤去渣，加入蔗糖20g、蛋白胨10g、琼脂18g，再加水定容至1L，调pH7.0。
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖2％，蔗糖2％，大豆蛋白胨3％，酵母粉1％，磷酸氢二钾0.5％，尿素0.5％，溶剂为水，pH6.0±0.2，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
3饲料原料粉碎过筛：饲料原料粉碎过40目，按如下质量配比称取：玉米粉10％，豆粕55％，鱼粉25％，麦麸10％，混合均匀，然后加水至水分含量为35％，用混合机混合均匀得到固体培养基。
4接种发酵
将发酵待用的菌种枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液按体积比1:1:8比例混合，以固体培养基湿重10％均匀接种到上述固体培养基中，28℃恒温厌氧发酵，发酵时间为72h。
以罗伊氏乳杆菌菌液作为对照，以固体培养基湿重10％均匀接种到上述固体培养基中，28℃恒温厌氧发酵，发酵时间为72h。
5厌氧发酵结束后，在厌氧发酵料中添加厌氧发酵料质量占比0.5％加州鲈预混合饲料和厌氧发酵料质量占比0.3％的魔芋精粉，混匀常温制的2.0粒径的软颗粒饲料，即为加州鲈发酵配合饲料，即调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料。
未发酵加州鲈配合饲料是在固体培养基中添加固体培养基质量占比0.5％加州鲈预混合饲料和固体培养基质量占比0.3％的魔芋精粉，混匀常温制的2.0粒径的软颗粒饲料，即为未发酵加州鲈配合饲料。
6检测结果
分别发酵前后测定加州鲈发酵配合饲料粗蛋白、酸溶蛋白、生物活性肽、游离氨基酸、L-乳酸、罗伊氏菌素的含量及芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌活菌数指标(表1)。
表1
实施例2
1制备发酵菌种：制备枯草芽孢杆菌、酿酒酵母种子液、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液，其活菌数在1.0×109cfu/mL以上；
1.1枯草芽孢杆菌种子液的制备
挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37±1℃摇床活化20h；然后将活化好的菌液按体积比4％接种量接种到种子液体培养基中，37±1℃培养20h得到枯草芽孢杆菌种子液。
LB培养基(Luria-Bertani培养基)配方为：将胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g加入到1L蒸馏水中，调pH7.0，灭菌备用。
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰，0.03％，碳酸钙0.24％，pH7.0±0.2，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
2.2产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种子液的制备
2.2.1挑选产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种接种到MRS液体种子培养基中，37±1℃静置培养22h，然后将活化的液体菌种以体积比4％的接种量转接到MRS液体发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为22h，制成种子液；
将种子液以体积比4％的接种量转接到含有产甘油脱水酶发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为58％，发酵温度30℃，微氧培养，转速90rpm，用6mol/LNaOH调节pH，控制整个发酵产酶pH6.0，发酵时间21h后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油(甘油浓度300mmol/L)到菌液中，甘油溶液和菌液体积比：2∶98，酶转化温度：30℃，时间2.5h，由此制备得到含罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液。
所述的MRS液体发酵培养基，种子培养基均为：在1L的体系里面，将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，加水至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。
所述的产甘油脱水酶发酵培养基为：在1L的体系里面，将糖蜜25g、牛肉膏4g、酵母粉4g，pH6.0加水至1000mL，115℃灭菌30min。
2.3酿酒酵母种子液的制备
挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28±1℃摇床活化22h；然后将活化好的菌液按体积比3％接种量接种到种子液体培养基中，28±1℃培养22h得到酿酒酵母种子液。
PDA液体培养基配方为：去皮马铃薯200g、切碎煮汁过滤去渣，加入蔗糖20g、蛋白胨10g、琼脂18g，再加水定容至1L，调pH7.0，灭菌备用。
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖2％，蔗糖2％，大豆蛋白胨3％，酵母粉1％，磷酸氢二钾0.5％，尿素0.5％，pH6.0±0.2，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
3饲料原料粉碎过筛：饲料原料粉碎过40目，按如下质量配比称取：玉米粉20％，豆粕30％，鱼粉45％，麦麸5％，加水至水份含量为35％，用混合机混合均匀得到固体培养基。
4接种发酵
将发酵待用的菌种枯草芽孢杆菌、酿酒酵母种子液、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液按体积比2:2:6比例，以固体培养基湿重15％均匀接种到上述固体培养基中，32℃恒温厌氧发酵，发酵时间为84h。
5厌氧发酵结束后，在厌氧发酵料中添加厌氧发酵料重量0.75％加州鲈预混合饲料和厌氧发酵料重量0.1％的魔芋精粉，混匀常温制得2.0粒径的软颗粒饲料(加州鲈发酵配合饲料，即调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料)。
未发酵加州鲈配合饲料是在固体培养基中添加固体培养基质量占比0.75％加州鲈预混合饲料和固体培养基质量占比0.1％的魔芋精粉，混匀常温制的2.0粒径的软颗粒饲料，即为未发酵加州鲈配合饲料。
6检测结果
分别发酵前后测定加州鲈发酵配合饲料粗蛋白、酸溶蛋白、生物活性肽、游离氨基酸、L-乳酸、罗伊氏菌素的含量及芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌活菌数指标(表2)。
表2
实施例3
1制备发酵菌种：制备枯草芽孢杆菌、酿酒酵母种子液、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液，其活菌数在1.0×109cfu/mL以上；
1.1枯草芽孢杆菌种子液的制备
挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37±1℃摇床活化24h；然后将活化好的菌液按体积比6％接种量接种到种子液体培养基中，37±1℃培养24h得到枯草芽孢杆菌种子液。
LB培养基(Luria-Bertani培养基)配方为：将胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g加入到1L蒸馏水中，调pH7.0，灭菌备用。
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰，0.03％，碳酸钙0.24％，pH7.0±0.2，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
2.2产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种子液的制备
2.2.1挑选产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种接种到MRS液体种子培养基中，37±1℃静置培养26h，然后将活化的液体菌种以体积比6％的接种量转接到MRS液体发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为26h，制成种子液；
将种子液以体积比6％的接种量转接到含有产甘油脱水酶发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为65％，发酵温度32℃，微氧培养，转速100rpm，用6mol/LNaOH调节pH，控制整个发酵产酶pH7.0，发酵时间25h后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油(甘油浓度450mmol/L)到菌液中，甘油溶液和菌液体积比：5∶95，酶转化温度：32℃，时间5h，由此制备得到含罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液。
所述的MRS液体发酵培养基，种子培养基均为：在1L的体系里面将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，加水至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。
所述的产甘油脱水酶发酵培养基为：在1L的体系里面，将糖蜜25g、牛肉膏4g、酵母粉4g，pH6.0加水至1000mL，115℃灭菌30min。
2.3酿酒酵母种子液的制备
挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28±1℃摇床活化24h；然后将活化好的菌液按体积比5％接种量接种到种子液体培养基中，28±1℃培养24h得到酿酒酵母种子液。
PDA液体培养基配方为：去皮马铃薯200g、切碎煮汁过滤去渣，加入蔗糖20g、蛋白胨10g、琼脂18g，再加水定容至1L，调pH7.0，灭菌备用。
所述的种子培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖2％，蔗糖2％，大豆蛋白胨3％，酵母粉1％，磷酸氢二钾0.5％，尿素0.5％，pH6.0±0.2，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
3饲料原料粉碎过筛：饲料原料粉碎过40目，按如下质量配比称取：玉米粉15％，豆粕43％，鱼粉35％，麦麸7％，加水至水份含量为35％，用混合机混合均匀得到固体培养基。
4接种发酵
将发酵待用的菌种枯草芽孢杆菌、酿酒酵母种子液、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液按体积比3:3:4比例，以固体培养基湿重20％均匀接种到上述固体培养基中，35℃恒温厌氧发酵，发酵时间为96h。
以罗伊氏乳杆菌菌液作为对照，以固体培养基湿重20％均匀接种到上述固体培养基中，35℃恒温厌氧发酵，发酵时间为96h。
5厌氧发酵结束后，在厌氧发酵料中添加厌氧发酵料重量1.0％加州鲈预混合饲料和0.5％的魔芋精粉，混匀常温制的2.0粒径的软颗粒饲料(加州鲈发酵配合饲料，即调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料)。
未发酵加州鲈配合饲料是在固体培养基中添加固体培养基质量占比1％加州鲈预混合饲料和固体培养基质量占比0.5％的魔芋精粉，混匀常温制的2.0粒径的软颗粒饲料，即为未发酵加州鲈配合饲料。
6检测结果
分别发酵前后测定加州鲈发酵配合饲料粗蛋白、酸溶蛋白、生物活性肽、游离氨基酸、L-乳酸、罗伊氏菌素的含量及芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌活菌数指标(表3)。
表3
实施例4
将上述实施例1发酵制得的加州鲈发酵配合饲料饲喂8g左右的加州鲈为试验组Ⅱ，记为Ⅱ，同时以未发酵的加州鲈配合饲料为空白对照组，记为Ctr0，单一罗伊氏乳杆菌发酵的加州鲈发酵配合饲料为试验组Ⅰ，记为Ⅰ，饲喂8周，每个试验设3重复，每个重复30尾鱼。试验结果如图1，试验组Ⅰ加州鲈饲料脂肪和总糖表观消化率分别比对照组提高了7.93％和14.97％。试验组Ⅱ加州鲈饲料脂肪和总糖表观消化率分别比对照组提高了26.80％和39.19％，显著高于Ctr0(P＜0.05)，比试验组Ⅰ提高了17.48％和21.07％，显著高于试验组Ⅰ(P＜0.05)。结果显示，本发明制备的加州鲈发酵配合饲料，可显著提高加州鲈对饲料糖脂利用率，其效果优于未发酵的加州鲈配合饲料和单一罗伊氏乳杆菌发酵的加州鲈发酵配合饲料。
实施例5
将上述实施例2发酵制得的加州鲈发酵配合饲料饲喂25g左右的加州鲈为试验组，记为Ⅰ，同时以未发酵的加州鲈配合饲料为空白对照组，记为Ctr0，饲喂8周，每个试验设3重复，每个重复20尾鱼。试验结束后，禁食24h后，每缸随机取10尾鱼，用干净纱布擦干鱼体表面，在冰盘上解剖取肠道放入冷冻管中，液氮速冻后，-80℃超低温冰箱保存。加州鲈肠道样品，冷冻干燥后，采用气相色谱测定乙酸等短链脂肪酸含量，生物胺含量采用高效液相色谱检测。
试验结果如图2和图3：试验组Ⅰ肠道代谢物组胺、尸胺和腐胺含量与对照组相比，降低了67.84％、89.36％和84.53％，显著低于对照组(P＜0.05)。试验组Ⅰ肠道代谢物乙酸、丙酸和丁酸的含量分别比对照组提高了119.26％、340.21％和426.90％。结果显示：饲喂本发明的加州鲈发酵配合饲料显著降低了加州鲈肠道代谢物组胺、尸胺和腐胺生物胺的含量，提高了加州鲈肠道代谢物乙酸、丙酸和丁酸短链脂肪酸的含量。饲喂本发明的加州鲈发酵配合饲料调控肠道代谢物短链脂肪酸，促进和提高加州鲈肠道营养物质的消化吸收。饲喂本发明的加州鲈发酵配合饲料调控肠道代谢物生物胺水平，一定程度可保护肠道因糖脂代谢紊乱导致的肠道损伤。
实施例6
将上述实施例3发酵制得的加州鲈发酵配合饲料饲喂40g左右的加州鲈试验组Ⅱ，记为Ⅱ，同时以未发酵的加州鲈配合饲料为空白对照组，记为Ctr0，单一罗伊氏乳杆菌发酵的加州鲈发酵配合饲料为试验组Ⅰ，记为Ⅰ，饲喂8周，每个试验设3重复，每个重复20尾鱼。试验结束后，禁食24h后，每缸随机取5尾鱼，用干净纱布擦干鱼体表面，尾静脉采血，在3000rpm4℃离心10min，分离血清，液氮速冻后，-80℃超低温冰箱保存用于血清糖脂代谢相关指标分析。
试验结果如图4和图5所示。试验组Ⅰ加州鲈血清甘油三脂、总胆固醇、游离脂肪酸和低密度脂蛋白胆固醇含量分别比对照组降低了9.19％、10.60％、8.49％和10.63％。试验组Ⅰ加州鲈血清丙酮酸激酶和葡糖糖激酶分别比对照组提高了8.85％和9.33％。试验组Ⅱ加州鲈血清甘油三脂、总胆固醇和游离脂肪酸含量分别比对照组降低了41.84％、40.63％、36.39％和31.50％，显著低于对照组(P＜0.05)，比试验组Ⅰ分别降低了35.95％、33.58％、30.49％和23.35％，显著低于试验组Ⅰ(P＜0.05)。试验组Ⅱ加州鲈血清丙酮酸激酶和葡糖糖激酶分别比对照组提高了34.07％和39.39％，显著高于对照组(P＜0.05)，试验组Ⅰ相比，分别提高了23.17％和27.49％，显著高于试验组Ⅰ(P＜0.05)。结果显示，饲喂本发明的加州鲈发酵配合饲料可显著提高加州鲈糖脂代谢能力，其效果优于常规加州鲈配合饲料和单一罗伊氏乳杆菌发酵的加州鲈发酵配合饲料。
Claims (7)
1.一种调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液混合，得到复合菌剂，将复合菌剂接种到固体培养基中进行厌氧发酵，厌氧发酵后再加入加州鲈预混合饲料和魔芋精粉，制粒获得调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料；
所述的固体培养基是：按质量分数计，包括玉米粉10％-20％，豆粕35-55％，鱼粉25-45％，麦麸5-10％；混合后加水至水分含量为25-40％，混合均匀得到固体培养基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，是将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液按照体积比1-3:1-3:4-8混合，得到复合菌剂，将复合菌剂按照固体培养基重量10-20％接种到固体培养基中，28-35℃恒温厌氧发酵，发酵时间为72-96h，厌氧发酵结束后，在厌氧发酵料中添加厌氧发酵料重量0.5％-1％加州鲈预混合饲料和0.1-0.5％的魔芋精粉，按不同生长阶段加州鲈饲料粒径要求，常温制软颗粒饲料。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液，其活菌数都在1.0×109cfu/mL以上。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌菌液的制备方法是：挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37±1℃摇床活化16-24h；然后将活化好的的菌液按体积比3-6％接种量接种到种子液体培养基中，37±1℃培养16-24h得到枯草芽孢杆菌种子液；
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰，0.03％，碳酸钙0.24％，pH7.0±0.2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酿酒酵母菌液是挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28±1℃摇床活化20-24h；然后将活化好的菌液按体积比2-5％接种量接种到种子液体培养基中，28±1℃培养18-24h得到酿酒酵母种子液；
所述的种子液体培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖2％，蔗糖2％，大豆蛋白胨3％，酵母粉1％，磷酸氢二钾0.5％，尿素0.5％，pH6.0±0.2。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液是挑选产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌种接种到MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18-26h，然后将活化的液体菌种以体积比3-6％的接种量转接到液体种子培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为60-80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为18-26h，制成种子液；
将种子液以体积比3-6％的接种量转接到含有产甘油脱水酶发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50-65％，发酵温度28-32℃，微氧培养，转速80-100rpm，控制整个发酵过程pH5.5-7.0，发酵时间18-25h后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油到菌液中，甘油浓度150-450mmol/L，甘油溶液和菌液体积比：1-5∶99-95，酶转化温度：28-32℃，时间1-5h，由此制备得到含罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌菌液；
所述的MRS液体培养基，液体种子培养基，其每升制备方法均为：将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g加水至1000mL，pH6.8；
所述的产甘油脱水酶发酵培养基，每升制备方法为：将糖蜜25g、牛肉膏4g、酵母粉4g加入到水中，加水至1000ml，pH 6.0。
7.一种按照权利要求1、2、3、4、5或6所述的制备方法制备得到的调控加州鲈糖脂代谢的功能性发酵饲料。
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2022
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