CN116063372A - 一类线粒体靶向的抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别是涉及一类线粒体靶向的抗肿瘤化合物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是由恶性细胞增殖引起的,是世界公认的一种高死亡率的疾病。化疗仍然是目前最有效的癌症治疗方法之一,但不良副作用限制了许多药物的临床使用。因此,开发高效、低毒的新型抗肿瘤药物是一项重要的任务。天然产物具有悠久的药用历史,是抗癌药物的主要来源之一。20世纪50年代,Wall博士从酸性喜树碱中分离出了天然产物喜树碱,并通过对喜树碱的结构修饰,进一步获得了抗癌药物伊立替康和拓扑替康。从那时起,从天然产品中发现和开发抗肿瘤药物进入了国际繁荣时期。在过去40年销售的185种小分子抗癌药物中,有120种直接或间接来自天然产物。综上所述,天然先导化合物的发现和结构修饰是天然药物研究的一个重要领域,也是其发展的重要方向之一。
5α,8α-过氧化麦角甾醇(5α,8α-epidioxiergosta-6,22-dien-3β-ol,EP)是一种从灵芝中提取的含有过氧桥结构的甾体化合物,具有显著的抗癌活性和细胞选择性。EP亲本上的过氧化物桥被认为是一个重要的药效团,与没有过氧化物桥结构的麦角甾醇相比,EP对多种癌细胞的细胞毒性作用显著增强。在我们之前的工作中,发现一些内过氧化物甾体衍生物可以调节肿瘤细胞中ROS的产生,并通过ROS介导的分子损伤、蛋白水平失衡和细胞周期阻滞进一步显示出对肿瘤细胞的细胞毒性活性。因此,5α,8α-过氧化麦角甾醇可能成为一种有价值的抗肿瘤药物开发先导化合物。
开发抗癌药物的主要挑战之一是提高其选择性,以及减少对正常组织的严重毒副作用。众所周知,肿瘤细胞容易抵抗凋亡,而线粒体与凋亡通路密切相关。因此,一种很有前途的策略是将治疗药物靶向到肿瘤细胞的线粒体上,以提高选择性和毒性。
发明内容
本发明的目的是提供一类线粒体靶向的抗肿瘤化合物及其制备方法和应用,以解决上述现有技术存在的问题,通过制备一系列具有线粒体靶向功能的新型5α,8α-过氧化麦角甾醇偶联三苯基膦衍生物,提供了重要中间体和目标产物的高效制备方法,还通过实验证明所制备的衍生物可以用于预防或治疗肝癌、乳腺癌、宫颈癌或其他癌症中。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一类线粒体靶向的抗肿瘤化合物,所述抗肿瘤化合物具有以下式(I)所示的化学结构:
其中,n=1,2,3,4。
本发明还提供一种所述的一类线粒体靶向的抗肿瘤化合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)以麦角甾醇为起始原料,将所述麦角甾醇和光敏剂共同溶解后,在冰水浴的条件下持续向反应体系中通入氧气并设置为光照条件,之后所述反应体系在室温下搅拌反应,制得中间体2;
(2)将所述中间体2和溴代烷基羧酸共同溶解后,加入催化剂和缩合剂,室温搅拌反应,制得中间体3;
(3)将所述中间体3与三苯基膦共同溶解后,加热回流反应,反应结束后,蒸发溶剂、洗涤沉淀,制得终产物。
上述步骤(1)到(3)的合成路线,如下所示。
优选的是,步骤(1)中,反应溶剂为吡啶、N,N-二甲基甲酰胺或甲醇中的任意一种;所述光敏剂包括荧光桃红B、曙红Y或孟加拉玫红中的任意一种;
所述光照条件为500W照射;所述搅拌反应的时间为1-2h。
优选的是,步骤(1)中,所述麦角甾醇和光敏剂的质量比为1:(0.01-0.03)。
优选的是,步骤(2)中,反应溶剂包括二氯甲烷;
所述溴代烷基羧酸包括3-溴丙酸、4-溴丁酸、5-溴戊酸和6-溴己酸,具体结构如下:
所述催化剂和缩合剂包括如下任一项的组合:DMAP和EDCI、DMAP和DCC、DMAP和DIC以及HATU和DIPEA;
所述室温搅拌反应的时间为4-6h。
优选的是,步骤(2)中,所述中间体2、溴代烷基羧酸、催化剂、缩合剂的反应投料摩尔比为1:(1.2-2.0):(0.1-0.3):(1.2-2.0)。
优选的是,步骤(3)中,反应溶剂为甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、正丁醇、四氢呋喃或乙腈中的任意一种;
反应条件为:80℃下回流搅拌反应48-72h。
优选的是,步骤(3)中,所述中间体3与三苯基膦的反应投料摩尔比为1:(5-15)。
本发明还提供一种线粒体靶向的抗肿瘤药物,所述抗肿瘤药物的成分包括所述的化合物、或者所述化合物的立体异构体、前体药物和在药学上可接受的盐。
本发明还提供所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述肿瘤包括人肝癌细胞系、人乳腺癌细胞系或人宫颈癌细胞系。
本发明公开了以下技术效果:
(1)本发明以5α,8α-过氧化麦角甾醇为先导化合物,以工业来源的麦角甾醇为原料,首先完成并完善了5α,8α-过氧化麦角甾醇的人工半合成方法,弥补了5α,8α-过氧化麦角甾醇天然产物产量不足的缺点;然后在拼合原理的指导下,将具有线粒体靶向功能的三苯基膦基团与5α,8α-过氧化麦角甾醇,设计并合成了一系列线粒体靶向抗肿瘤药物EP-TPP-(a-d)。
(2)本发明提供的EP-TPP类抗肿瘤药物在体外实验中能显著抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡,在体内实验中能明显抑制斑马鱼体内肿瘤组织的增殖。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明采用AO/EB法检测EP-TPP-b对MCF-7细胞细胞形态学变化的影响;
图2为本发明采用AV/PI染色检测化合物EP-TPP-b对MCF-7细胞的凋亡影响;(A)用化合物EP-TPP-b(0、1、2和4μM)处理MCF-7细胞24h后,用流式细胞术检测Annexin V-FITC/PI染色细胞凋亡情况;(B)化合物EP-TPP-b诱导MCF-7细胞凋亡的定量分析;数据以平均±SD(n=3)表示;**P<0.01,***P<0.001与对照组比较;
图3为本发明不同剂量化合物EP-TPP-b对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响;(A)用化合物EP-TPP-b(0、1、2和4μM)处理MCF-7细胞24h后,用流式细胞术检测线粒体膜电位变化;(B)化合物EP-TPP-b诱导MCF-7细胞膜电位去极化的定量分析;数据以平均±SD(n=3)表示;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与对照组比较;
图4为DCFH-DA法检测化合物EP-TPP-b对MCF-7细胞内活性氧生成水平的影响;(A)用化合物EP-TPP-b(0、1、2、4μM)处理MCF-7细胞24h,使用H2DCFDA对细胞进行染色,用流式细胞术进行数据分析;(B)图A中四个浓度下流式合并图;(C)不同浓度EP-TPP-b处理后细胞内ROS水平的定量分析;数据以平均±SD(n=3)表示;*P<0.05,**P<0.01与对照组比较;
图5为本发明化合物EP-TPP-b对斑马鱼MCF-7瘤模移植模型的抗肿瘤作用检测;(A)化合物EP-TPP-b、EP、顺铂或对照的CM-Dil标记的斑马鱼MCF-7移植模型的荧光图像,红色为乳腺癌MCF-7细胞;(B)不同组的异种移植斑马鱼肿瘤生长抑制率的直方图;(C)异种移植斑马鱼荧光强度的定量分析;结果以平均±标准差(n=10)表示;***P<值为0.001,与对照组相比。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1 5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((3-三苯基膦-1)-丙酸)-甲酯(4a,EP-TPP-a)的制备
(1)中间体5α,8α-过氧化麦角甾醇(2)的制备:
将麦角甾醇(10.0g,23mmol)和荧光桃红B(200mg)共溶于1000mL甲醇中,持续向反应体系中通入高纯氧(氧气流量为5L/分钟)并设计光照条件(500W钨丝灯),反应体系在冰水浴下旋转搅拌1h,薄层色谱法监测反应过程。反应结束后,旋转蒸发仪除去甲醇溶液,剩余体系中加入等体积的二氯甲烷和蒸馏水(500mL二氯甲烷和500mL蒸馏水)萃取,分离有机相,用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥后旋干,用硅胶柱层析法提纯粗产物,冲柱展开剂比例为V石油醚:V乙酸乙酯=5:1。最终得到中间体2白色固体,产率80%。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.50(d,J=8.4Hz,1H,C7-H),6.24(d,J=8.4Hz,1H,C6-H),5.23(dd,J=7.6,15.2Hz,1H,C23-H),5.12(dd,J=8.0,15.2Hz,1H,C22-H),3.97(m,1H,C3-H),1.00(d,J=6.4Hz,3H,C18-H),0.91(d,J=6.9Hz,3H,C28-H),0.89(s,3H,C21-H),0.84(d,J=6.8Hz,3H,C26-H),0.83(s,3H,C19-H),0.82(d,J=6.8Hz,3H,C27-H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ135.4(C22),135.2(C6),132.3(C23),130.7(C7),82.2(C5),79.4(C8),66.4(C3),56.2(C17),51.7(C14),51.1(C9),44.6(C13),42.8(C24),39.7(C12),39.3(C20),37.0(C10),34.7(C4),33.1(C25,),30.1(C1),28.6(C2),26.5(C16),23.4(C15),20.9(C-11),20.6(C21),19.9(C26),19.6(C27),18.2(C19),17.6(C28),12.9(C18).
(2)中间体5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((3-溴丙酸)-1)-甲酯(3a)的制备
将中间体2(1mmol)和3-溴丙酸(1.5mmol)共同溶解在二氯甲烷(15mL)中,加入DMAP(0.1mmol)和EDCI(1.5mmol)作为催化剂。混合物在室温下搅拌4-6h,直到中间体2完全消失。反应结束后,反应体系用等体积的二氯甲烷和蒸馏水萃取,分离有机相,用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥后旋干,用硅胶柱层析法提纯粗产物,冲柱展开剂比例为V石油醚:V乙酸乙酯=10:1。最终得到中间体2白色固体,产率64%。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ6.51(d,J=8.4Hz,1H,C7-H),6.23(d,J=8.4Hz,1H,C6-H),5.22(dd,J=15.2,7.7Hz,1H,C23-H),5.14(dd,J=15.3,8.3Hz,1H,C23-H),5.00(m,1H,C3-H),3.41(t,J=6.6Hz,2H,C3’-CH2),2.30(t,J=7.3Hz,2H,C2’-CH2),2.12(dd,J=14.6,4.3Hz,1H),2.04-1.99(m,3H),1.90-1.87(m,2H),1.84(s,1H),1.77(d,J=7.6Hz,2H),1.70(d,J=13.6Hz,1H),1.58(d,J=11.2Hz,2H),1.51(d,J=6.7Hz,2H),1.47(d,J=6.5Hz,1H),1.37(d,J=9.6Hz,1H),1.25(d,J=6.5Hz,2H),1.23(d,J=4.4Hz,2H),1.00(d,J=6.6Hz,3H,C18-H),0.92-0.89(m,6H,C28-H,C21-H),0.84-0.80(m,9H,C-19H,C26-H,C27-H).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ172.2(C1’),135.2(C22),135.1(C6),132.3(C23),130.9(C7),81.7(C5),79.4(C8),69.5(C3),56.2(C17),51.6(C14),51.0(C9),44.6(C13),42.8(C24),39.7(C12),39.3(C20),37.0(C10),34.3(C4),33.5(C2’),33.1(C5),32.0(C1),28.6(C2,C3’),26.3(C16),23.5(C15),20.9(C11),20.6(C21),20.0(C26),19.6(C27),18.1(C19),17.6(C28),12.9(C18).MS(ESI)m/z,[M+H]+563.3.
(3)目标产物5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((3-三苯基膦-1)-丙酸)-甲酯(4a)的制备
将中间体3a(1mmol)、三苯基膦(10mmol)和20mL无水乙醇共置于50mL烧瓶中,混合物在80℃下回流搅拌反应48-72h。TLC跟踪反应过程至反应完全。反应后蒸发溶剂,用乙醚(5mL×3)洗涤沉淀,得到终产物4a为棕色粉末。产率70%。熔点:130-133℃。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=12.7,7.7Hz,6H,Ar-H),7.75(t,J=8.5Hz,3H,Ar-H),7.66(td,J=7.7,3.4Hz,6H,Ar-H),6.46(d,J=8.5Hz,1H,C7-H),6.16(d,J=8.5Hz,1H,C6-H),5.20(dd,J=15.2,7.7Hz,1H,C23-H),5.11(dd,J=15.3,8.4Hz,1H,C22-H),4.53(m,1H,C3-H),4.28(s,1H,C3’-H),4.00(s,1H,C3’-H),3.10(s,1H,C2’-H),2.91(s,1H,C2’-H),1.99(s,1H),1.91(s,1H),1.83(s,4H),1.71(s,1H),1.66(s,1H),1.60(d,J=13.4Hz,1H),1.55(s,1H),1.53(s,1H),1.46(s,1H),1.43(s,1H),1.41(s,1H),1.39(s,1H),1.36(s,1H),1.23(s,2H),1.20(s,1H),1.18(s,1H),0.97(d,J=6.7Hz,3H,C18-H),0.88(d,J=6.9Hz,3H,C28-H),0.80(dd,J=6.3,3.6Hz,9H,C21-H,C26-H,C27-H),0.78(d,J=3.5Hz,3H,C19-H).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ170.0(C1’),135.1(Ar-4),134.0(Ar-3),133.9(C22),132.4(C6),130.9(C23),130.6(Ar-2),130.5(C7),118.5(Ar-1),81.8(C5),79.6(C8),70.9(C3),56.3(C17),51.7(C14),51.1(C9),44.7(C13),42.9(C24),39.8(C12),39.3(C20),37.0(C10),34.2(C4),33.1(C25,2’),29.8(C1),28.7(C2),26.0(C16),23.4(C15),20.9(C3’),20.7(C11),20.0(C21),19.7(C26),18.1(C27),17.7(C19),14.2(C28),12.9(C18).HRMS(ESI)m/z,Calcd.for C49H62BrO4P:[M+H]+825.3647,found:825.3641.
实施例2 5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((4-三苯基膦-1)-丁酸)-甲酯(4b,EP-TPP-b)的制备
(1)同实施实施例1的(1)。
(2)中间体5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((4-溴丁酸)-1)-甲酯(3b)的制备
将中间体2(1mmol)和4-溴丁酸(1.5mmol)共同溶解在二氯甲烷(15mL)中,加入DMAP(0.1mmol)和EDCI(1.5mmol)作为催化剂。混合物在室温下搅拌4-6h,直到中间体2完全消失。反应结束后,反应体系用等体积的二氯甲烷和蒸馏水萃取,分离有机相,用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥后旋干,用硅胶柱层析法提纯粗产物,冲柱展开剂比例为V石油醚:V乙酸乙酯=10:1。最终得到中间体3b白色固体,产率84%。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ6.44(d,J=8.5Hz,1H,C7-H),6.16(d,J=8.5Hz,1H,C6-H),5.15(dd,J=15.3,7.6Hz,1H,C23-H),5.08(dd,J=15.2,8.4Hz,1H,C22-H),4.97(m,1H,C3-H),3.39(t,J=6.4Hz,2H,C4’-CH2),2.39(t,J=7.2Hz,2H,C2’-CH2),2.11(m,2H,C3’-CH2),2.05(d,J=3.5Hz,1H),1.95(s,2H),1.88(d,J=8.8Hz,2H),1.78(q,J=6.8Hz,1H),1.68(d,J=9.6Hz,1H),1.63(d,J=13.6Hz,1H),1.54-1.48(m,3H),1.44(d,J=8.3Hz,2H),1.40(m,1H),1.36(m,1H),1.30(d,J=9.8Hz,1H),1.20-1.15(m,3H),1.14(d,J=9.0Hz,1H),0.93(d,J=6.7Hz,3H,C18-H),0.84(d,J=8.4Hz,6H,C28-H,C21-H),0.77(s,3H,C-19H),0.75(d,J=3.1Hz,3H,C26-H),0.74(d,J=3.1Hz,3H,C27-H).13CNMR(150MHz,Chloroform-d)δ170.6(C1’),134.2(C22),134.0(C6),131.3(C23),129.9(C7),80.7(C5),78.4(C8),68.7(C3),55.2(C17),50.6(C14),50.0(C9),43.5(C13),41.8(C24),38.7(C12),38.3(C20),35.9(C10),33.3(C4),32.2(C4’),32.0(C25),31.8(C2’),31.7(C1),27.6(C3’),26.7(C2),25.3(C16),22.4(C15),19.9(C11),19.6(C21),18.9(C26),18.6(C27),17.1(C19),16.6(C28),11.9(C18).MS(ESI)m/z,[M+H]+577.3.
(3)目标产物5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((4-三苯基膦-1)-丁酸)-甲酯(EP-TPP-b)的制备
将中间体3b(1mmol)、三苯基膦(10mmol)和20mL无水乙醇共置于50mL烧瓶中,混合物在80℃下回流搅拌反应48-72h。TLC跟踪反应过程至反应完全。反应后蒸发溶剂,用乙醚(5mL×3)洗涤沉淀,得到终产物4b,即EP-TPP-b为棕色粉末。产率82%。熔点:139-143℃。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.82(dd,J=12.7,7.7Hz,6H,Ar-H),7.76-7.73(m,3H,Ar-H),7.65(td,J=7.6,3.2Hz,6H,Ar-H),6.46(d,J=8.5Hz,1H,C7-H),6.19(d,J=8.5Hz,1H,C6-H),5.18(dd,J=15.2,8.5Hz,1H,C23-H),5.10(dd,J=15.2,8.5Hz,1H,C22-H),4.92(m,1H,C3-H),3.92(s,2H,C4’-H),2.80(s,2H,C2’-H),2.06(d,J=13.8Hz,1H),1.97(d,J=12.0Hz,2H),1.92(d,J=10.2Hz,2H),1.85(d,J=10.9Hz,2H),1.81(d,J=6.8Hz,2H,C3’-H),1.70(d,J=9.2Hz,1H),1.65(d,J=13.7Hz,1H),1.55(s,1H),1.53(s,1H),1.51(s,1H),1.46(s,1H),1.44(s,1H),1.41(s,1H),1.35(s,1H),1.32(s,1H),1.22(s,2H),1.18(d,J=3.7Hz,2H),0.96(d,J=6.6Hz,3H,C18-H),0.87(d,J=6.8Hz,3H,C28-H),0.85(s,3H,C21-H),0.80-0.77(m,9H,C-19H,C26-H,C27-H).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ171.3(C1’),134.0(Ar-4),132.8(Ar-3),132.7(C22),131.3(C6),129.8(C23),129.5(Ar-2),129.4(C7),117.5(Ar-1),80.8(C5),78.4(C8),68.8(C3),55.2(C17),50.6(C14),50.1(C9),43.6(C13),41.8(C24),38.7(C12),38.3(C20),35.9(C10),33.3(C4),32.0(C2’),28.7(C25),27.6(C1),25.2(C2),22.3(C16),21.6(C15),20.7(C4’),20.3(C3’),19.9(C11),19.6(C21),18.9(C26),18.6(C27),17.1(C19),16.6(C28),11.9(C18).HRMS(ESI)m/z,Calcd.for C50H6EP-TPP-brO4P:[M+H]+839.3804,found:839.3800.
实施例3 5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((5-三苯基膦-1)-戊酸)-甲酯(4c,EP-TPP-c)的制备
(1)同实施实施例1的(1)。
(2)中间体5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((5-溴戊酸)-1)-甲酯(3c)的制备
将中间体2(1mmol)和5-溴戊酸(1.5mmol)共同溶解在二氯甲烷(15ml)中,加入DMAP(0.1mmol)和EDCI(1.5mmol)作为催化剂。混合物在室温下搅拌4-6h,直到中间体2完全消失。反应结束后,反应体系用等体积的二氯甲烷和蒸馏水萃取,分离有机相,用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥后旋干,用硅胶柱层析法提纯粗产物,冲柱展开剂比例为V石油醚:V乙酸乙酯=10:1。最终得到中间体3c白色固体,产率87%。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ6.51(d,J=8.5Hz,1H,C7-H),6.23(d,J=8.5Hz,1H,C6-H),5.22(dd,J=15.3,8.5Hz,1H,C23-H),5.14(dd,J=15.3,8.5Hz,1H,C22-H),5.00(m,1H,C3-H),3.41(t,J=6.6Hz,2H,C5’-CH2),2.30(t,J=7.3Hz,2H,C2’-CH2),2.12(d,J=11.8Hz,1H),2.01(s,2H),1.95(d,J=9.0Hz,2H),1.88(d,J=8.2Hz,2H,C4’-CH2),1.85(d,J=6.6Hz,1H),1.77(d,J=7.4Hz,2H,C3’-CH2),1.75(s,1H),1.70(d,J=13.6Hz,1H),1.61-1.54(m,3H),1.51(d,J=7.1Hz,2H),1.46(s,1H),1.40(s,1H),1.35(d,J=10.3Hz,1H),1.27-1.19(m,4H),1.00(d,J=6.6Hz,3H,C18-H),0.91(d,J=8.8Hz,6H,C28-H,C21-H),0.84-0.81(m,9H,C-19H,C26-H,C27-H).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ172.2(C1’),135.2(C22),135.1(C6),132.3(C23),130.9(C7),81.7(C5),79.4(C8),69.5(C3),56.2(C17),51.6(C14),51.0(C9),44.6(C13),42.8(C24),39.7(C12),39.3(C20),37.0(C10),34.3(C4),33.5(C5’),33.2(C2’),33.1(C25),33.1(C4’),32.0(C1),28.6(C2),26.3(C16),23.5(C15),23.4(C3’),20.9(C11),20.6(C21),20.0(C26),19.6(C27),18.1(C19),17.6(C28),12.9(C18).MS(ESI)m/z,[M+H]+591.3.
(3)目标产物5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((5-三苯基膦-1)-戊酸)-甲酯(4c)的制备
将中间体3c(1mmol)、三苯基膦(10mmol)和20mL无水乙醇共置于50mL烧瓶中,混合物在80℃下回流搅拌反应48-72h。TLC跟踪反应过程至反应完全。反应后蒸发溶剂,用乙醚(5mL×3)洗涤沉淀,得到终产物4c为棕色粉末。产率85%。熔点:151-154℃。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.81-7.79(m,6H,Ar-H),7.71(d,J=4.3Hz,6H,Ar-H),7.65(s,1H,Ar-H),7.56(s,1H,Ar-H),7.48(s,1H,Ar-H),6.50(d,J=8.5Hz,1H,C7-H),6.21(d,J=8.5Hz,1H,C6-H),5.23(dd,J=15.2,8.4Hz,1H,C23-H),5.15(dd,J=15.2,8.4Hz,1H,C22-H),4.87(m,1H,C3-H),4.13(t,J=7.1Hz,2H,C5’-CH2),2.36(t,J=6.5Hz,2H,C2’-CH2),2.22(d,J=7.1Hz,1H),1.99(d,J=8.1Hz,2H),1.95(d,J=6.2Hz,2H),1.85(d,J=6.6Hz,1H),1.76(s,1H),1.70(d,J=7.8Hz,2H,C3’-CH2),1.68(s,1H),1.57(t,J=17.2Hz,3H),1.50(m,2H),1.46(d,J=6.6Hz,1H),1.40(d,J=5.1Hz,1H),1.37(s,1H),1.27(s,1H),1.25(d,J=7.0Hz,3H),1.23(d,J=7.2Hz,2H,C4’-CH2),1.00(d,J=6.6Hz,3H,C18-H),0.91(d,J=6.8Hz,3H,C28-H),0.88(s,3H,C21-H),0.83(dd,J=8.5,5.3Hz,9H,C-19H,C26-H,C27-H).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ172.4(C1’),135.1(Ar-4),133.7(Ar-3),132.3(C22),132.1(C6),130.8(C23),130.6(Ar-2),128.6(C7),118.6(Ar-1),81.8(C5),79.5(C8),69.4(C3),56.2(C17),51.6(C14),51.0(C9),44.6(C13),42.8(C24),39.7(C12),39.3(C20),36.9(C10),34.3(C4),33.4(C2’),33.1(C25),33.0(C1),28.6(C2),26.2(C16),23.3(C15),22.3(C5’),21.7(C4’),21.4(C3’),20.9(C11),20.6(C21),19.9(C26),19.6(C27),18.1(C19),17.6(C28),12.9(C18).HRMS(ESI)m/z,Calcd.for C51H66BrO4P:[M+H]+853.3960,found:853.3959.
实施例4 5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((6-三苯基膦-1)-己酸)-甲酯(4d,EP-TPP-d)的制备
(1)同实施实施例1的(1)。
(2)中间体5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((6-溴己酸)-1)-甲酯(3d)的制备
将中间体2(1mmol)和6-溴己酸(1.5mmol)共同溶解在二氯甲烷(15mL)中,加入DMAP(0.1mmol)和EDCI(1.5mmol)作为催化剂。混合物在室温下搅拌4-6h,直到中间体2完全消失。反应结束后,反应体系用等体积的二氯甲烷和蒸馏水萃取,分离有机相,用饱和食盐水和无水硫酸钠干燥后旋干,用硅胶柱层析法提纯粗产物,冲柱展开剂比例为V石油醚:V乙酸乙酯=10:1。最终得到中间体3d白色固体,产率95%。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ6.51(d,J=8.5Hz,1H,C7-H),6.23(d,J=8.5Hz,1H,C6-H),5.22(dd,J=15.2,7.7Hz,1H,C23-H),5.14(dd,J=15.3,8.4Hz,1H,C22-H),5.00(m,1H,C3-H),3.40(t,J=6.7Hz,2H,C6’-CH2),2.28(t,J=7.4Hz,2H,C2’-CH2),2.12(dd,J=13.6,5.4Hz,1H),2.01(s,2H),1.94(d,J=8.2Hz,2H),1.87(d,J=7.5Hz,2H),1.85(d,J=6.8Hz,2H,C5’-CH2),1.74(s,1H),1.71(s,1H),1.63(d,J=7.8Hz,2H,C3’-CH2),1.60-1.55(m,3H),1.51(d,J=9.1Hz,2H),1.47(d,J=3.7Hz,2H,C4’-CH2),1.45(s,1H),1.40(s,1H),1.35(d,J=10.3Hz,1H),1.27-1.19(m,4H),1.00(d,J=6.6Hz,3H,C18-H),0.90(s,6H,3H,C28-H,C28-H),0.84-0.81(m,9H,3H,C-19H,C26-H,C27-H).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ172.5(C1’),135.2(C22),135.2(C6),132.3(C23),130.9(C7),81.7(C5),79.4(C8),69.4(C3),56.2(C17),51.6(C14),51.0(C9),44.5(C13),42.8(C24),39.7(C12),39.3(C20),36.9(C10),34.3(C4),33.5(C6’),33.2(C25),33.0(C2’),32.4(C5’),28.6(C1),27.6(C2),26.3(C16,C4’),24.1(C3’),23.4(C15),20.9(C11),20.6(C21),19.9(C26),19.6(C27),18.1(C19),17.6(C28),12.9(C18).MS(ESI)m/z,[M+H]+605.3.
(3)目标产物5α,8α-过氧化麦角甾醇-3-((6-三苯基膦-1)-己酸)-甲酯(4d)的制备
将中间体3d(1mmol)、三苯基膦(10mmol)和20mL无水乙醇共置于50mL烧瓶中,混合物在80℃下回流搅拌反应48-72h。TLC跟踪反应过程至反应完全。反应后蒸发溶剂,用乙醚(5mL×3)洗涤沉淀,得到终产物4d为棕色粉末。产率81%。熔点:135-138℃。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.77(d,J=12.7Hz,6H,Ar-H),7.72(s,3H,Ar-H),7.64(s,6H,Ar-H),6.43(d,J=8.5Hz,1H,C7-H),6.16(d,J=8.5Hz,1H,C6-H),5.15(dd,J=15.2,8.5Hz,1H,C23-H),5.07(dd,J=15.2,8.5Hz,1H,C22-H),4.85(m,1H,C3-H),3.77(s,2H,C6’-CH2),2.17(s,2H,C2’-CH2),1.98(d,J=5.5Hz,1H),1.94(d,J=12.2Hz,2H),1.89(d,J=15.4Hz,2H),1.80(s,1H),1.78(d,J=6.8Hz,2H,C3’-CH2),1.64(m,2H),1.60(s,1H),1.57(s,2H),1.53-1.50(m,3H),1.48(d,J=6.6Hz,2H,C4’-CH2),1.42(d,J=10.6Hz,2H),1.39(s,1H),1.30(dd,J=19.1,9.3Hz,2H),1.18(d,J=11.1Hz,2H,C5’-CH2),1.14(d,J=6.3Hz,3H),1.03(s,1H),0.93(d,J=6.5Hz,3H,C18-H),0.85-0.82(m,6H,C28-H,C21-H),0.77-0.74(m,9H,C-19H,C26-H,C27-H).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ171.8(C1’),134.2(C22),134.0(Ar-4),132.6(Ar-3),131.3(C6),129.8(C23),129.5(Ar-2),117.7(C7),117.1(Ar-1),80.8(C5),78.4(C8),68.3(C3),55.1(C17),50.6(C14),50.0(C9),43.5(C13),41.7(C24),38.7(C12),38.3(C20),35.9(C10),33.3(C4),32.9(C2’),32.1(C25),32.0(C1),28.7(C4’),27.6(C2),25.2(16),23.3(15),22.3(C6’),21.9(C5’),21.5(C3’),19.8(C11),19.6(C21),18.9(C26),18.6(C27),17.1(C19),16.5(C28),11.8(C18).HRMS(ESI)m/z,Calcd.for C52H68BrO4P:[M+H]+867.4117,found:867.4110.
实施例5实施例1-4制备的新型5α,8α-过氧化麦角甾醇偶联三苯基膦衍生物EP-TPP-(a-d)的抗肿瘤活性测试
(1)选取受试细胞及阳性对照品
选取三苯基膦(TPP)、5α,8α-过氧化麦角甾醇(EP)和顺铂(Cisplatin)作为阳性对照。
选取HepG2(人肝癌细胞系)、MCF-7(人乳腺癌细胞系)、HeLa(人宫颈癌细胞系)和GES-19(正常人胃细胞系)作为受试细胞。
(2)具体实验方法
四氮唑盐还原(MTT)法:收集对数生长期的肿瘤细胞,接种于96孔培养板,每孔细胞数为1.0×105/100μL,置于37℃、5% CO2培养箱培养,次日去掉培养基,加入不同浓度化合物100μL(化合物浓度采用对倍稀释,每一个化合物设置5~6个浓度,每一测试设3个平行孔,重复3次),阴性对照组不加药物,48h后,每孔加入MTT 10μL,继续培养4h,再每孔加入DMSO 100μL终止反应,常温放置1h,用酶标仪检测每孔在492nm处的吸光度OD值,计算细胞生长抑制率。
药物对细胞的生长抑制率(%)=(溶剂对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值,然后根据不同药物浓度对细胞的生长抑制率(%)计算药物的IC50。
(3)化合物EP-TPP-(a-d)的抗肿瘤活性测试实验结果
测定结果如下表1所示。
在所测试的三种肿瘤细胞系中,MCF-7和HepG2细胞系对这些衍生物的致死作用相对更为敏感。在HepG2细胞系中,所有四种化合物EP-TPP-(a-d)均表现出显著的细胞毒性作用,半抑制浓度值范围为2.11~9.34μM。在MCF-7细胞系中,所有四种化合物均表现出显著的细胞毒性,半抑制浓度范围为2.04~6.87μM。在HeLa细胞系中,所有四种化合物也表现出显著的细胞毒性,半抑制浓度值在4.65~8.74μM之间。
在所有四种衍生物中,化合物EP-TPP-a、EP-TPP-b和EP-TPP-c对所有三种癌细胞的活性均高于过氧麦角甾醇母体。此外,化合物EP-TPP-a和EP-TPP-b对MCF-7和HepG2细胞系表现出了相似的细胞毒性。化合物EP-TPP-b在MCF-7细胞系中的活性比过氧化麦角甾醇高9.70倍,对5α,8α-过氧化麦角甾醇(EP-TPP-b:SI=IC50 GES-1/IC50 MCF-7=2.46)具有良好的选择性(EP:SI=IC50 GES-1/IC50 MCF-7=4.04)。
构-效关系(SAR)分析表明,碳链的长度可以影响所有这些衍生物的细胞毒性作用。化合物EP-TPP-a和EP-TPP-b在一个含有3个或4个碳的连接体中,比EP-TPP-c或EP-TPP-d具有更好的生物能力。我们可以将EP-TPP-b作为先导化合物,进行药理学和作用机制方面的研究。
表1化合物EP-TPP-(a-d)的体外抗肿瘤活性
注:a IC50:抑制50%细胞生长的受试化合物的浓度。上表所有数据均为三个独立实验的平均值±SD。b SI:GES-1(IC50)/MCF-7(IC50)。“–”:未测试。
实施例6AO/EB双荧光染色检测化合物EP-TPP-b诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡
(1)实验方法:
取处于对数生长期的MCF-7细胞,按1×106/孔接种于对应的6孔板,每孔加含10%FBS的L-15培养液2mL,待细胞融合度达85%时,弃去上清液,分别加入相应体积的EP-TPP-b(浓度分别1、2、4μmol/L),每组设3个复孔,0μmol/L为对照组(Control),继续培养24h。加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞2次,加入500μL染色缓冲液。分别加入5μL AO染色液和5μL EB染色液,十字混匀后4℃避光孵育20min。染色缓冲液洗去多余染液,荧光显微镜下观察,拍照。
(2)实验结果:
如图1所示,实验结果表明,化合物EP-TPP-b处理过的MCF-7细胞经染色后,细胞形态出现明显的变化,产生了明显的亮红色核囊泡和核收缩,且呈剂量依赖性。未处理细胞的形态几乎完整,并染成亮绿色。从细胞形态来看,随化合物EP-TPP-b浓度的增加,肿瘤细胞凋亡量逐渐增加,且呈浓度依赖性。
实施例7AnnexinV-FITC/PI双染法检测化合物EP-TPP-b诱导MVF-7细胞凋亡
(1)实验方法:
取处于对数生长期的MCF-7细胞,按1×106/孔接种于对应的6孔板,每孔加含10%FBS的L-15培养液2mL,待细胞融合度达85%时,弃去上清液,分别加入相应体积的6k(浓度分别1、2、4μmol/L),每组设3个复孔,0μmol/L为对照组(Control),继续培养24h。加2mL PBS洗细胞,0.25%胰酶消化,收集细胞,800r/min离心5min,得沉淀,再用细胞结合缓冲液冲洗细胞,800r/min离心5min,弃上清留沉淀。加入100μL结合缓冲液重悬细胞转移置流式检测管中,加入5μL AnnexinV-FITC,避光,室温孵育15min后,800r/min离心5min,舍弃染液。加入100μL结合缓冲液重悬,加入5μL PI染液,避光混匀,室温孵育20min。800r/min离心5min,弃上清留沉淀,再加入400mL膜联蛋白结合缓冲液,混匀。用FACS Calibur流式细胞仪定量分析。
(2)实验结果:
如图2所示,实验结果显示,分别用浓度为0、1、2、4μM的EP-TPP-b处理受试细胞24h后,受试细胞的凋亡百分比从4.87%显著增加到20.18%,而对照组仅为1.14%。
实施实例8化合物EP-TPP-b诱导人乳腺癌MCF-7细胞线粒体膜电位去极化检测
(1)实验方法:
取处于对数生长期的MCF-7细胞,按1×106/孔接种于对应的6孔板,每孔加含10%FBS的L-15培养液2mL,待细胞融合度达85%时,弃去上清液,分别加入相应体积的EP-TPP-b(浓度分别1、2、4μmol/L),每组设3个复孔,0μmol/L为对照组(Control),继续培养24h。加2mL PBS洗细胞,0.25%胰酶消化,收集细胞,800r/min离心5min,得沉淀,再用细胞结合缓冲液冲洗细胞,800r/min离心5min,弃上清留沉淀。用移液器向每个离心管中加入1mL预先配置好的JC-1染色工作液,吹匀后放置37℃无二氧化碳培养箱中染色30min,每间隔5min混匀一次。染色结束后,超低温离心机1000r/min离心5min,去上清留沉淀。再加入预先配制好的JC-1洗涤液(1×)反复洗涤两次,小心去除洗涤液,每管加500μL基础培养基重悬细胞并转移至流式管中,避光保存备用。流式细胞仪上机检测。
(2)实验结果:
如图3所示,实验结果显示,在浓度为1、2和4μmol/L时,化合物EP-TPP-b诱导乳腺癌MCF-7细胞去极化细胞群呈剂量依赖性增加,从对照组的3.50%分别增加到5.90%、12.70%和33.48%,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05),证明经化合物EP-TPP-b作用后的乳腺癌MCF-7细胞线粒体膜电位呈现下降趋势。
实施例9化合物EP-TPP-b诱导人乳腺癌MCF-7细胞活性氧(ROS)生成水平检测
(1)实验方法:
取处于对数生长期的MCF-7细胞,按1×106/孔接种于对应的6孔板,每孔加含10%FBS的L-15培养液2mL,待细胞融合度达85%时,弃去上清液,分别加入相应体积的EP-TPP-b(浓度分别1、2、4μmol/L),每组设3个复孔,0μmol/L为对照组(Control),继续培养24h。加2mL PBS洗细胞,0.25%胰酶消化,收集细胞,800r/min离心5min,得沉淀,再用细胞结合缓冲液冲洗细胞,800r/min离心5min,弃上清留沉淀。将浓度为10μmol/L的DCFH-DA染色液加入各离心管,在细胞培养箱内避光孵育30min,每间隔5min混匀一次。染色结束后,1000r/min离心5min,去上清留沉淀,用无血清L-15培养液清洗细胞3次,除掉未装载进入细胞的DCFH-DA。用移液枪将悬液转移至流式管中,避光保存备用。流式细胞仪分析细胞ROS含量变化。
(2)实验结果:
如图4所示,实验结果表明,化合物EP-TPP-b能显著诱导ROS生成,与对照组相比,EP-TPP-b在4μM时可使MCF-7细胞内的活性氧水平提高约19%。
实施例10化合物EP-TPP-b对斑马鱼MCF-7移植模型的抗肿瘤作用检测
(1)实验方法:
①样品配制:
化合物EP-TPP-b,用DMSO配制成20.0mM母液,按需稀释,-20℃储存。麦角甾醇过氧化物(EP),用DMSO配制成15.0mM母液,-20℃储存。
阳性对照:顺铂,黄色粉末,批号A2214408,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,阴凉储存。用100% DMSO配制成50.0mM母液,-20℃避光分装储存。
②实验动物:
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质:每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐,电导率为450~550μS/cm;pH为6.5~8.5;硬度为50~100mg/L CaCO3),由本公司养鱼中心繁殖提供,实验动物使用许可证号为:SYXK(浙)2022-0004,饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号:001458)的要求。野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天(3dpf)的斑马鱼用于样品抗肿瘤生长功效最大检测浓度(MTC)测定;年龄为2dpf的斑马鱼用于样品抗肿瘤生长功效评价。人乳腺癌(MCF-7)细胞,DMEM培养基,含10%胎牛血清,加1%双抗,37℃、5%CO2条件下培养。
③MTC测定:
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中,每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外,其余各浓度组均水溶给予EP-TPP-b(浓度为1.25、2.50、5.00、10.0和20.0μM),同时设置正常对照组,每孔容量为3mL。35℃处理2天后,测定EP-TPP-b对正常斑马鱼的MTC。
④抗肿瘤生长功效评价:
使用CM-DiI标记人乳腺癌(MCF-7)细胞,以显微注射的方式移植到2dpf野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约200个细胞,建立斑马鱼肿瘤移植模型。将模型斑马鱼放置35℃培养至3dpf。3dpf时,在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼,随机分配至6孔板中,每孔30尾。水溶给予EP-TPP-b(浓度为0.625μM、1.25μM和2.5μM)和麦角甾醇过氧化物(EP,15.0μM),阳性对照顺铂50.0μM浓度,同时设置模型对照组,每孔容量为3mL。35℃处理2天后,每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照,使用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据,分析人肝癌细胞荧光强度,以该指标的统计学分析结果评价EP-TPP-b和麦角甾醇过氧化物(EP)抗肿瘤生长功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析,P<0.05表明差异具有统计学意义。
(2)实验结果:
当化合物EP-TPP-b的浓度在2.5μM时,未观察到如异常体翻和心包水肿等不良情况。如图5所示,在斑马鱼的乳腺癌MCF-7细胞异种移植模型中,不同浓度的EP-TPP-b(0.625、1.25和2.5μM)能显著抑制乳腺癌肿瘤的生长。值得注意的是,在低浓度0.625μM下,化合物EP-TPP-b仍能有效抑制斑马鱼异种移植物MCF-7细胞的增殖,在15.0μM时的作用高于EP。
上述EP-TPP类抗肿瘤药物在体外和体内的抗肿瘤作用测试结果显示:在MTT测试中,EP-TPP-(a-d)对人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌HeLa细胞均表现出了显著的抑制作用,它们的抗肿瘤活性普遍优于先导化合物5α,8α-过氧化麦角甾醇,且对人体正常细胞表现出一定的选择性。在体外实验中,通过倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪术发现,EP-TPP-b能够通过增加人乳腺癌MCF-7细胞线粒体细胞膜电位去极化、增加肿瘤细胞内活性氧水平等方式诱导人乳腺癌MCF-7细胞细胞凋亡。在体内实验中,EP-TPP-b能够明显抑制斑马鱼体内肿瘤组织的增殖。
综上所述,本发明以麦角甾醇过氧化物为先导化合物,以麦角甾醇为原料,首先完成了5α,8α-过氧化麦角甾醇的合成方法,弥补了5α,8α-过氧化麦角甾醇天然产物产量不足的缺点;然后在拼合原理的指导下,将具有线粒体靶向功能的三苯基膦与5α,8α-过氧化麦角甾醇结合,设计并合成了一系列具有临床抗肿瘤应用潜力的新型5α,8α-过氧化麦角甾醇衍生物。抗肿瘤作用研究表明,合成的目标产物EP-TPP-(a-d)在体外或体内实验中均表现出了显著的抗肿瘤活性,具有临床应用的潜力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
2.一种权利要求1所述的一类线粒体靶向的抗肿瘤化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以麦角甾醇为起始原料,将所述麦角甾醇和光敏剂共同溶解后,在冰水浴的条件下持续向反应体系中通入氧气并设置为光照条件,之后所述反应体系在室温下搅拌反应,制得中间体2;
(2)将所述中间体2和溴代烷基羧酸共同溶解后,加入催化剂和缩合剂,室温搅拌反应,制得中间体3;
(3)将所述中间体3与三苯基膦共同溶解后,加热回流反应,反应结束后,蒸发溶剂、洗涤沉淀,制得终产物。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,反应溶剂为吡啶、N,N-二甲基甲酰胺或甲醇中的任意一种;所述光敏剂包括荧光桃红B、曙红Y或孟加拉玫红中的任意一种;
所述光照条件为500W照射;所述搅拌反应的时间为1-2h。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述麦角甾醇和光敏剂的质量比为1:(0.01-0.03)。
5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,反应溶剂包括二氯甲烷;所述溴代烷基羧酸包括3-溴丙酸、4-溴丁酸、5-溴戊酸和6-溴己酸;所述催化剂和缩合剂包括如下任一项的组合:DMAP和EDCI、DMAP和DCC、DMAP和DIC以及HATU和DIPEA;
所述室温搅拌反应的时间为4-6h。
6.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述中间体2、溴代烷基羧酸、催化剂、缩合剂的反应投料摩尔比为1:(1.2-2.0):(0.1-0.3):(1.2-2.0)。
7.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,反应溶剂为甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、正丁醇、四氢呋喃或乙腈中的任意一种;
反应条件为:80℃下回流搅拌反应48-72h。
8.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述中间体3与三苯基膦的反应投料摩尔比为1:(5-15)。
9.一种线粒体靶向的抗肿瘤药物,其特征在于,所述抗肿瘤药物的成分包括权利要求1所述的化合物、或者所述化合物的立体异构体、前体药物和在药学上可接受的盐。
10.如权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述肿瘤包括人肝癌细胞系、人乳腺癌细胞系或人宫颈癌细胞系。
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