WO2019072045A1 - 一种cd169高亲和力抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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WO2019072045A1
WO2019072045A1 PCT/CN2018/103238 CN2018103238W WO2019072045A1 WO 2019072045 A1 WO2019072045 A1 WO 2019072045A1 CN 2018103238 W CN2018103238 W CN 2018103238W WO 2019072045 A1 WO2019072045 A1 WO 2019072045A1
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tumor
high affinity
tcc
solvent
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闫旭
韩绪春
王先武
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厦门诺康得生物科技有限公司
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the invention relates to antitumor compounds, in particular to a CD169 high affinity antitumor compound and a preparation method and application thereof.
  • Tumors are an important issue that threatens human health.
  • various methods have been studied for tumor killing and anti-tumor drugs and methods.
  • various chemotherapeutic drugs developed using the characteristics of tumor metabolism higher than normal tissues; monoclonal antibodies using tumor surface specific markers, such as Herceptin.
  • monoclonal antibodies using tumor surface specific markers, such as Herceptin.
  • people have begun to use the immune checkpoint inhibitors of the body's own immune system to conduct anti-tumor research, such as targeting various antibodies and small molecule inhibitors of PD1 and PDL-1. The research has achieved great results and is an important direction for anti-tumor in the future.
  • Macrophages play an important role in the body's immune system. Macrophages not only directly phagocytose tumor cells, but also transmit fragments of phagocytic tumor cells to other immune cells, activate the body's own immune system, and carry out anti-tumor responses.
  • SIGLEC Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins
  • SIGLEC-1 also known as CD169
  • SIGLEC-1 is mainly distributed on the surface of macrophages.
  • SIGLEC1 is highly homologous in mouse and human, and therefore specifically binds to the N-acetylneuraminic acid trisaccharide sequence (Neu5Ac ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc), wherein Neu5AC stands for N-acetylneuraminic acid and Gal stands for half Lactose, GlcNAc stands for N-acetylglucosamine, and ⁇ 2-3 and ⁇ 1-4 are chemical bond linkages.
  • N-acetylneuraminic acid trisaccharide sequence (Neu5Ac ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc)
  • Neu5AC stands for N-acetylneuraminic acid and Gal stands for half Lactose
  • GlcNAc stands for N-acetylglucosamine
  • ⁇ 2-3 and ⁇ 1-4 are chemical bond linkages.
  • SIGLEC1 binds to natural sialic acid sugar ligands with low affinity.
  • the present invention provides a CD169 high affinity antitumor compound comprising the chemical formula:
  • the invention also provides a preparation method of CD169 high affinity antitumor compound, comprising the following preparation steps:
  • Step 1 mixing TCC Sia methyl ester, methanol and NaOH solution, and stirring at room temperature for a period of time to obtain a mixture M11;
  • Step 2 in the mixture M11 obtained in step 1, adding HCl aqueous solution, adjusting the pH of the mixture M11 to 7, to obtain a mixture M12;
  • Step 3 The mixture M12 obtained in the second step is subjected to solvent removal, and the residue after removing the solvent is purified to obtain a CD169 high affinity antitumor compound.
  • the method for preparing the TCC Sia methyl ester in the first step comprises the following steps:
  • EtOAc:MeOH 20:1 used in column chromatography in S230.
  • EtOAc:MeOH 20:1 used for column chromatography in S370.
  • the invention also provides the use of a CD169 high affinity anti-tumor compound as described above, for the treatment of a tumor.
  • the invention provides a CD169 high affinity antitumor compound and a preparation and application thereof, wherein the CD169 high affinity antitumor compound is a 9-benzopyranthiophenanyl N-acetylneuraminic acid monosaccharide (TCC-Neu5Ac),
  • TCC-Neu5Ac 9-benzopyranthiophenanyl N-acetylneuraminic acid monosaccharide
  • a substance is a small molecule anti-tumor compound that can be used for tumor killing using its specific, broad-spectrum properties.
  • the mechanism is that TCC-Neu5Ac can target tumors in vivo and metabolize and grow on the surface of tumor cells to form TCC-Neu5Ac ligand.
  • the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention is effective against various tumors and has an inhibitory effect on tumor metastasis.
  • the CD169 high-affinity anti-tumor compound provided by the invention can not only be injected, but also exerts oral action, and has low cytotoxicity and animal toxicity, and has broad application prospect and market value.
  • FIG. 1 is a distribution image of a CD169 high affinity antitumor compound provided in a human malignant glioma cell according to the present invention
  • FIG. 2 is a distribution image of a CD169 high affinity antitumor compound provided in a mouse-derived melanoma cell according to the present invention
  • FIG. 3 is a distribution analysis image of a CD169 high affinity antitumor compound provided in a mouse-derived melanoma cell according to the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the cell survival rate of a CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing the effect of macrophages on the phagocytosis effect of tumor cells incubated with the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention
  • FIG. 6 is a photograph showing the appearance of a tumor-bearing mouse in which the experimental group 1 was injected with the CD169 high-affinity antitumor compound provided by the present invention
  • Figure 7 is a photograph showing the appearance of a tumor-bearing mouse in a control group 1 injected with a PBS solution containing natural sialic acid;
  • Figure 8 is a comparison of tumor size taken from mice of Experimental Group 1 and Control Group 1;
  • Figure 9 is a comparative analysis of tumor size data taken from mice of Experimental Group 1 and Control Group 1;
  • Figure 10 is a photograph showing the appearance of tumor-bearing mice with experimental group 2 high-affinity anti-tumor compound of CD169 provided by the present invention.
  • Figure 11 is a photograph showing the appearance of a tumor-bearing mouse in a control group 2 orally in the same volume of a PBS solution containing natural sialic acid;
  • Figure 12 is a comparison of tumor size taken from mice of Experimental Group 2 and Control 2;
  • Figure 13 is a comparative analysis of tumor size data taken from mice of Experimental Group 2 and Control Group 2;
  • Figure 14 is a graph showing the effect of the present invention on tumor metastasis in mice.
  • Figure 15 is a graph showing the survival rate of mice in the study of toxicity in mice of the present invention.
  • the invention provides a CD169 high affinity antitumor compound, the chemical formula of which is:
  • the present invention provides a novel anti-tumor small molecule compound, 9-position benzopyran-thienyl N-acetylneuraminic acid monosaccharide (TCC-Neu5Ac), which is a CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention, Tumor killing can be performed using specific, broad-spectrum properties.
  • TCC-Neu5Ac can target tumors in vivo and metabolize and grow on the surface of tumor cells to form TCC-Neu5Ac ligand. After recognition of macrophages near the tumor, they are phagocytized, and tumor fragments are released and presented to other immune cells, triggering an anti-tumor immune response.
  • CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention is effective against various tumors and has an inhibitory effect on tumor metastasis.
  • the CD169 high affinity antitumor compound provided by the invention can not only be injected, but also exerts oral action, and has low cytotoxicity and animal toxicity, and has excellent application prospect and value.
  • the invention also provides a preparation method of CD169 high affinity antitumor compound, comprising the following preparation steps:
  • 6-chloro-8-fluorochroman-4-one 1 (5 g, 24.9 mmol) was dissolved in 15 mL of dimethylformamide (N, N-Dimethylformamide, DMF for short) at 0 °C. , and phosphorus oxychloride (2.3 mL, 24.9 mmol) was added dropwise to obtain a mixture M51;
  • sialic acid (15.0 g, 50 mmol), 1 ml of trifluoroacetic acid and 300 ml of anhydrous methanol was stirred at room temperature until clarification to obtain a mixture M41; wherein the chemical structure of the sialic acid expressed herein is as follows:
  • the chemical synthesis route of the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention is as follows:
  • the invention also provides the use of a CD169 high affinity anti-tumor compound as described above.
  • the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention can achieve an antitumor effect by injection or oral administration.
  • the human malignant glioma cells (U87) were cultured normally in a 37-degree constant temperature incubator containing 5% carbon dioxide, and the medium used was DMEM medium containing 10% fetal calf serum;
  • the cells were passaged to a confocal dedicated cell culture dish and cultured to a density of 50%;
  • the original medium was removed, and a medium containing TCC-Neu5Ac at a concentration of 100 ⁇ mol (100 uM) was added, and the culture was continued for 24 hours;
  • the medium containing TCC-Neu5Ac was removed, carefully washed three times with PBS, new medium was added, and the distribution of TCC-Neu5Ac in the cells was observed by laser confocal microscopy.
  • the excitation light used was 405 nm, and the emitted light in the range of 420-480 nm was intercepted, and the scale was 5 ⁇ m.
  • FIG. 1 shows the distribution of TCC-Neu5Ac.
  • mice-derived melanoma cells (B16F10) were cultured normally in a 37-degree constant temperature incubator containing 5% carbon dioxide, and the medium used was DMEM medium containing 10% fetal calf serum;
  • the cells were passaged to a confocal dedicated cell culture dish and cultured to a density of 50%;
  • the original medium was removed, and a medium containing TCC-Neu5Ac at a concentration of 100 ⁇ mol (100 uM) was added, and the culture was continued for 24 hours;
  • the medium containing TCC-Neu5Ac was removed, carefully washed three times with PBS, new medium was added, and the distribution of TCC-Neu5Ac in the cells was observed by laser confocal microscopy.
  • the excitation light used was 405 nm, and the emitted light in the range of 420-480 nm was intercepted, and the scale was 5 ⁇ m.
  • FIG. 2 shows the distribution of TCC-Neu5Ac.
  • the human malignant glioma cells (U87) were cultured normally in a 37-degree constant temperature incubator containing 5% carbon dioxide, and the medium used was DMEM medium containing 10% fetal calf serum;
  • the cells were passaged to a confocal dedicated cell culture dish and cultured to a density of 50%.
  • the original medium was removed, and a medium containing TCC-Neu5Ac at different concentrations from 0 to 100 micromolar (100 uM) was added, and the culture was continued for 24 hours;
  • the medium containing TCC-Neu5Ac was removed, carefully washed three times with PBS, new medium was added, and the dead cells were counted in the placenta.
  • the counting results are shown in Fig. 4, wherein the abscissa indicates the concentration of TCC-Neu5Ac added in the medium, and the ordinate indicates the cell survival rate. As shown in Fig. 4, different concentrations (0 to 100 micromoles) of TCC- are added to the medium. Neu5Ac, the survival rate of cells is not much different. It can be seen that the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention has extremely low toxicity in cells, and it is feasible to be used as a human tumor treatment.
  • the 10-week-old mouse bone marrow was taken out, and potassium chloride ammonium (ACK) lysate was added, and then the cells were cultured in an IMDM-containing medium containing 10% (volume ratio) fetal bovine serum (FBS), 10 ng/mL macrophage. Cell community stimulating factors, resulting in BMDM macrophages.
  • the macrophages and B16F10 cells were incubated in the experimental group and the control medium at a ratio of 5:1.
  • the experimental group was supplemented with TCC-Neu5Ac, and the control medium was supplemented with the same volume of Neu5Ac, using lactate dehydrogenase cells.
  • the toxicity test kit is used for detection, and the SB nanometer absorption peak is selected by the microplate reader.
  • the B16F10 cells were normally cultured in a 10 cm cell culture dish and cultured to a density of 80%;
  • Control group 1 was injected with the same volume of PBS containing 100 micromoles of natural sialic acid, and the rest of the conditions were consistent with the experimental group.
  • Fig. 8 After 15 days, the hair of the tumor site of the mouse was removed, photographed (as shown in Fig. 6 and Fig. 7), and the tumor of the mouse was taken out and photographed and analyzed. The results are shown in Fig. 8:
  • Fig. 6 is a photograph showing the appearance of a tumor-bearing mouse in which the experimental group 1 was injected with the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention
  • Fig. 7 is a small tumor of the control group 1 injected with the same volume of PBS, containing 100 micromoles of natural sialic acid. Mouse appearance photo.
  • the left side is the tumor taken out from the tumor group of the experimental group 1 in which the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention is injected, and the tumor taken out in the control group 1 on the right side.
  • the tumor-bearing mice injected with the CD169 high-affinity anti-tumor compound provided by the present invention have a tumor size significantly smaller than that of the same volume of PBS, and contain 100 micromoles of natural sialic acid (excluding the CD169 high-affinity anti-tumor compound provided by the present invention).
  • B16F10 cells were cultured normally in 10 cm cell culture dishes, and cultured to 80% density; digested with 2 ml trypsin for 90 seconds, neutralized by adding 2 ml of medium, centrifuged at 300 g for 3 minutes, and centrifuged once more with PBS to remove residuals. The medium was resuspended in PBS and counted; 1 million prepared cells were injected subcutaneously into B6 strain mice (C57BL/6) for tumor implantation;
  • the control group 2 was fed with an aqueous solution containing the same amount of natural sialic acid.
  • Fig. 10 is a photograph showing the appearance of a tumor-bearing mouse having the CD169 high-affinity antitumor compound provided by the present invention in the experimental group 2;
  • FIG. 11 is a control group 2 orally taking the same volume of PBS, containing 100 micromoles of natural sialic acid and having a small tumor.
  • Mouse appearance photo In Fig. 12, the left side is a tumor taken from a tumor-bearing mouse having a CD169 high-affinity antitumor compound provided by the present invention orally, and the right side is a tumor taken out in a control 2 mouse.
  • the above-mentioned tumor size was analyzed by data, and the data analysis chart was made as shown in FIG. 13; by comparing FIG. 10 and FIG. 11 and the tumor size comparison between the left and right sides in FIG. 12, compared with the analysis of FIG. It can be seen that the tumor size of tumor-bearing mice injected with the CD169 high-affinity anti-tumor compound provided by the present invention is significantly smaller than that of the same volume of PBS, containing 100 micromoles of natural sialic acid (excluding the CD169 high affinity resistance provided by the present invention). Tumor size of tumor mice with tumor compounds). Thus, it can be seen that the oral administration of the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention has a remarkable effect against tumors.
  • the B16F10 cells were normally cultured in a 10 cm cell culture dish and cultured to a density of 80%;
  • One million prepared cells were injected from the tail vein into B6 strain mice (C57BL/6) for tumor metastasis model analysis. Thereafter, every two days, a volume of 100 ⁇ l of PBS containing 100 ⁇ mol of the present invention was injected from the tail vein of the mice as an experimental group.
  • the control group was injected with the same volume of PBS containing 100 micromoles of natural sialic acid (Neu5Ac). After 15 days, the hair of the tumor site of the mouse was removed and photographed; the tumor of the mouse was taken out, and photographing and data analysis were performed.
  • the experimental data analysis chart is shown in Fig. 14.
  • the ordinate position of one of the black solid circles indicates the number of tumors transferred to the lungs in one experimental group; the ordinate position of one black solid square indicates the number of tumors transferred to the lungs in one control group. .
  • the number of tumors transferred to the lungs of the experimental group was much lower than that of the control group, and it was found that the CD169 high affinity antitumor compound provided by the present invention has a remarkable effect of inhibiting tumor metastasis.
  • B6 strain mice (C57BL/6) were injected from the tail vein every 5 days to a volume of 100 microliters containing 100 micromolar concentrations of PBS of the present invention.
  • the control group was injected with natural sialic acid molecules containing the same volume concentration. Mice were observed and recorded.
  • the experiment is seen in Figure 15.
  • the abscissa of Fig. 15 represents the culture time of the mouse, and the ordinate represents the survival rate of the mouse.
  • the survival rate of the mice of the experimental group and the control group did not differ much after 100 days of culture, and the CD169 provided by the present invention can be seen.
  • High-affinity anti-tumor compounds are very toxic to mice and are useful as a treatment for human tumors.

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Abstract

一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物及其制备方法和应用。CD169高亲和力抗肿瘤化合物为9位苯并吡喃并噻吩基N-乙酰神经氨酸单糖(TCC-Neu5Ac)或其同系物，可以利用其特异的、广谱的性质对肿瘤进行杀伤。TCC-Neu5Ac靶向体内的肿瘤，经过代谢生长在肿瘤细胞的表面，形成TCC-Neu5Ac配体。肿瘤附近的巨噬细胞识别后，将其吞噬，同时释放出肿瘤碎片并呈递给其它免疫细胞，引发抗肿瘤免疫反应。

Description

一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及抗肿瘤化合物，特别涉及一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的重要问题。基于对肿瘤特性的理解，人们研究各种方法进行肿瘤杀伤和抗肿瘤药物、方法的研究。如利用肿瘤代谢强度高于正常组织的特性研发的各种化疗药物；利用肿瘤表面特异性标志物研究的单克隆抗体，如赫赛汀等。除了以上直接杀伤肿瘤的方法外，近年来人们开始利用机体自身免疫系统研究的免疫检查点抑制剂进行抗肿瘤研究，如靶向PD1、PDL-1的各种抗体和小分子抑制剂等，这些研究取得了巨大的效果，是未来抗肿瘤的重要方向。
在机体免疫系统中，巨噬细胞扮演了重要的角色。巨噬细胞不仅可以直接吞噬肿瘤细胞，还可以将吞噬肿瘤细胞的碎片传递给其他免疫细胞，激活人体自身免疫系统，进行抗肿瘤反应。唾液酸结合免疫球蛋白凝集素(Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins，SIGLEC)是一类能特异结合唾液酸的凝集素，主要分布在各种免疫细胞的表面。目前已知发现的SIGLEC家族有14个种类，其中SIGLEC-1，又称CD169，主要分布于巨噬细胞表面。SIGLEC1在小鼠和人类中是具有高度同源性的，因此可以特异结合N-乙酰神经氨酸糖三糖序列(Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc)，其中，Neu5AC代表N乙酰神经氨酸，Gal代表半乳糖，GlcNAc代表N乙酰氨基葡萄糖，α2-3和β1-4是化学键连接方式。然而在自然界中SIGLEC1结合天然的唾液酸糖配体亲和力不高。
如何利用巨噬细胞进行肿瘤的杀伤是人们一直关注的问题。
发明内容
为解决以上背景技术中提到的如何利用巨噬细胞进行肿瘤治疗的问题，本发明提供一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物，其包括化学式为：
Figure PCTCN2018103238-appb-000001
及同系物。
本发明还提供一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，包括以下制备步骤：
步骤一、将 TCCSia methyl ester、甲醇和NaOH溶液混合，并在室温下搅拌一段时间得到混合物M11；
步骤二、在步骤一得到的混合物M11中，加入HCl水溶液，调节混合物M11的pH为7，得到混合物M12；
步骤三、将步骤二得到的混合物M12去除溶剂，将去除溶剂后的残余物进行纯化，制得固体即为CD169高亲和力抗肿瘤化合物。
进一步地，步骤三中，将去除溶剂后的残余物通过柱层析进行纯化，所述柱层析中采用的CH 2Cl 2：MeOH＝2：1。
进一步地，步骤一中所述 TCCSia methyl ester的制备方法包括以下步骤：
S110、将 N3Sia methyl ester、Pd/C催化剂和无水甲醇混合，得到混合物M21；
S120、在S110得到的混合物M21中加入乙酰氯，调节pH为1～2，得到混合物M22；
S130、将S120得到的混合物M22置于H 2中搅拌，并通过薄层色谱监测至反应完全，得到混合物M23；
S140、将S130得到的混合物M23通过过滤，除去Pd/C催化剂，并采用蒸发去除溶剂，得到残留混合物M24；
S150、将S140中得到的混合物M24、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺、TCC-COOH和二甲基甲酰胺混合，并在黑暗中搅拌一段时间，得到混合物M25；
S160、将S150中得到的混合物M25蒸发除去溶剂，并将去除溶剂后的残余物通过柱层析进行纯化，得到固体即为 TCCSia methyl ester；
其中，S160中，柱层析中采用的CH 2Cl 2：MeOH＝10：1。
进一步地，所述 N3Sia methyl ester的制备方法为：
S210、将叠氮化钠和 TosSia methyl ester加入二甲基甲酰胺中得到混合物M31；
S220、将S210中得到的混合物M31加热至80℃一段时间后，除去溶剂；
S230、将S220去除溶剂后的残余物通过柱层析纯化，得到固体即为 N3Sia methyl  ester；
其中，S230中柱层析中采用的EtOAc:MeOH＝20:1。
进一步地，所述 TosSia methyl ester的制备方法为：
S310、将唾液酸、三氟乙酸和无水甲醇混合后在室温下搅拌至澄清，得到混合物M41；
S320、将S310中得到的混合物M41采用蒸发的方式除去溶剂，得到固体唾液酸甲酯；
S330、将S320中得到的固体唾液酸甲酯和P 2O 5在真空干燥一段时间，得到混合物M42；
S340、在S330中得到的混合物M42与无水吡啶共蒸发以除去水分，得到混合物M43；
S350、将S340得到的混合物M43溶于无水吡啶中后，冷却至0℃，并加入对甲苯磺酰氯，得到混合物M44；
S360、将S350中得到的混合物M44加热至室温并搅拌一段时间后，通过减压加热除去溶剂；
S370、将S360除去溶剂后的残余物通过柱层析纯化，得到白色固体即为 TosSia methyl ester；
其中，S370中柱层析所采用的EtOAc:MeOH＝20:1。
进一步地，所述TCC-COOH的合成方法为：
S410、在0℃下，将6-氯-8-氟苯并二氢吡喃-4-酮1溶解于二甲基甲酰胺中，并逐滴加入磷酰氯，得到混合物M51；
S420、将S410得到的混合物M51在0℃下搅拌30分钟后加热至80℃，保温1.5小时后冷却至室温，得到混合物M52；
S430、将S420得到的混合物M52冷却至室温后，加入1N NaOAc溶液淬灭后，加入二氯甲烷进行萃取，将萃取后的有机层进行真空浓缩，得到4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛；
S440、在0℃下，于圆底烧瓶中，将S430得到的4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛溶解在乙醇溶液中，逐滴加入的巯基乙酸乙酯与乙醇钠于溶液中，得到混合物M53；
S450、将S440得到的混合物M53升温至室温并搅拌过夜后，进行过滤，得到沉淀物后，用水洗涤并收集沉淀物；
S460、将S450得到的沉淀物加入四氢呋喃和1N NaOH溶液中，并在50℃下搅拌24小时，得到混合物M54；
S470、将S460得到的混合物M54冷却至室温，用CH 2Cl 2洗涤，并加入1N HCl酸化，将所得固体产物过滤，用水洗涤并干燥，即得到TCC-COOH。
本发明还提供一种如上任意所述的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在治疗肿瘤方面的应用。
本发明提供的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物及其制备和应用，其中CD169高亲和力抗肿瘤化合物为9位苯并吡喃并噻吩基N-乙酰神经氨酸单糖(TCC-Neu5Ac)，该物质为一种小分子抗肿瘤化合物，可以利用其特异的、广谱的性质进行肿瘤杀伤。其机理在于，TCC-Neu5Ac可以靶向体内的肿瘤，经过代谢生长在肿瘤细胞的表面，形成TCC-Neu5Ac配体。肿瘤附近的巨噬细胞识别后，将其吞噬，同时释放出肿瘤碎片并呈递给其它免疫细胞，引发抗肿瘤免疫反应。该机理决定了本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物对多种肿瘤均有效，对肿瘤转移也有抑制效果。此外，本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物不仅可以注射，还可以通过口服发挥作用，其细胞毒性和动物毒性均很低，具有广阔应用前景和市场价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在人源恶性胶质瘤细胞内的分布图像；
图2为本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在小鼠源黑色素瘤细胞内的分布图像；
图3为本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在小鼠源黑色素瘤细胞内的分布分析图像；
图4为本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的细胞生存率分析图；
图5为巨噬细胞对本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物所孵育的肿瘤细胞吞噬效果的分析图；
图6为实验组1注射有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的患肿瘤小鼠外观照片图；
图7为对照组1注射同体积含有天然唾液酸的PBS溶液的患肿瘤小鼠外观照片图；
图8为从实验组1和对照组1的小鼠体内取出的肿瘤大小对比图；
图9为从实验组1和对照组1的小鼠体内取出的肿瘤大小数据分析对比图；
图10为实验组2口服有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的患肿瘤小鼠外观照片图；
图11为对照组2口服同体积含有天然唾液酸的PBS溶液的患肿瘤小鼠外观照片图；
图12为从实验组2和对照组2的小鼠体内取出的肿瘤大小对比图；
图13为从实验组2和对照组2的小鼠体内取出的肿瘤大小数据分析对比图；
图14为本发明对小鼠肿瘤转移效果的分析图；
图15为本发明对小鼠毒性的研究中小鼠的生存率曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物，其化学式为：
Figure PCTCN2018103238-appb-000002
本发明提供一种新的抗肿瘤小分子化合物，9位苯并吡喃并噻吩基N-乙酰神经氨酸单糖(TCC-Neu5Ac)，即本发明提供的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物，可以利用特异的、广谱的性质进行肿瘤杀伤。其机理在于，TCC-Neu5Ac可以靶向体内的肿瘤，经过代谢生长在肿瘤细胞的表面，形成TCC-Neu5Ac配体。肿瘤附近的巨噬细胞识别后，将其吞噬，同时释放出肿瘤碎片并呈递给其它免疫细胞，引发抗肿瘤免疫反应。该机理决定了本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物对多种肿瘤有效，对肿瘤转移也 有抑制效果。此外，本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物不仅可以注射，还可以通过口服发挥作用，其细胞毒性和动物毒性均很低，具有极佳的应用前景和价值。
本发明还提供一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，包括以下制备步骤：
1、制备TCC-COOH
1)在0℃下，将6-氯-8-氟苯并二氢吡喃-4-酮1(5g，24.9mmol)溶解于15mL二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，简称DMF)中，并逐滴加入磷酰氯(2.3mL，24.9mmol)，得到混合物M51；
2)将S410得到的混合物M51在0℃下搅拌30分钟后加热至80℃，保温1.5小时后冷却至室温，得到混合物M52；
3)将S420得到的混合物M52冷却至室温后，加入1N NaOAc溶液淬灭后，加入二氯甲烷(2×25mL)进行萃取，将萃取后的有机层进行真空浓缩，得到4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛，不经进一步纯化即可进行下一步骤；
4)在0℃下，于100ml圆底烧瓶中，将得到的4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛(6.1g，24.9mmol)溶解在30mL乙醇溶液中，逐滴加入的巯基乙酸乙酯(2.73mL，24.9mmol)与乙醇钠(21wt％，在乙醇中，18.7mL，49.8mmol)于溶液中，得到混合物M53；
5)将S440得到的混合物M53升温至室温并搅拌过夜后，进行过滤，得到沉淀物后，用水洗涤并收集沉淀物；
6)将S450得到的沉淀物加入四氢呋喃(Tetrahydrofuran，简称THF)和1N NaOH溶液中，并在50℃下搅拌24小时，得到混合物M54；
7)将S460得到的混合物M54冷却至室温，用CH 2Cl 2(2×50mL)洗涤，并加入1N HCl酸化，将所得固体产物过滤，用水洗涤并干燥，即得到TCC-COOH。
其中，TCC-COOH的化学结构式为：
Figure PCTCN2018103238-appb-000003
该制备方法中，合成TCC-COOH的化学反应式为：
Figure PCTCN2018103238-appb-000004
2、制备 TosSia methyl ester
1)将唾液酸(15.0g，50mmol)、1ml三氟乙酸和300ml无水甲醇混合后在室温下搅拌至澄清，得到混合物M41；其中，该处表述的唾液酸的化学结构式如下所示：
Figure PCTCN2018103238-appb-000005
2)将得到的混合物M41采用蒸发的方式除去溶剂，得到唾液酸甲酯，为白色固体，无需进一步纯化；
3)将得到的固体唾液酸甲酯和P 2O 5在真空干燥过夜，得到混合物M42；
4)在得到的混合物M42与无水吡啶共蒸发两次以除去痕量水分，得到混合物M43；
5)将得到的混合物M43溶于200ml无水吡啶中后，冷却至0℃，并加入对甲苯磺酰氯(10.0g，53mmol)，得到混合物M44；
6)将得到的混合物M44加热至室温并搅拌过夜后，通过减压加热除去溶剂；
7)将上一步除去溶剂后的残余物通过柱层析(EtOAc:MeOH＝20:1)纯化，得到白色固体(18.0g，38mmol)，即为 TosSia methyl ester，制得的 TosSia methyl ester化学式如下所示：
Figure PCTCN2018103238-appb-000006
3、制备 N3Sia methyl ester
1)将8.0g叠氮化钠和 TosSia methyl ester(14.0g，30mmol)加入150ml二甲基甲酰胺(DMF)中得到混合物M31；
2)将S210中得到的混合物M31加热至80℃过夜后，除去溶剂；
3)将S220去除溶剂后的残余物通过柱层析(EtOAc:MeOH＝20:1)纯化，得到固体即为 N3Sia methyl ester，其化学结构式如下所示：
Figure PCTCN2018103238-appb-000007
4、制备 TCCSia methyl ester
1)将 N3Sia methyl ester(3.0g，8.6mmol)、300mgPd/C(钯碳)催化剂和100 ml无水甲醇混合，得到混合物M21；
2)在S110得到的混合物M21中加入乙酰氯，调节pH为1～2，得到混合物M22；
3)将S120得到的混合物M22置于H 2中搅拌，并通过薄层色谱监测(TCL监测)至反应完全，约12小时，得到混合物M23；
4)将S130得到的混合物M23通过过滤以除去Pd/C催化剂，并采用蒸发的方式去除溶剂，得到残留混合物M24；
5)将S140中得到的残留混合物M24、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(2.0g，10.3mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.4g，10.3mmol)、三乙胺(3.6ml，25.8mmol)、TCC-COOH(2.0g，8.6mmol)和150ml二甲基甲酰胺(DMF)混合，并在黑暗中搅拌48小时，得到混合物M25；
6)将S150中得到的混合物M25蒸发除去溶剂，并将去除溶剂后的残余物通过柱层析(CH 2Cl 2：MeOH＝10：1)进行纯化，得到固体(2.6g,4.8mmol)即为 TCCSia methyl ester，其化学结构式如下所示：
Figure PCTCN2018103238-appb-000008
5、制备CD169高亲和力抗肿瘤化合物(TCC-Neu5Ac)
1)将 TCCSia methyl ester(536mg，1mmol)、5ml甲醇和5ml 2M NaOH溶液混合，并在室温下搅拌20min得到混合物M11；
2)在混合物M11中，加入2M HCl水溶液，调节混合物M11的pH为7得到混合物M12；
3)将混合物M12溶剂的溶剂完全去除，将去除溶剂后的残余物通过柱层析进行纯化，所述柱层析中采用的CH 2Cl 2：MeOH＝2：1，制得浅黄色固体(287mg,0.55mmol)即为CD169高亲和力抗肿瘤化合物。
更具体地，本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的化学式合成路线如下所示：
Figure PCTCN2018103238-appb-000009
本发明还提供一种如上任意所述的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的应用。
将本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物通过注射或口服等方式，可以达到抗肿瘤效果。
以下通过具体实验证明本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的抗肿瘤效果。
1、本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在第一种细胞内分布情况：
将人源恶性胶质瘤细胞(U87)在含有5％二氧化碳的37度恒温培养箱中，正常培养，所用培养基为含有10％胎牛血清的DMEM培养基；
将细胞传代到共聚焦专用细胞培养皿上，培养至50％密度；
将原有培养基移除，加入含有100微摩尔(100uM)浓度的TCC-Neu5Ac的培养基，继续培养24小时；
移除含有TCC-Neu5Ac的培养基，用PBS小心润洗三遍，加入新的培养基，用激光共聚焦显微镜观察TCC-Neu5Ac在细胞内的分布。其中所用激发光为405纳米，截取420-480纳米范围的发射光，标尺为5微米。
图1中显示了TCC-Neu5Ac分布位置，通过对显微镜不同视野的观察，可以发现TCC-Neu5Ac分布于U87细胞的细胞内和细胞膜上。
2、本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在第二种细胞内分布情况。
将小鼠源黑色素瘤细胞(B16F10)在含有5％二氧化碳的37度恒温培养箱中，正常培养，所用培养基为含有10％胎牛血清的DMEM培养基；
将细胞传代到共聚焦专用细胞培养皿上，培养至50％密度；
将原有培养基移除，加入含有100微摩尔(100uM)浓度的TCC-Neu5Ac的培养基，继续培养24小时；
移除含有TCC-Neu5Ac的培养基，用PBS小心润洗三遍，加入新的培养基，用激光共聚焦显微镜观察TCC-Neu5Ac在细胞内的分布。其中所用激发光为405纳米，截取420-480纳米范围的发射光，标尺为5微米。
由图2为TCC-Neu5Ac分布位置情况，通过对显微镜不同视野的观察，可以发现TCC-Neu5Ac分布于B16F10细胞的细胞内和细胞膜上。
3、本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在细胞内分布情况的软件分析。
通过显微镜观察，发现本发明在每一种细胞内的分布情况类似，同时分布于细胞内和细胞膜。为确定在细胞表面上的分布，我们通过软件进行分析。用ImageJ最新版软件，选取dot-plot分析工具，对上述本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在第二种细胞内(小鼠源黑色素瘤细胞)分布实验中，B16F10细胞成像图分析。纵坐标为灰度值，横坐标为距离，分析图像如图3所示：
通过图3可以看出灰度值高的像素位置是在细胞膜上，可见TCC-Neu5Ac主要分布于细胞膜上。
4、本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在细胞内的毒性分析。
将人源恶性胶质瘤细胞(U87)在含有5％二氧化碳的37度恒温培养箱中，正常培养，所用培养基为含有10％胎牛血清的DMEM培养基；
将细胞传代到共聚焦专用细胞培养皿上，培养至50％密度。将原有培养基移除，加入含有从0到100微摩尔(100uM)不同浓度的TCC-Neu5Ac的培养基，继续培养24小时；
移除含有TCC-Neu5Ac的培养基，用PBS小心润洗三遍，加入新的培养基，加入胎盘里进行死亡细胞计数。
计数结果如图4所示，其中横坐标表示培养基内添加的TCC-Neu5Ac浓度，纵坐标表示细胞生存率，通过图4可知，培养基内添加不同浓度(0到100微摩尔)的TCC-Neu5Ac，细胞的生存率相差不大，由此可见，本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物在细胞内的毒性极低，将其用作人体肿瘤治疗具有可行性。
5、巨噬细胞对本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物所孵育的肿瘤细胞吞噬效果的分析。
将10周龄小鼠骨髓取出，加入氯化钾铵(ACK)裂解液，之后将细胞培养在含有IMDM培养基中，含有10％(体积比)胎牛血清(FBS),10ng/mL巨噬细胞群落刺激因子，得到BMDM巨噬细胞。将巨噬细胞与B16F10细胞按5:1比例一起分别实验组培养 组和对照组培养基中孵育，实验组培养基添加TCC-Neu5Ac，对照组培养基添加同体积Neu5Ac，用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒进行检测，酶标仪选取490纳米吸收峰。并换算为吞噬杀伤效率。测试结果如图5所示。由图5可知，添加TCC-Neu5Ac的培养基中，吞噬细胞对肿瘤的杀伤率明显高于添加Neu5Ac的培养基，可见吞噬细胞对CD169高亲和力抗肿瘤化合物所孵育的肿瘤细胞具有很高的吞噬杀伤效率。
6、本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物通过注射方式进行的小鼠抗肿瘤分析。
将B16F10细胞正常培养在10cm细胞培养皿中，培养至80％密度；
用2毫升胰酶消化90秒，加入2毫升培养基中和，300g离心3分钟，用PBS重复润洗离心一次，去除残留的培养基；加入PBS重悬，计数；
将100万个制备好的细胞注入B6品系小鼠(C57BL/6)皮下，进行肿瘤种植。之后每隔两天，从小鼠尾静脉注射含有本发明100微摩尔浓度的PBS100微升体积，作为实验组1；
对照组1注射同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸，其余条件与实验组一致。
15天后，将小鼠肿瘤部位的毛发剔除，进行拍照(如图6和图7所示)，并将小鼠肿瘤取出，进行拍照分析,结果如图8所示：
图6为实验组1注射有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的患肿瘤小鼠外观照片；图7为对照组1注射同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸的患肿瘤小鼠外观照片。而图8中，左侧为从注射有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的实验组1患肿瘤小鼠中取出的肿瘤，右侧为对照组1小鼠中取出的肿瘤。
此外，将以上测的肿瘤大小进行数据分析，制成数据分析图如图8所示；通过图6和图7，以及图8中左右两边肿瘤大小对比以及图9的分析对比，可以明显看出，注射有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的患肿瘤小鼠的肿瘤大小明显小于注射同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸(不含本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物)的患肿瘤小鼠的肿瘤大小。因此，可以看出，通过注射本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物对抗肿瘤具有显著的效果。
7、本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物通过口服方式进行的小鼠抗肿瘤分析。
将B16F10细胞正常培养在10cm细胞培养皿中，培养至80％密度；用2毫升胰酶 消化90秒，加入2毫升培养基中和，300g离心3分钟，用PBS重复润洗离心一次，去除残留的培养基；加入PBS重悬，计数；将100万个制备好的细胞注入B6品系小鼠(C57BL/6)皮下，进行肿瘤种植；
之后每天灌喂含有本发明100微摩尔浓度的水溶液200微升，作为实验组2；
对照组2灌喂同体积含有天然唾液酸的水溶液。
15天后，将小鼠肿瘤部位的毛发剔除，进行拍照，并将小鼠肿瘤取出，进行拍照分析。
图10为实验组2口服有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的患肿瘤小鼠外观照片；图11为对照组2口服同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸的患肿瘤小鼠外观照片。而图12中，左侧为从口服有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的患肿瘤小鼠中取出的肿瘤，右侧为对照组2小鼠中取出的肿瘤。
此外，将以上测的的肿瘤大小进行数据分析，制成数据分析图如图13所示；通过图10和图11，以及图12中左右两边肿瘤大小对比，和图13的分析对比，可以明显看出，注射有本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物的患肿瘤小鼠的肿瘤大小明显小于注射同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸(不含本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物)的患肿瘤小鼠的肿瘤大小。因此，可以看出，通过口服本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物对抗肿瘤具有显著的效果。
8、本发明对小鼠肿瘤转移效果的分析。
将B16F10细胞正常培养在10cm细胞培养皿中，培养至80％密度；
用2毫升胰酶消化90秒，加入2毫升培养基中和，300g离心3分钟，用PBS重复润洗离心一次，去除残留的培养基；加入PBS重悬，计数。
将100万个制备好的细胞从尾静脉注入B6品系小鼠(C57BL/6)体内，进行肿瘤转移模型分析。之后每隔两天，从小鼠尾静脉注射含有本发明100微摩尔浓度的PBS100微升体积，作为实验组。对照组注射同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸(Neu5Ac)。15天后，将小鼠肿瘤部位的毛发剔除，进行拍照；并将小鼠肿瘤取出，进行拍照和数据分析，实验数据分析图见图14。其中1个黑色实心圆圈所在的纵坐标位置表示1只实验组小鼠转移至肺部的肿瘤数；1个黑色实心正方形所在的纵坐标位置表示1只对照组小鼠转移至肺部的肿瘤数。由图14可知，实验组小鼠转至肺部的肿瘤数远低于对照组，可见本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物具有显著的抑制肿瘤转移的效果。
9、本发明对小鼠毒性的研究。
将B6品系小鼠(C57BL/6)每隔5天从尾静脉注射含有本发明的100微摩尔浓度的PBS100微升体积。对照组分别注射含有同体积浓度的天然唾液酸分子。观察小鼠死亡并记录。实验见过见图15。图15的横坐标表示小鼠的培养时间，纵坐标表示小鼠的生存率，由图15可知，实验组和对照组的小鼠在培养100天后生存率差别不大，可见本发明提供的CD169高亲和力抗肿瘤化合物对小鼠的毒性很低，将其用作人体肿瘤治疗具有可行性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

  1. 一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物，其特征在于包括化学式为：
    Figure PCTCN2018103238-appb-100001
    及同系物。
  2. 根据权利要求1所述的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
    步骤一、将 TCCSia methyl ester、甲醇和NaOH溶液混合，并在室温下搅拌一段时间得到混合物M11；
    步骤二、在步骤一得到的混合物M11中，加入HCl水溶液，调节混合物M11的pH为7，得到混合物M12；
    步骤三、将步骤二得到的混合物M12去除溶剂，将去除溶剂后的残余物进行纯化，制得固体即为CD169高亲和力抗肿瘤化合物。
  3. 根据权利要求2所述的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于：步骤三中，将去除溶剂后的残余物通过柱层析进行纯化，所述柱层析中采用的CH 2Cl 2：MeOH＝2：1。
  4. 根据权利要求2所述的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于，步骤一中所述 TCCSia methyl ester的制备方法包括以下步骤：
    S110、将 N3Sia methyl ester、Pd/C催化剂和无水甲醇混合，得到混合物M21；
    S120、在S110得到的混合物M21中加入乙酰氯，调节pH为1～2，得到混合物M22；
    S130、将S120得到的混合物M22置于H 2中搅拌，并通过薄层色谱监测至反应完全，得到混合物M23；
    S140、将S130得到的混合物M23通过过滤，除去Pd/C催化剂，并采用蒸发去除溶剂，得到残留混合物M24；
    S150、将S140中得到的混合物M24、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐 酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺、TCC-COOH和二甲基甲酰胺混合，并在黑暗中搅拌一段时间，得到混合物M25；
    S160、将S150中得到的混合物M25蒸发除去溶剂，并将去除溶剂后的残余物通过柱层析进行纯化，得到固体即为 TCCSia methyl ester；
    其中，S160中，柱层析中采用的CH 2Cl 2：MeOH＝10：1。
  5. 根据权利要求4所述的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于，所述 N3Sia methyl ester的制备方法为：
    S210、将叠氮化钠和 TosSia methyl ester加入二甲基甲酰胺中得到混合物M31；
    S220、将S210中得到的混合物M31加热至80℃一段时间后，除去溶剂；
    S230、将S220去除溶剂后的残余物通过柱层析纯化，得到固体即为 N3Sia methyl ester；
    其中，S230中柱层析中采用的EtOAc:MeOH＝20:1。
  6. 根据权利要求5所述的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于，所述 TosSia methyl ester的制备方法为：
    S310、将唾液酸、三氟乙酸和无水甲醇混合后在室温下搅拌至澄清，得到混合物M41；
    S320、将S310中得到的混合物M41采用蒸发的方式除去溶剂，得到固体唾液酸甲酯；
    S330、将S320中得到的固体唾液酸甲酯和P 2O 5在真空干燥一段时间，得到混合物M42；
    S340、在S330中得到的混合物M42与无水吡啶共蒸发以除去水分，得到混合物M43；
    S350、将S340得到的混合物M43溶于无水吡啶中后，冷却至0℃，并加入对甲苯磺酰氯，得到混合物M44；
    S360、将S350中得到的混合物M44加热至室温并搅拌一段时间后，通过减压加热除去溶剂；
    S370、将S360除去溶剂后的残余物通过柱层析纯化，得到白色固体即为 TosSia methyl ester；
    其中，S370中柱层析所采用的EtOAc:MeOH＝20:1。
  7. 根据权利要求4所述的一种CD169高亲和力抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于，所述TCC-COOH的合成方法为：
    S410、在0℃下，将6-氯-8-氟苯并二氢吡喃-4-酮1溶解于二甲基甲酰胺中，并逐滴加入磷酰氯，得到混合物M51；
    S420、将S410得到的混合物M51在0℃下搅拌30分钟后加热至80℃，保温1.5小时后冷却至室温，得到混合物M52；
    S430、将S420得到的混合物M52冷却至室温后，加入1N NaOAc溶液淬灭后，加入二氯甲烷进行萃取，将萃取后的有机层进行真空浓缩，得到4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛；
    S440、在0℃下，于圆底烧瓶中，将S430得到的4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛溶解在乙醇溶液中，逐滴加入的巯基乙酸乙酯与乙醇钠于溶液中，得到混合物M53；
    S450、将S440得到的混合物M53升温至室温并搅拌过夜后，进行过滤，得到沉淀物后，用水洗涤并收集沉淀物；
    S460、将S450得到的沉淀物加入四氢呋喃和1N NaOH溶液中，并在50℃下搅拌24小时，得到混合物M54；
    S470、将S460得到的混合物M54冷却至室温，用CH 2Cl 2洗涤，并加入1N HCl酸化，将所得固体产物过滤，用水洗涤并干燥，即得到TCC-COOH。
  8. 如权利要求1所述的CD169高亲和力抗肿瘤化合物，在治疗肿瘤方面的用途。
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