CN116042775A - 一种钠离子检测试剂盒及其快速检测方法和应用 - Google Patents

一种钠离子检测试剂盒及其快速检测方法和应用 Download PDF

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樊帆
刘雪
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孙志忠
谭炎宁
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盛夏冰
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Abstract

本发明公开了一种钠离子检测试剂盒及其快速检测方法和应用，该检测试剂盒包括两条短核酸序列Enzymestrand和Substratestrand，其中Enzymestrand为Na+依赖性DNAzyme链，5'末端修饰有淬灭基团，Substratestrand为Na+依赖性DNAzyme底物链，3'末端修饰有荧光基团。本发明是以钠离子为分子生物标志物，通过基于Na+依赖性DNAzyme酶促反应和荧光共振能量转移(FRET)机制，建立Na+检测生物传感器，从而达到对Na+快速检测的目的，并可进一步应用于耐盐水稻品种的快速鉴定与选育。

Description

一种钠离子检测试剂盒及其快速检测方法和应用
技术领域
本发明属于钠离子检测及耐盐水稻品种的快速鉴定与选育技术领域，尤其涉及一种钠离子检测试剂盒及其快速检测方法和应用。
背景技术
盐碱胁迫对水稻的影响主要表现为抑制种子萌发、减少分蘖数、阻碍幼穗分化、降低产量和品质。水稻耐盐性是指在盐碱环境下水稻忍耐或抵抗盐碱胁迫的能力。深入开展水稻耐盐碱性研究，对发挥水稻品种在盐碱稻作区的产量潜力，进一步扩大水稻的可种植面积，对保障我国粮食安全和提高人民生活水平以及改善生态环境具有十分重要的意义。
目前已有的钠离子检测方法包括原子吸收光谱法、原子荧光法和比色法等，均存在不同程度的成本高、检测繁琐、容易受其他离子干扰的问题，因此开发一种以钠离子为分子生物标志物，实现对钠离子的快速检测，尤其是对耐盐水稻品种的快速鉴定与选育具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术中不能对水稻中钠离子进行快速检测的技术问题，本发明提供一种钠离子检测试剂盒及其快速检测方法和应用，该检测方法灵敏度高、稳定性好、成本低，整个检测过程周期短、反应迅速，便于快速推广使用，尤其对耐盐水稻品种的快速鉴定与选育具有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种钠离子检测试剂盒，包括Enzyme strand和Substratestrand。
所述Enzyme strand的核苷酸序列为：
5'--TCGCCATAGGTCAAAGGTGGGTGGGAGTTTTACTCCGCATTAGTGACTCGTGAC-3'，如SEQID No.1所示。
所述Substrate strand的核苷酸序列为：
5'-GTCACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGA-3'，如SEQ ID No.2所示，其中16bp处A碱基经过RNA修饰，具体表现为A碱基为腺嘌呤核糖核苷酸。正常的引物序列是由四种脱氧核糖核苷酸组成(DNA组成碱基)，RNA修饰是指将脱氧核糖核苷酸用核糖核苷酸代替(核糖核苷酸为RNA组成碱基)，本发明中的RNA修饰是指将A碱基用腺嘌呤核糖核苷酸代替腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。
所述Enzyme strand的5'末端修饰有荧光淬灭基团BHQ2，所述Substrate strand的3'末端修饰有荧光基团ROX。
本发明中Enzyme strand为Na+依赖性DNAzyme链，Substrate strand为Na+依赖性DNAzyme底物链，预杂交后核苷酸序列两端互补特征并能形成发夹结构，双链结构导致Enzyme strand链上的淬灭基团(BHQ2)和Substrate strand链上的荧光基团(ROX)彼此靠近，在荧光共振能量转移(FRET)作用下，预杂交后的混合液不显示出荧光信号或仅有微弱的背景荧光信号。
当环境中存在Na+时，游离的Na+与Enzyme strand中Na+依赖性DNAzyme酶链相结合，形成具有催化活性的酶链。被激活的酶链催化Substrate strand链从经过修饰的A碱基处切割，失去完整结构的Enzyme strand/Substrate strand/Na+复合体最终解体，释放出Na+、Enzyme strand链和被切割后的Substrate strand链。被释放的Na+将进一步参与到下一轮酶促反应循环中，而重新变为游离态的Enzyme strand链，则会和混合液中少量游离的Substrate strand链再次形成互补双链结构，在荧光共振能量转移(FRET)作用下，进一步降低背景信号。被切割后的Substrate strand游离片段，由于荧光基团(ROX)与淬灭基团(BHQ2)彼此分离，从而产生强荧光信号。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的检测试剂盒中，所述荧光淬灭基团选自BHQ2，所述荧光基团选自ROX、Cy3、Cy5、Fam中的一种。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的检测试剂盒中，所述荧光淬灭基团为BHQ2，所述荧光基团为ROX。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的检测试剂盒中，所述试剂盒中还包括Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液pH＝8.0～8.5。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的检测试剂盒中，所述Tris-HCl缓冲液包含45-55mM KCl，15-25mM MgCl2，15-25mM Tris。
本发明第二方面提供上述检测试剂盒对钠离子的快速检测方法，包括以下步骤：
S1、避光条件下，将所述试剂盒中的Enzyme strand和Substrate strand进行预杂交获得预杂交液。
S2、将待测样品与步骤S1中的预杂交液混合，检测混合液的荧光强度。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的快速检测方法中，S1具体为：避光条件下，将Enzyme strand和Substrate strand粉末分别用Tris-HCl缓冲液稀释后按体积比为4:1混合，然后加入Tris-HCl缓冲液将探针稀释至10-100nM，在90～97℃水浴锅中保温5-10min，自然冷却获得预杂交液。
本发明第三方面上述的钠离子检测试剂盒或利用上述钠离子检测试剂盒对钠离子的快速检测方法在耐盐水稻植株鉴定中的应用。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的应用中，包括以下步骤：
(1)取水稻植株完全展开叶中部叶段，洗净后完全浸入预杂交液中。
(2)进行抽真空处理，当压强达到-70至-80kPa时开始计时并维持10-30min，常温下置于黑暗环境中静置过夜。
(3)将静置过夜的水稻叶片置于植物活体分子影像系统中520nm波长处观察叶片荧光光谱。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的应用中，包括以下步骤：
(1)将水稻幼苗从地上1cm处剪断，收集断口处流出的伤流液，将伤流液与预杂交液混合。
(2)将混合液置于植物活体分子影像系统中520nm波长处观察伤流液荧光光谱。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的应用中，检测结果为样品中钠离子含量越高，荧光信号越强。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明是以Na+为分子生物标志物，通过基于Na+依赖性DNAzyme酶促反应和荧光共振能量转移(FRET)机制，建立Na+检测生物传感器，以实现对Na+的快速检测。该方法具有灵敏度高、稳定性好及成本低等独特优势，整个检测过程周期短、反应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。
(2)本发明中的Na+检测方法可对水稻叶片或伤流液中Na+的快速检测，从而实现耐盐水稻品种的快速鉴定与选育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中钠离子检测原理图；
图2为本发明实施例2中钠离子灵敏度检测结果图；
图3为本发明实施例3中水稻叶片中钠离子检测结果图；
图4为本发明实施例4中水稻流伤液中钠离子检测结果图；
图5为本发明对比例中苗期耐盐性鉴定结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
一种钠离子检测试剂盒。
试剂盒中包括Enzyme strand(酶链)和Substrate strand(底物链)，以及缓冲液。
其中Enzyme strand的DNA序列为：
5'--TCGCCATAGGTCAAAGGTGGGTGGGAGTTTTACTCCGCATTAGTGACTCGTGAC-3'，如SEQID No.1所示，其中5'末端的T碱基上修饰淬灭基团BHQ2。
所述Substrate strand的DNA序列为：
5'-GTCACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGA-3'，如SEQ ID No.2所示，3'末端的A碱基上修饰荧光基团ROX，其中16bp处A碱基经过RNA修饰，具体为A碱基为腺嘌呤核糖核苷酸。
缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0～8.5，其中Tris-HCl缓冲液包括45-55mMKCl，15-25mM MgCl2，15-25mM Tris，使用时利用Tris-HCl缓冲液稀释Enzyme strand和Substrate strand。
本发明中Enzyme strand和Substrate strand的工作原理见图1，Enzyme strand为Na+依赖性DNAzyme链，Substrate strand为Na+依赖性DNAzyme底物链，预杂交后核苷酸序列两端互补特征并能形成发夹结构，双链结构导致Enzyme strand链上的淬灭基团(BHQ2)和Substrate strand链上的荧光基团(ROX)彼此靠近，在荧光共振能量转移(FRET)作用下，预杂交后的混合液不显示出荧光信号或仅有微弱的背景荧光信号。
当环境中存在Na+时，游离的Na+与Enzyme strand中Na+依赖性DNAzyme酶链相结合，形成具有催化活性的酶链。被激活的酶链催化Substrate strand链从经过修饰的A碱基处切割，失去完整结构的Enzyme strand/Substrate strand/Na+复合体最终解体，释放出Na+、Enzyme strand链和被切割后的Substrate strand链。被释放的Na+将进一步参与到下一轮酶促反应循环中，而重新变为游离态的Enzyme strand链，则会和混合液中少量游离的Substrate strand链再次形成互补双链结构，在荧光共振能量转移(FRET)作用下，进一步降低背景信号。被切割后的Substrate strand游离片段，由于荧光基团(ROX)与淬灭基团(BHQ2)彼此分离，从而产生强荧光信号。
实施例2
检测试剂盒对钠离子的快速检测方法。
检测方法的灵敏度验证，具体包括以下步骤：
1、称取5.844gNaCl置于烧杯中，加入约50ml去离子水充分溶解，将溶液转移至100ml量筒中继续用去离子水定容至100ml，得到1M的NaCl母液。
2、Enzyme strand和Substrate strand预杂交：
2.1Enzyme strand和Substrate strand链由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.2Tris-HCl缓冲液的配制。首先称取0.242g Tris粉末置于烧杯中，加入少量去离子水溶解，然后继续加入去离子水定容至100mL，得到20mM的Tris溶液。另外，分别称取0.3728gKCl和0.19043g MgCl2置于烧杯中，加入少量20mM的Tris溶液，充分溶解后，继续用20mM的Tris溶液定容至100mL，最后用HCl溶液调整pH至8.0，得到Tris-HCl缓冲液。
2.3将Enzyme strand和Substrate strand干粉分别用Tris-HCl缓冲液稀释至100nM，稀释后的Enzyme strand和Substrate strand按4:1体积比进行混合，然后加入9倍总混合液体积的Tris-HCl缓冲液，将探针浓度稀释至10nM，将混合液充分混合后在95℃水浴锅中保温5-10min，关闭电源，让其自然冷却过夜，使Enzyme strand和Substrate strand预杂交形成互补双链结构，全程需避光条件下进行。
3、取十只平底内插管，向其中分别加入50μl预杂交液，另外向各管中加入NaCl母液和去离子水，使各管总体积为200μl同时，NaCl浓度呈0、100、200、300、400、500、600、700、800、900nM梯度排列，充分混匀后置于植物活体分子影像系统中进行显影拍照，检测结果参见图2。
由图2可知，当Na+浓度低至100nM(约为5.884x10-3g/L)时均能显示出荧光(检测到)，证明本申请的检测方法灵敏度高。
实施例3
利用上述试剂盒对耐盐水稻进行鉴定。应用的具体对象为耐盐水稻品种21H098和盐敏感水稻品种HZ叶片，具体包括以下步骤：
1、Enzyme strand和Substrate strand预杂交：
1.1、Tris-HCl缓冲液的配制。首先称取0.242g Tris粉末置于烧杯中，加入少量去离子水溶解，然后继续加入去离子水定容至100mL，得到20mM的Tris溶液。另外，分别称取0.3728gKCl和0.19043g MgCl2置于烧杯中，加入少量20mM的Tris溶液，充分溶解后，继续用20mM的Tris溶液定容至100mL，最后用HCl溶液调整pH至8.0，得到Tris-HCl缓冲液。
1.2、将Enzyme strand和Substrate strand干粉分别用Tris-HCl缓冲液稀释至100nM，稀释后的Enzyme strand和Substrate strand按4:1体积比进行混合，然后加入9倍总混合液体积的Tris-HCl缓冲液，将探针浓度稀释至10nM，将混合液充分混合后在95℃水浴锅中保温5min，关闭电源，让其自然冷却过夜，使Enzyme strand和Substrate strand预杂交形成互补双链结构，全程需避光条件下进行。
2、水稻幼苗培养：
2.1、取耐盐水稻品种(21H098)和盐敏感水稻品种(HZ)各50粒饱满种子，用清水浸种48小时，期间每隔12小时更换一次清水。取出种子用湿毛巾包好置于37℃恒温箱中催芽，种子露白后，将种子播种于底部开口96孔板中，每个品种九个生物学重复，然后将96孔板置于水培盒中，加入清水，使水面刚好没过种子为好，置于37℃光培室中让其继续生长。
2.2、水培生长两天后，将清水替换为水稻水培营养液使其继续生长，期间每隔3天更换一次营养液。正常培养2周后，每个品种分别取三个生物学重复，在营养液中加入NaCl，使其终浓度为200mM，剩余六个生物学重复正常培养，继续培养2天后，再次从正常培养的水稻苗中各取三个生物学重复进行200mM的NaCl培养1天。
3、水稻叶片侵染：
3.1、在2mL离心管中加入1.5mL去离子水，同时加入少量表面活性剂(Triton X-100)，使其充分混匀。
3.2、用剪刀分别从对照组、处理1天和处理3天的水稻幼苗第一片完全展开叶中部剪取1.5cm长叶段置于离心管中，上下颠倒混匀5min后，将水稻叶片转移至去离子水中清晰3遍。将水稻叶片取出并置于吸水纸上，充分去除表面残留水后，将叶片置于新的2mL离心管中。向离心管中分别加入步骤1.2中的预杂交液，使液面没过叶片顶端。
3.3、打开离心管并置于抽真空装置中进行抽真空处理，当压强达到-70kPa时开始计时并维持10min。取出离心管，盖上离心管盖，将离心管置于黑暗条件下静置过夜。
4、水稻叶片Na+检测：
4.1、次日用镊子小心取出水稻叶片，将叶片置于吸水纸上小心吸净表面预杂交液，于植物活体分子影像系统中观察叶片荧光光谱，激发光谱设定为520nm，检测结果参见图3。
4.2、水稻叶片中Na+含量越高，荧光信号越强。通过叶片荧光信号强弱，实现耐盐水稻品种的快速鉴定与选育。图3中HZ叶片荧光强度显著高于21H098叶片，说明21H098能够使叶片维持较低的Na+含量，因此耐盐性更强。
4.3、在采用新方法进行检测的同时，我们还同时取样采用电感耦合等离子体质谱仪对耐盐水稻品种21H098和盐敏感水稻品种HZ进行叶片中Na+含量检测，检测结果参见表1，检测结果与本实施例中检测结果一致。
表1：钠离子含量检测
实施例4
利用上述试剂盒对耐盐水稻进行鉴定。应用的具体对象为耐盐水稻品种21H098和盐敏感水稻品种HZ伤流液，具体包括以下步骤：
1、Enzyme strand和Substrate strand预杂交：
将Enzyme strand和Substrate strand干粉分别用Tris-HCl缓冲液稀释至100nM，稀释后的Enzyme strand和Substrate strand按4:1体积比进行混合，然后加入9倍总混合液体积的Tris-HCl缓冲液，将探针浓度稀释至10nM，将混合液充分混合后在95℃水浴锅中保温5min，关闭电源，让其自然冷却过夜，使Enzyme strand和Substrate strand预杂交形成互补双链结构，全程需避光条件下进行。
2、水稻植株伤流液的获取：
2.1、取耐盐水稻品种(21H098)和盐敏感水稻品种(HZ)各50粒饱满种子，用清水浸种48小时，期间每隔12小时更换一次清水。取出种子用湿毛巾包好置于37℃恒温箱中催芽，种子露白后，将种子播种于底部开口96孔板中，每个品种九个生物学重复，然后将96孔板置于水培盒中，加入清水，使水面刚好没过种子为好，置于37℃光培室中让其继续生长。
2.2、水培生长两天后，将清水替换为水稻水培营养液使其继续生长，期间每隔3天更换一次营养液。正常培养2周后，在营养液中加入NaCl，使其终浓度为200mM，继续培养3天后。
2.3、培养结束后，用剪刀在距离根部1cm处整齐剪断水稻幼苗并继续置于光培室中生长。半个小时后，可见在水稻幼苗断口出渗出伤流液，用移液枪分别收集21H098和HZ伤流液。
3、水稻伤流液Na+检测：
3.1、用移液枪吸取21H098和HZ伤流液各50μl分别置于干净平底内插管中，向两个管中分别加入5μl步骤(1)中的预杂交液，充分混匀后将平底内插管置于植物活体分子影像系统中观察荧光光谱，激发光谱设定为520nm，伤流液中Na+含量越高，荧光信号越强。通过伤流液荧光信号强弱，实现耐盐水稻品种的快速鉴定与选育，检测结果参见图4。图4中HZ水稻伤流液的荧光强度显著高于21H098，说明21H098能够使叶片维持较低的Na+含量，因此耐盐性更强。
对比例1
传统方法水稻苗期耐盐性鉴定。
1.1、200mM的NaCl培养的六个生物学重复继续进行盐胁迫处理，胁迫处理7天后改为正常营养液进行恢复培养，期间每隔三天更换一次营养液。
1.2、恢复培养7天后，进行表型调查，盐敏感材料HZ植株完全死亡，而耐盐材料21H098除部分叶片枯死外并无其他影响，传统水稻苗期耐盐性鉴定结果参见图5。
说明实施例3-4中的检方结果与传统鉴定方法一致，但相比于传统方法，本发明中的方法灵敏度高、稳定性好、整个检测过程周期短、反应更为迅速，更有利于推广。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种钠离子检测试剂盒，其特征在于，包括Enzyme strand和Substrate strand，
所述Enzyme strand的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述Substrate strand的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其中16bp处的A碱基为腺嘌呤核糖核苷酸；
所述Enzyme strand的5'末端修饰有荧光淬灭基团，所述Substrate strand的3'末端修饰有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的钠离子检测试剂盒，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自BHQ2，所述荧光基团选自ROX、Cy3、Cy5、Fam中的一种。
3.根据权利要求1所述的钠离子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液包含45-55mM KCl，15-25mM MgCl2，15-25mM Tris，所述Tris-HCl缓冲液pH＝8.0～8.5。
4.一种利用权利要求1-3任一所述的检测试剂盒对钠离子的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、避光条件下，将所述试剂盒中的Enzyme strand和Substrate strand进行预杂交获得预杂交液；
S2、将待测样品与步骤S1中的预杂交液混合，检测混合液的荧光强度。
5.根据权利要求4所述的快速检测方法，其特征在于，S1具体为：避光条件下，将Enzymestrand和Substrate strand粉末分别用Tris-HCl缓冲液稀释后按体积比为4:1混合，然后加入Tris-HCl缓冲液将探针稀释至10-100nM，在90～97℃水浴锅中保温5-10min，自然冷却获得预杂交液。
6.一种如权利要求1-3任一所述的钠离子检测试剂盒或权利要求4或5所述的快速检测方法在耐盐水稻植株鉴定中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取水稻植株完全展开叶中部叶段，洗净后完全浸入预杂交液中；
(2)进行抽真空处理，当压强达到-70至-80kPa时开始计时并维持10-30min，常温下置于黑暗环境中静置过夜；
(3)将静置过夜的水稻叶片置于植物活体分子影像系统中520nm波长处观察叶片荧光光谱。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将水稻幼苗从地上1cm处剪断，收集断口处流出的伤流液，将伤流液与预杂交液混合；
(2)将混合液置于植物活体分子影像系统中520nm波长处观察伤流液荧光光谱。
9.根据权利要求7-8任一所述的应用，其特征在于，检测结果为样品中钠离子含量越高，荧光信号越强。
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