CN116041782A - 一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于人工关节材料磨屑提取领域，尤其涉及一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，采用酶消化法从小牛血清润滑液中提取，木瓜蛋白酶和蛋白酶K的加量分别为小牛血清润滑液中蛋白质含量的2.25‑2.29％和0.73‑0.77％，本发明通过精确限定了加入的酶的用量，将小牛血清润滑液中的血清蛋白几乎完全分解，最终提取并观察到粒径为0.01μm‑1μm的聚合物磨屑，对进一步研究其形态、数量、产生机理以及提高人工关节的耐磨性和使用寿命具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于人工关节材料磨屑提取领域，尤其涉及一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法。
背景技术
随着我国人口老龄化的加剧、关节病年轻化的趋势，骨关节炎患者数量日益增多，使得人工关节置换术的需求进一步加大。据文献报道，美国2017、2018年接受全髋关节置换术和全膝关节置换术的患者分别约为110万例和130万例。我国范围内2011至2019年髋关节置换和膝关节置换年手术量的年均增长率为19.96％。
大量研究表明，人工关节长期磨损或离解产生的磨屑将引起一系列生物学反应，使关节假体产生无菌性松动(Aseptic loosening)，进而影响人工关节置换术的长期疗效。因此，分析人工关节假体运动过程中产生的磨屑形态、数量及其产生机理，对提高人工关节的耐磨性和使用寿命具有重要意义。
目前，人工关节假体配副材料经历了金属-金属、金属-聚合物、陶瓷-聚合物、陶瓷-陶瓷的发展。其中，金属-金属假体存在严重的离子释放问题，因而逐渐得到摒弃，陶瓷-陶瓷假体中因陶瓷异响、断裂也存在争议，金属-聚合物仍然是主流假体配副的首选。但聚合物磨屑在关节运动过程中的产生远远多于金属磨屑，而研究发现，这类高分子聚合物磨屑最易引发生物反应。
由于人工关节假体的临床试验周期很长，且人体内的生物摩擦磨损环境十分复杂，目前对人工关节摩擦磨损性能的研究主要使用摩擦磨损试验机在小牛血清等模拟体液润滑的条件下进行。与传统工业润滑液不同，小牛血清中含有的各种蛋白质大分子会对磨屑表征分析产生一定的干扰(如蛋白质分子会粘附在磨屑表面)，因此需要对收集到的润滑液样品中的血清成分进行分离处理，提取出不含各类大分子和杂质的溶液后，再对磨屑进行表征分析。(需要说明的是，不同部位的人工关节进行磨损实验时，方法略有不同，例如体外髋关节磨损实验依据标准ISO 14242-1-2014，而体外膝关节磨损实验依据的标准是ISO14243-1-2009或ISO 14243-3-2014。)
国际标准组织于2003年颁布ISO 17853，给出了提取的方法、原理、试剂、仪器等，提取方法包括酸消化法、碱消化法和酶消化法，其中碱消化法降解效果好，但易产生结晶，造成过多废液的出现，酸消化法操作简单，但降解效率不高，对磨屑的分析要求不高时可以采用，而不适用于形貌要求高的磨屑。蛋白酶消化法效果高，过程中不会产生沉淀，但操作复杂，且使用过程中蛋白酶的剂量需精确掌控，过少将无法彻底分解溶液中的血清蛋白，过多则会沉积在磨屑表面造成二次污染，干扰磨屑的后续表征。且随着技术的进步，这些磨屑的粒径也变得越来越小，因此有必要探究蛋白酶法中蛋白酶的用量获取更为有效且粒径更小的聚乙烯磨屑形貌信息。
中国发明专利CN113019716 A公开了一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，并公开了当溶剂为小牛血清时，在离心分离前先用酶降解法降解包含混合磨屑颗粒的小牛血清中的蛋白质。在其实施例中，添加的酶量为1.5ml的4.8U/1.5ml木瓜蛋白酶溶液和0.5ml 20mg/mL的蛋白酶K溶液(溶剂为10ml的25％小牛血清溶液)，最终用孔径为0.05μm的尼龙滤膜过滤得到了人工关节磨屑。
需要说明的是，上述专利以溶液中木瓜蛋白酶活性来确定加入的木瓜蛋白酶量，但酶催化活性或活性浓度本身是一个相对的概念，其大小与测定方法及测定条件有关，不同的测定方法，酶活性的结果可以相差数倍，本领域技术人员无法从上述专利的记载中准确得知木瓜蛋白酶的添加量与润滑液中血清蛋白浓度之间的关系。
此外，现有文献中，提取到的磨屑粒径大多在10μm-100μm之间，磨屑的粒径越小，越难以提取和观察。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服背景技术中所描述的不足，提供一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，通过精确限定添加的木瓜蛋白酶和蛋白酶K的量，最终可提取并观察到纳米级别的聚合物磨屑。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，采用酶消化法从小牛血清润滑液中提取；
其中，所述酶包括木瓜蛋白酶和蛋白酶K，所述木瓜蛋白酶和蛋白酶K的加量分别为所述小牛血清润滑液中蛋白质含量的2.25-2.29％和0.73-0.77％。
进一步的，具体包括以下步骤：
S1.向包含所述微纳米磨屑的小牛血清润滑液中加入等体积25g/L的十二烷基硫酸钠溶液，沸水浴保温8-12min，冷却至室温，然后将溶液pH值调至7-8，加入所述木瓜蛋白酶，60-70℃水浴保温42-54h；
S2.再向溶液中加入与步骤S1相同体积的25g/L的十二烷基硫酸钠溶液，沸水浴保温8-12min，冷却至室温，然后将溶液pH值调至7-8，加入所述蛋白酶K，在50-60℃条件下水浴保温20-30h；
S3.将溶液稀释100倍后以10000r/min的速度离心2h；
S4.提取上层清液稀释100倍后以10000r/min的速度离心20min，重复操作3次；
S5.将最后一次离心的上层清液采用0.05μm的聚碳酸酯滤膜进行过滤，干燥后得到所述微纳米磨屑。
进一步的，所述聚合物包括聚乙烯，聚醚醚酮和聚碳酸酯基聚氨酯。
进一步的，所述微纳米磨屑的粒径为0.01μm-1μm。
进一步的，步骤S1中，溶液的pH值采用40.99g/L的磷酸钠溶液和7.306g/L的乙二胺四乙酸溶液进行调节。
进一步的，步骤S2中，溶液的pH值采用6.057g/L的Tris溶液和稀盐酸进行调节。
进一步的，步骤S5中，所述干燥为于60℃真空干燥箱中干燥。
本发明的有益效果是：
本发明在采用酶消化法从小牛血清润滑液中提取聚合物人工关节微纳米磨屑时，通过精确限定了加入的酶的用量，能够将小牛血清润滑液中的血清蛋白几乎完全分解，排除其对磨屑的干扰作用，最终提取并观察到粒径为0.01μm-1μm的聚合物磨屑，对进一步研究其形态、数量及产生机理从而提高人工关节的耐磨性和使用寿命具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例蛋白酶消化后A1组溶液的拉曼分析光谱；
图2为本发明A1组小牛血清润滑液未进行酶消化前的电镜图；
图3为本发明A2组小牛血清润滑液未进行酶消化前的电镜图；
图4为本发明A1组实验提取到的聚合物磨屑的电镜图；
图5为本发明A1组实验提取到的聚合物磨屑的电镜图；
图6为本发明A2组实验提取到的聚合物磨屑的电镜图；
图7为本发明A2组实验提取到的聚合物磨屑的电镜图；
图8为本发明提取到的圆形/椭圆形磨屑能谱分析；
图9为本发明提取到的纳米聚集状磨屑能谱分析；
图10为本发明BCA法测量蛋白质浓度的标准曲线；
图11为本发明聚合物磨屑提取流程图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：体外磨损实验
本实施例实验分为4组，分别为A1，A2，A3和A4组，人工髋关节磨损实验依据标准ISO 14242-1-2014进行。
本实施例使用的小牛血清购买自维森特，New Born Calf Serum，型号为：076-150，本实施例提取的磨屑为聚乙烯磨屑，实验结束后，将各组小牛血清润滑液保存于冰箱待用。
实施例2：小牛血清润滑液中蛋白浓度的测定
将实施例1中的4组经体外磨损实验后的小牛血清润滑液通过BCA法测量溶液蛋白浓度，测试结果如下表所示：
实施例3：微纳米磨屑的提取
分别取上述各组溶液2ml，加入25g/L的十二烷基硫酸钠2ml，在100℃的水浴中保温10分钟取出，冷却至室温，用40.99g/L的磷酸钠溶液和7.306g/L的EDTA溶液将溶液PH调至7.4，加入木瓜蛋白酶，在65℃的水浴中降解48小时。
将溶液从水浴锅中取出，再分别加入十二烷基硫酸钠溶液2ml，在100℃的水浴中保温十分钟，冷却至室温。用6.057g/L的Tris溶液和浓盐酸稀释液将溶液PH调至7.6，加入蛋白酶K，在55℃水浴中降解24小时。
将降解后溶液分移入50ml的离心管中，稀释100倍左右，将离心管放入离心机，以10000r/min速度离心2h，提取上层清液稀释并离心，离心时间20分钟，重复3次。
将上层区溶液用孔径0.05μm的聚碳酸酯滤膜进行过滤，产品通过滤纸包裹后在60℃真空干燥箱中干燥。
本实施例使用的木瓜蛋白酶购自克拉玛尔，200万U/g，蛋白酶K购自墨克33.5，units/mg，加入酶前，先配制1g/L的木瓜蛋白酶和1mg/mL的蛋白酶K溶液，通过2ml和1ml的移液枪添加。
各组木瓜蛋白酶和蛋白酶K的加量如下表所示：
实施例4：拉曼分析
将上述各组蛋白酶降解处理后的溶液进行拉曼分析，具体操作为：收集蛋白降解处理前后的溶液，用滴定管滴于CoCrMo金属盘表面并进行干燥，多次滴定并进行干燥处理。采用波长520nm，功率350mW的激光点扫，观察1600-1700cm-1中，酰胺I区α-螺旋(1655cm-1)、β-折叠(1619cm-1)、无规则卷曲(1638cm-1)的变化，判断血清蛋白的降解情况。
图1为A1组的拉曼光谱图，可以看出，其酰胺I区无α-螺旋(1655cm-1)、β-折叠(1619cm-1)、无规则卷曲(1638cm-1)，说明包裹于磨屑外的蛋白被全部降解。
图2和图3分别为上述A1和A2组小牛血清润滑液未进行酶消化前的电镜图，可以看到，聚合物磨屑被蛋白质分子所缠结、包裹，无法观察其具体形貌。
图4、图5与图6、图7分别为上述A1和A2组提取得到的聚合物磨屑的电镜图，可以看出，蛋白质分子几乎被完全降解，能够很清晰的观察到粒径在0.01-1μm范围内的聚合物磨屑的形貌特征。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，采用酶消化法从小牛血清润滑液中提取；
其中，所述酶包括木瓜蛋白酶和蛋白酶K，所述木瓜蛋白酶和蛋白酶K的加量分别为所述小牛血清润滑液中蛋白质含量的2.25-2.29％和0.73-0.77％。
2.根据权利要求1所述的一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.向包含所述微纳米磨屑的小牛血清润滑液中加入等体积25g/L的十二烷基硫酸钠溶液，沸水浴保温8-12min，冷却至室温，然后将溶液pH值调至7-8，加入所述木瓜蛋白酶，60-70℃水浴保温42-54h；
S2.再向溶液中加入与步骤S1相同体积的25g/L的十二烷基硫酸钠溶液，沸水浴保温8-12min，冷却至室温，然后将溶液pH值调至7-8，加入所述蛋白酶K，在50-60℃条件下水浴保温20-30h；
S3.将溶液稀释100倍后以10000r/min的速度离心2h；
S4.提取上层清液稀释100倍后以10000r/min的速度离心20min，重复操作3次；
S5.将最后一次离心的上层清液采用0.05μm的聚碳酸酯滤膜进行过滤，干燥后得到所述微纳米磨屑。
3.根据权利要求1所述的一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，所述聚合物包括聚乙烯，聚醚醚酮和聚碳酸酯基聚氨酯。
4.根据权利要求1所述的一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，所述微纳米磨屑的粒径为0.01μm-1μm。
5.根据权利要求2所述的一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，步骤S1中，溶液的pH值采用40.99g/L的磷酸钠溶液和7.306g/L的乙二胺四乙酸溶液进行调节。
6.根据权利要求2所述的一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，步骤S2中，溶液的pH值采用6.057g/L的Tris溶液和稀盐酸进行调节。
7.根据权利要求2所述的一种聚合物人工髋关节微纳米磨屑的提取方法，其特征在于，步骤S5中，所述干燥为于60℃真空干燥箱中干燥。
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