CN113019716A - 一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，混合磨屑加入溶剂中，得到包含混合磨屑的溶液，置于离心容器中，经n次离心分离提取，将混合磨屑分离开，分别获得两种人工关节材料的磨屑，n≥3；第一次离心：10000r/min速度离心1‑2h后，离心容器内的溶液被划分为上层区、混合区、下层区三个区，由上至下依次吸取溶液；其中，取自上层区的小密度磨屑溶液、取自下层区的大密度磨溶液进行过滤，分离出混合磨屑；取自混合区的未完全分离混合溶液移入二次离心容器内，进行第二次稀释后离心；由此重复至离心n次。本发明可以有效将人工关节混合磨屑进行分离，提高人工关节磨屑提取率，为准确分析人工关节材料的摩擦磨损机理提供有力保障。

Description

一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法

技术领域

本发明属于人工关节磨屑提取方法技术领域，具体涉及一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法。

背景技术

随着我人口平均寿命的增加及老龄化的加剧，各种骨关节疾病的发病率不断升高，这极大地促进了骨关节外科的发展。据统计，我国人工关节置换量每年呈比例递增。人工关节植入人体后，关节的摩擦磨损产生的磨屑颗粒会诱导破骨细胞、溶骨细胞等产生溶骨因子等，诱发骨骼溶解，导致的假体无菌性松动是人工关节假体失效的最主要原因。

目前人工关节的常用配副形式有：钴铬钼(CoCrMo)/超高分子量聚乙烯(UHMWPE)配副和氧化锆(ZrO₂)陶瓷/超高分子量聚乙烯(UHMWPE)粉末配副，同时聚醚醚酮 (PEEK)/超高分子量聚乙烯(UHMWPE)配副是一种有潜力应用的配副形式。

评价人工关节摩擦磨损性能主要利用人工关节模拟器的体外磨损实验，实验中血清被用做模拟润滑液模拟关节液成分。由此人工关节会产生不同形态、尺寸、组成的不同密度比材料的混合磨屑。磨屑特征对研究人工关节的摩擦学行为、机理以及生物相容性具有重要作用，这就需要一种可靠的从人工关节体外磨损试验润滑液中提取磨屑的方法。

人工关节磨屑提取一直是困扰人工关节磨屑研究的难题。人工关节磨屑散落于小牛血清润滑液中，表面通过电离作用、疏水作用、亲水作用与血清或关节液中的蛋白质结合，被多层蛋白质包裹形成蛋白晕。人工关节磨屑提取首先需要排除血清中蛋白质或脂类的干扰，其中降解小牛血清中的蛋白质是人工关节磨屑提取的主要步骤之一。

人工磨屑提取的另外一项重要步骤是混合磨屑的分离和过滤。由于提取过程中，人工关节磨屑会随着去除的溶液流失，或者附着在离心管等容器壁上，导致人工关节磨屑提取率不高。

许多学者已经开展了人工关节磨屑提取的研究，但多数只是针对某一种人工关节磨屑的提取方法，极少有针对两种不同混合磨屑同时提取的研究。磨屑的提取率是一个量化指标，反映了可以获取磨屑量的多少和比例，以往的研究中，对磨屑提取率的研究多数是对单一材料，如金属、钛合金，陶瓷与超高分子量聚乙烯(UHMWPE)。与溶液密度差大的人工关节磨屑提取率较高，S.Las2016年发表于Acta Biomaterialia论文中，提出了从小牛血清中提取陶瓷和CoCr合金磨屑的方法，颗粒平均提取率达到80％，J.Patel 2018年发表于Acta Biomaterialia论文中从人体组织中提取Si4N3陶瓷磨屑，提取率可以达到89.6％。UHMWPE磨屑提取的研究很多，但对提取率的研究极少报道，P.Campbell 1994年发表于Journal of Biomedical Materials Research论文提出的提取UHMWPE的方法，UHMWPE提取率仅有40％。

因此，有必要提出一种适应于不同密度比的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，有效地将混合磨屑进行分离，提高人工关节磨屑的提取率，获得更加清晰的磨屑轮廓，为磨屑量化分析和形态分析奠定基础，为进一步人工关节磨损性能和磨损机理研究提供依据。

发明内容

本发明的目的是提出一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，有效地将混合磨屑进行分离，提高人工关节磨屑提取率。本发明提出一种不同密度比人工关节混合磨屑提取方法，为实际从包含人工关节混合磨屑的溶剂分离提取磨屑提供支持，为准确分析人工关节材料的摩擦磨损机理提供有力保障。

本发明的技术方案如下：

本发明的目的在于，提供一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，混合磨屑与溶剂形成的包含混合磨屑的溶液，置于离心容器中，经n次离心分离提取，将混合磨屑分离开，分别获得大密度、小密度两种人工关节材料的磨屑溶液，其中n≥3；所述溶剂包括小牛血清、去离子水、生理盐水或模拟体液其中任意一种，且当溶剂为小牛血清时，在离心分离前先用酶降解法降解包含混合磨屑颗粒的小牛血清中的蛋白质；具体包括以下步骤：

第一次离心：首次离心，离心容器内的溶液被划分为上层区、混合区、下层区三个区，由上至下依次吸取溶液；其中，取自上层区的小密度磨屑溶液、取自下层区的大密度磨溶液进行过滤，分离出混合磨屑；取自混合区的未完全分离混合溶液移入二次离心容器内，进行第二次稀释后离心；

第2～n-1次离心：重复第一次离心的步骤，分离出混合磨屑，未完全分离混合溶液移入下一次离心容器内，进行下一次稀释后离心；

第n次离心：最后一次离心，离心容器内的溶液被划分为上层区的小密度磨屑溶液、下层区的大密度磨溶液两个区，由上至下依次吸取溶液进行过滤，分离出混合磨屑。

进一步的，所述混合磨屑为包括CoCrMo/UHMWPE混合磨屑、ZrO₂/UHMWPE混合磨屑和PEEK/UHMWPE混合磨屑在内的其中任意一种。

进一步的，所述混合磨屑为包括密度比8.70:1的CoCrMo/UHMWPE混合磨屑、密度比6.28:1的ZrO₂/UHMWPE混合磨屑和密度比1.43:1PEEK/UHMWPE混合磨屑在内的其中任意一种。

更进一步的，所述混合磨屑为CoCrMo/UHMWPE时，第一次离心后得到的划为三层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液的35％-50％、3.75％-5％；第n次离心后得到的划为两层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液的70％-80％、 20％-30％。

进一步的，所述混合磨屑为ZrO₂/UHMWPE混合磨屑时，第一次离心后得到的划为三层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的25％-35％、5％-7.5％；第n 次离心后得到的划为两层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的 60％-70％、30％-40％。

进一步的，所述混合磨屑为PEEK/UHMWPE混合磨屑时，第一次离心后得到的划为三层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的5％-12％、5％-10％，第n 次离心后得到的划为两层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的 45％-55％、45％-55％。

进一步的，所述每一次离心后，取自上层区的小密度磨屑溶液、取自下层区的大密度磨溶液进行过滤，并计算当次的磨屑提取率，单次的磨屑提取率的总和即为n次离心分离提取的总磨屑提取率；所述当次的磨屑提取率的计算方法为：

过滤后取滤纸，40～80℃真空干燥箱中干燥1～5小时，取出滤纸冷却10～30分钟，称重，滤纸和颗粒总质量记为m₁；

将滤纸放入盛有酒精的烧杯中，在超声清洗机中震荡10～30分钟，取出后放入 40～80℃真空干燥箱中干燥1～5小时后称重，得到滤纸质量m₂，将两次称重结果相减得到提取后颗粒质量m₁-m₂，计算出磨屑的提取率RR为：

式中m为实验前加入的相应磨屑质量。

进一步的，用孔径0.05μm的尼龙滤膜进行过滤，过滤前用磨屑溶液至少100倍体积的去离子水稀释。

进一步的，每一次所述离心速度为8000～15000r/min转速离心1-2h，优选为10000r/min。

更进一步的，所述酶降解法是指包含混合磨屑颗粒的小牛血清溶液先后经过木瓜蛋白酶、蛋白酶K两种蛋白酶进行酶降解，具体方法为：

包含混合磨屑颗粒的小牛血清溶液中加入十二烷基硫酸钠，沸水浴保温5～15分钟，冷却至室温；

溶液PH调至7～8，加入4.8U木瓜蛋白酶溶液，60～70℃水浴保温20～30小时；

再加入十二烷基硫酸钠溶液，沸水浴保温5～15分钟，冷却至室温；

溶液PH调至7～8，加入用相同PH的tris-HCl溶液稀释成20mg/mL的蛋白酶K溶液，50～60℃水浴保温20～30小时。

有益效果：由于采用人工关节磨屑多次离心分离提取的方法，实现了不同密度比的人工关节配副颗粒同时分离提取，有效地将混合磨屑进行分离，且提高了不同密度人工关节磨屑提取率，尤其明显提高了低密度UHMWPE颗粒提取率，为人工关节的摩擦学行为、机理以及生物相容性研究提供了可靠依据。

附图说明

图1为本发明的人工关节磨屑多次离心分离提取流程图。

图2为前三次离心后溶液提取区域示意图。

图3为四次离心后溶液提取区域示意图。

图4 为CoCrMo/UHMWPE混合颗粒提取率。

图5 为ZrO₂/UHMWPE混合颗粒提取率。

图6 为PEEK/UHMWPE混合颗粒提取率。

图7为提取后CoCrMo颗粒能谱分析结果，a.第一次提取CoCrMo颗粒，b.第二次提取CoCrMo颗粒，c.第三次提取CoCrMo颗粒

图8 为CoCrMo/UHMWPE组上层区提取前后颗粒FITR光谱曲线

图9为提取后ZrO₂颗粒能谱分析结果，a.第一次提取ZrO₂颗粒，b.第二次提取ZrO₂颗粒，c.第三次提取ZrO₂颗粒

图10 为ZrO₂/UHMWPE组上层区提取前后颗粒FITR光谱曲线

图11为 PEEK/UHMWPE组上，下层区颗粒FITR曲线，a.下层区PEEK颗粒和提取前PEEK颗粒FITR曲线，b.上层区UHMWPE颗粒和提取前UHMWPE颗粒FITR曲线

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。

如图1所示为本发明的人工关节磨屑多次离心分离提取流程图，此流程为研究不同溶剂中人工关节混合磨屑多次离心分离提取方法的步骤，由于直接采用实际的混合磨屑溶剂体系不便于体现提取率，也就无法对比前后提取效果，故本发明实施例使用模拟体系进行实验，首先采用常见的混合磨屑与常见的溶剂模拟包含混合磨屑的溶液，再进行多次分离提取，并计算其提取率，验证提取效果。目的是为实际分离提取不同润滑介质中的人工关节混合磨屑提供支持。

实施例1-3使用的溶剂为小牛血清，按下列步骤实现：用酶降解法降解小牛血清中的蛋白质后，多次离心提取。本发明用实验材料有超高分子量聚乙烯(UHMWPE)粉末，钴铬钼(CoCrMo)颗粒，氧化锆(ZrO₂)纳米陶瓷颗粒，聚醚醚酮(PEEK)粉末，小牛血清，木瓜蛋白酶，蛋白酶K，磷酸钠，乙二胺四乙酸，浓HCL，Tris，0.05μm尼龙滤膜。

以下采取3个实施例对于溶剂选用小牛血清时，不同的密度比的配副形式进行具体的说明。

实施例1配副形式为CoCrMo/UHMWPE

所述“人工关节磨屑多次提取的方法”主要包括步骤如下：

(1)用去离子水将小牛血清稀释成体积分数为25％的小牛血清溶液，作为储备溶液 (PH＝7.08)，冷冻备用(-25℃)。

(2)将所用人工关节磨屑粉末在60℃真空干燥箱干燥3小时，期间每隔半个小时搅拌粉末，使粉末充分干燥，将粉末取出，装入密封袋中，室温保存备用。按照CoCrMo/UHMWPE组合用精度为十万分之一分析天平称取颗粒各10mg左右，记为m，充分混合加入离心管或其他反应容器中；加入10ml 25％小牛血清溶液，考虑到聚合物颗粒在溶液中分散性不好，容易团聚，故对其进行超声分散，然后在室温条件下静置培养24小时，以使颗粒被溶液中的蛋白质充分包裹。此步骤的目的是模拟人工关节磨屑在人工关节体外实验润滑液中的状态。

(3)采用蛋白酶降解法降解混合溶液中的蛋白质，去除包裹颗粒的蛋白质方法步骤如图1：将包含颗粒的小牛血清溶液加入25g/L十二烷基硫酸钠10ml，在100℃的水浴中保温10分钟取出，冷却至室温；用250mmol/L磷酸钠溶液和 25mmol/LEDTA溶液将溶液PH调至7.4，加入1.5ml的4.8U/1.5ml木瓜蛋白酶溶液，在65℃的水浴中保温24小时；将上述溶液从水浴锅中取出，加入十二烷基硫酸钠溶液10ml，在100℃的水浴中保温十分钟，冷却至室温；用 250mmol/L磷酸钠缓冲液和25mmol/LEDTA缓冲液将PH调至7.6，加入0.5ml 用tris-HCl溶液(PH7.6)稀释成20mg/mL的蛋白酶K溶液，在55℃水浴中保温24小时。

(4)将所得溶液分移入50ml的离心管中，并用去离子水冲洗原来离心管或其他反应容器，冲洗后的溶液分装入该50ml的离心管中，管内溶液达到离心管的2/3 处。

(5)将离心管放入离心机，以10000r/min速度离心1-2h。

(6)小心将离心管从离心机中取出，将离心后的离心管内的溶液被划分为上层区(包含小密度磨屑的溶液)、混合区(未完全分离混合溶液)、下层区(包含大密度磨屑的溶液)三个区进行分别处理(如图2)：分别用吸管按上层区、混合区和下层区顺序依次吸取溶液，上层区溶液进行过滤，混合区溶液移入新的离心管内，下层区溶液进行过滤。经过理论计算和实验证明，不同密度比人工关节混合磨屑，三个区划分不同：CoCrMo/UHMWPE混合磨屑提取时，首先提取的上层区溶液为总溶液上部的35％-50％，然后提取混合区溶液，剩余总溶液的3.75％-5％的下层区溶液，最后提取下层区溶液。

(7)提取后的上层区溶液和下层区溶液分别用孔径0.05μm的尼龙滤膜进行过滤。过滤时用提取溶液100倍体积的去离子水稀释，平均分7-8次冲洗过滤设备壁，同时冲洗颗粒，防止颗粒附着在离心设备壁上和所用药品结晶影响提取结果。

(8)将带有磨屑颗粒的滤纸在60℃真空干燥箱中干燥3小时，取出滤纸冷却20分钟，称重，滤纸和颗粒总质量记为m₁。

(9)将滤纸放入盛有20ml酒精的烧杯中，在超声清洗机中震荡20分钟，取出后放入60℃真空干燥箱中干燥3小时后称重，得到滤纸质量m₂，将两次称重结果相减得到提取后颗粒质量m₁-m₂，按照公式计算出磨屑的提取率RR为：

式中m为实验前加入的相应磨屑的质量。

(10)用去离子水冲洗原离心管管壁，冲洗后液体移入混合区溶液的新离心管，并将混合区溶液用去离子水稀释至离心管2/3处。

(11)重复5-10步骤的操作，进行二次离心分离提取。

(12)重复5-10步骤的操作，进行三次离心分离提取。

(13)三次离心分离提取后，依次重复10，4，5步骤操作，进行第四次离心分离提取。小心将各组离心管从离心机中取出，将离心后的离心管内的溶液划分为上层区(包含小密度磨屑的溶液)和下层区(包含大密度磨屑的溶液)两个区进行分别处理(如图3)。分别用吸管按顺序依次提取上层区和下层区溶液，然后分别进行分离过滤。经过实验证明，不同密度比人工关节混合磨屑，两个区划分不同，CoCrMo/UHMWPE混合磨屑提取时，首先提取上层区溶液为总溶液上部的70％-80％，然后提取下层区溶液为剩余的20％-30％。

实施例2配副形式为ZrO₂/UHMWPE

步骤同实施例1，区别在于：配副形式为ZrO₂/UHMWPE，及相应的以下步骤不同：

步骤(6)中，ZrO₂/UHMWPE混合磨屑提取时，首先提取的上层区溶液为总溶液上部的25％-35％，然后提取混合区溶液，剩余总溶液的5％-7.5％为下层区溶液，最后提取下层区溶液。

步骤(13)中，ZrO₂/UHMWPE混合磨屑提取时，首先提取上层区溶液为总溶液上部的60％-70％，然后下层区溶液为剩余的30％-40％。

实施例3配副形式为PEEK/UHMWPE

步骤同实施例1，区别在于配副形式为PEEK/UHMWPE，及相应的以下步骤不同：

步骤(6)中，PEEK/UHMWPE混合磨屑提取时，首先提取的上层区溶液为总溶液的5％-12％，然后提取混合区溶液，剩余总溶液的5％-10％的下层区溶液，最后提取下层区溶液。

步骤(13)中，PEEK/UHMWPE混合磨屑提取时，首先提取上层区溶液上部的45％-55％，然后提取下层区溶液为剩余的45％-55％。

实施例的结果分析：

首先，按照7-9步骤，计算出四次离心后的提取率结果(如图4，5，6)，直至无法称重测量颗粒量的多少。由于第四次提取颗粒数量极少，无法称重测量颗粒质量，本文称量结果及成分测试结果只取前三次提取结果。

经过四次离心提取，CoCrMo/UHMWPE组CoCrMo颗粒的提取率达到91.19％，UHMWPE颗粒提取率达到82.29％，提取率分别比单次离心提取增加了6.7％和23.44％； ZrO₂/UHMWPE组，ZrO₂颗粒的提取率达到99.81％，UHMWPE颗粒提取率达到87.28％，提取率分别比单次离心提取增加了10.91％和15.32％；PEEK/UHMWPE组，PEEK颗粒的提取率达到91.94％，UHMWPE颗粒提取率达到88.81％，提取率分别比单次离心提取增加了9.95％和15.1％。

其次，对提取后颗粒的成分进行分析。

由图7EDS结果可知，CoCrMo/UHMWPE组下层区磨屑同时包含Co，Cr，Mo三种元素，可以确定提取后颗粒为CoCrMo颗粒，且CoCrMo颗粒没有掺入UHMWPE或者其他未知颗粒。如图8所示，CoCrMo/UHMWPE组上层区提取后磨屑与提取前UHMWPE 颗粒红外光谱曲线一致，均在2919cm^-1(C-H(-C-(CH₂)n-C-n≥4)，2850cm^-1 ((-C-(CH₂)n-C-，n≤3)，1463cm^-1(C-H，面内伸缩振动)，719cm^-1(C-H，面外伸缩振动) 位置出现相应峰值，可以表明提取上层区磨屑为UHMWPE，且没有掺入杂质。如图9 所示，ZrO₂/UHMWPE组提取后ZrO₂磨屑EDS结果，提取后磨屑同时包含Zr,O元素，可以确定提取后磨屑为ZrO₂颗粒。如图10所示，ZrO₂/UHMWPE组上层区提取后磨屑与提取前UHMWPE颗粒FITR光谱曲线对比，提取前后颗粒峰值位置基本一致，可以表明提取上层区磨屑为UHMWPE，提取过程中没有掺入杂质。。如图11所示， PEEK/UHMWPE组上，下层区提取后颗粒与提取前UHMWPE颗粒FITR光谱曲线对比，如图11a所示，PEEK/UHMWPE组，上、下层区磨屑FITR曲线，PEEK磨屑提取前后在1080cm^-1(醚键)，芳香醚键(1225cm^-1)，苯环骨架(1400-1600cm^-1)，芳香酮(1650cm^-1) 均有相应的特征峰。可以表明提取前后均为PEEK，提取过程中没有掺入杂质。如图11b 所示，上层区UHMWPE磨屑与提取前UHMWPE曲线对比，提取前后颗粒峰值位置基本一致，可以表明提取上层区磨屑为UHMWPE，提取过程中没有掺入杂质。

以下实施例4-6为溶剂选用去离子水或生理盐水或模拟体液(人工关节材料摩擦实验的其他常用润滑介质)时，人工关节磨屑多次离心分离的方法。

实施例4溶剂为去离子水

将所用人工关节磨屑粉末在60℃真空干燥箱干燥3小时，期间每隔半个小时搅拌粉末，使粉末充分干燥，将粉末取出，装入密封袋中，室温保存备用。按照 CoCrMo/UHMWPE组合用精度为十万分之一分析天平称取颗粒各10mg左右，记为m，充分混合加入离心管或其他反应容器中。

加入10ml去离子水超声震荡20分钟以使人工关节颗粒分散，模拟人工关节磨屑在人工关节体外的状态，由于颗粒在溶液中的沉降速度只与颗粒直径、离心速度、溶剂粘度有关，而实验证明去离子水的粘度与降解后的牛血清溶液粘度相近，所以在相同离心条件下，颗粒在去离子水中的沉降速度也相近。

其余后续多次离心分离步骤同实施例1中步骤(4)-(13)。

实施例5溶剂为生理盐水

将所用人工关节磨屑粉末在60℃真空干燥箱干燥3小时，期间每隔半个小时搅拌粉末，使粉末充分干燥，将粉末取出，装入密封袋中，室温保存备用。按照CoCrMo/UHMWPE组合用精度为十万分之一分析天平称取颗粒各10mg左右，记为m，充分混合加入离心管或其他反应容器中。

加入10ml生理盐水超声震荡20分钟以使人工关节颗粒分散，模拟人工关节磨屑在人工关节体外实验润滑液中的状态，由于颗粒在溶液中的沉降速度只与颗粒直径、离心速度、溶剂粘度有关，而实验证明生理盐水的粘度与降解后的牛血清溶液粘度相近，所以在相同离心条件下，颗粒在生理盐水中的沉降速度也相近。

其余后续多次离心分离步骤同实施例1中步骤(4)-(13)。

实施例6溶剂为模拟体液

将所用人工关节磨屑粉末在60℃真空干燥箱干燥3小时，期间每隔半个小时搅拌粉末，使粉末充分干燥，将粉末取出，装入密封袋中，室温保存备用。按照 CoCrMo/UHMWPE组合用精度为十万分之一分析天平称取颗粒各10mg左右，记为m，充分混合加入离心管或其他反应容器中。

加入10ml模拟体液超声震荡20分钟以使人工关节颗粒分散，模拟人工关节磨屑在人工关节体外实验润滑液中的状态，由于颗粒在溶液中的沉降速度只与颗粒直径、离心速度、溶剂粘度有关，而实验证明模拟体液的粘度与降解后的牛血清溶液粘度相近，所以在相同离心条件下，颗粒在模拟体液中的沉降速度也相近。

其余后续多次离心分离步骤同实施例1中步骤(4)-(13)。

以上实施例4-6获得了与实施例1相近的结果，说明当人工关节材料摩擦实验润滑介质(即溶剂)选用小牛血清、去离子水、生理盐水或模拟体液时，都可以作为本发明中人工关节材料体外实验的常用溶剂，用于不同人工关节混合磨屑的分离提取，而且都具有良好的技术效果。

以上实例以常见的润滑介质及常见的混合磨屑为例，详细说明阐述了一种人工关节混合磨屑分离提取方法的可行性方案，本发明研究了不同溶剂中人工关节混合磨屑多次离心分离提取方法的步骤，其目的在于：提出可靠的人工关节混合磨屑多次离心分离的方法，为从常见润滑介质中分离提取人工关节混合磨屑提供支持；此外，本发明所提出的混合磨屑分离提取方法，还可以应用于其他人工关节材料摩擦实验润滑介质中，也适用于其他混合磨屑的分离提取，并不仅限于本发明所列举的润滑介质和混合磨屑的种类。比如步骤1,2是模拟人工关节磨屑在人工关节体外实验润滑液中的状态，步骤9是对提取率RR的计算即对提取效果的验证，而实际应用中，对于既有的人工关节磨屑溶液，则不需要操作步骤1,2和9。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：混合磨屑加入溶剂中形成的包含混合磨屑的溶液，置于离心容器中，经n次离心分离提取，将混合磨屑分离提取，分别获得大密度、小密度两种人工关节材料的磨屑溶液，其中n≥3；所述溶剂包括小牛血清、去离子水、生理盐水或模拟体液其中任意一种，且当溶剂为小牛血清时，在离心分离前先用酶降解法降解包含混合磨屑颗粒的小牛血清中的蛋白质；具体包括以下步骤：

第一次离心：首次离心，离心容器内的溶液被划分为上层区、混合区、下层区三个区，由上至下依次吸取溶液；其中，取自上层区的小密度磨屑溶液、取自下层区的大密度磨溶液进行过滤，分离出混合磨屑；取自混合区的未完全分离混合溶液移入二次离心容器内，进行第二次稀释后离心；

第2～n-1次离心：重复第一次离心的步骤，分离出混合磨屑，未完全分离混合溶液移入下一次离心容器内，进行下一次稀释后离心；

第n次离心：最后一次离心，离心容器内的溶液被划分为上层区的小密度磨屑溶液、下层区的大密度磨溶液两个区，由上至下依次吸取溶液进行过滤，分离出混合磨屑。

2.根据权利要求1所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：所述混合磨屑为包括CoCrMo/UHMWPE混合磨屑、ZrO₂/UHMWPE混合磨屑和PEEK/UHMWPE混合磨屑在内的其中任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：所述混合磨屑为包括密度比8.70:1的CoCrMo/UHMWPE混合磨屑、密度比6.28:1的ZrO₂/UHMWPE混合磨屑和密度比1.43:1PEEK/UHMWPE混合磨屑在内的其中任意一种。

4.根据权利要求1或2所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：所述混合磨屑为CoCrMo/UHMWPE时，第一次离心后得到的划为三层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液的35％-50％、3.75％-5％；第n次离心后得到的划为两层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液的70％-80％、20％-30％。

5.根据权利要求1或2所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：所述混合磨屑为ZrO₂/UHMWPE混合磨屑时，第一次离心后得到的划为三层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的25％-35％、5％-7.5％；第n次离心后得到的划为两层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的60％-70％、30％-40％。

6.根据权利要求1或2所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：所述混合磨屑为PEEK/UHMWPE混合磨屑时，第一次离心后得到的划为三层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的5％-12％、5％-10％，第n次离心后得到的划为两层的溶液中，上层区、下层区的溶液分别为总溶液上部的45％-55％、45％-55％。

7.根据权利要求1或2所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：所述每一次离心后，取自上层区的小密度磨屑溶液、取自下层区的大密度磨溶液进行过滤，并计算当次的磨屑提取率，单次的磨屑提取率的总和即为n次离心分离提取的总磨屑提取率；所述当次的磨屑提取率的计算方法为：

过滤后取滤纸，40～80℃真空干燥箱中干燥1～5小时，取出滤纸冷却10～30分钟，称重，滤纸和颗粒总质量记为m₁；

将滤纸放入盛有酒精的烧杯中，在超声清洗机中震荡10～30分钟，取出后放入40～80℃真空干燥箱中干燥1～5小时后称重，得到滤纸质量m₂，将两次称重结果相减得到提取后颗粒质量m₁-m₂，计算出磨屑的提取率RR为：

式中，m为实验前加入的相应磨屑质量。

8.根据权利要求7所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：用孔径0.05μm的尼龙滤膜进行过滤，过滤前用磨屑溶液至少100倍体积的去离子水稀释。

9.根据权利要求1或2所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：每一次所述离心速度为8000～15000r/min转速离心1-2h。

10.根据权利要求1所述的人工关节混合磨屑多次离心分离的提取方法，其特征在于：所述酶降解法是指包含混合磨屑颗粒的小牛血清溶液先后经过木瓜蛋白酶、蛋白酶K两种蛋白酶进行酶降解，具体方法为：

包含混合磨屑颗粒的小牛血清溶液中加入十二烷基硫酸钠，沸水浴保温5～15分钟，冷却至室温；

溶液PH调至7～8，加入4.8U木瓜蛋白酶溶液，60～70℃水浴保温20～30小时；

再加入十二烷基硫酸钠溶液，沸水浴保温5～15分钟，冷却至室温；

溶液PH调至7～8，加入用相同PH的tris-HCl溶液稀释成20mg/mL的蛋白酶K溶液，50～60℃水浴保温20～30小时。

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