CN115948589A - 一种检测疟原虫的引物探针组合及其数字pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测疟原虫的引物探针组合及其数字PCR检测试剂盒。本发明提供的引物探针组合包括检测疟原虫的通用引物和通用探针可同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫五种疟原虫，同时还包括以上五种疟原的特异性探针，可利用一对引物多条探针一次性对五种疟原虫进行区分和检测，特异性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测疟原虫的引物探针组合及其数字PCR检测试剂盒。
背景技术
疟原虫为按蚊传播的孢子虫，是疟疾(malaria)的病原体。疟原虫种类繁多，寄生于人类的疟原虫有4种，即恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，分别引起恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟。疟疾的一次典型发作表现为寒战、高热和出汗退热三个连续阶段。发作是由红细胞内期的裂体增殖所致，当经过几代红细胞内期裂体增殖后，血中原虫的密度达到发热阈值(threshold)，如间日疟原虫为10～500个/μl血，恶性疟原虫为500～1300个/μl血。红细胞内期成熟裂殖体胀破红细胞后，大量的裂殖子、原虫代谢产物及红细胞碎片进入血流，其中一部分被巨噬细胞、中性粒细胞吞噬，刺激这些细胞产生内源性热原质，它和疟原虫的代谢产物共同作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，引起发热。
数字PCR是一种适用于微量模板绝对定量生物的新型PCR技术，灵敏度极高，但引物探针组合的特异性要求较高。目前尚未有采用一对引物多条探针一次性对间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫五种疟原虫实现快速、特异性检测的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种一种检测疟原虫的引物探针组合及其数字PCR检测试剂盒。该引物探针组合结合数字PCR技术，可快速实现间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫五种疟原虫的联合检测，特异性好，灵敏度高，且检测时间短。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种检测疟原虫的引物探针组合，其特征在于，包括：
检测疟原虫的序列如SEQ ID NO.1所示的上游通用引物NYC-SY、如SEQ ID NO.2所示的下游通用引物NYC-XY，和如下至少一种探针：
检测疟原虫的通用探针NYX-TZ，序列如SEQ ID NO.3所示；
检测诺氏疟原虫的探针NS-TZ，序列如SEQ ID NO.4所示；
检测间日疟原虫的探针JR-TZ，序列如SEQ ID NO.5所示；
检测恶性疟原虫的探针EX-TZ，序列如SEQ ID NO.6所示；
检测三日疟原虫的探针SR-TZ，序列如SEQ ID NO.7所示；
检测卵形疟原虫的探针LX-TZ，序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明中，以上所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。一些实施方案中，所述荧光基团为CY5.5、A425、FAM、VIC、ROX或CY5；所述淬灭基团为MGB、BHQ1、BHQ2等。一些具体实施例中，所述通用探针NYX-TZ、探针NS-TZ、JR-TZ、EX-TZ、SR-TZ和LX-TZ的5’端分别标记荧光基团CY5.5、A425、FAM、VIC、ROX和CY5。
本发明还提供了所述的引物探针组合在制备检测或区分疟原虫的试剂盒中的应用。所述疟原虫包括间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫中的至少一种。
本发明还提供一种检测疟原虫的试剂盒，其特征在于，包括本发明所述的引物探针组合。
一些实施方案中，所述试剂盒还包括数字PCR扩增试剂。所述数字PCR检测试剂包括ddPCR Mix和水。
本发明还提供一种非诊断目的的检测疟原虫的方法，以本发明所述的引物探针组合或所述的试剂盒对待测样品的DNA进行数字PCR检测。
所述数字PCR检测的程序包括：
98℃预变性5min；
98℃变性15秒，60℃退火60秒，循环40次。
本发明提供的引物探针组合包括检测疟原虫的通用引物和探针可同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫五种疟原虫，同时还包括以上五种疟原的特异性探针，可利用一对引物多条探针一次性对五种疟原虫进行区分或检测，特异性好，灵敏度高。
附图说明
图1示本发明引物探针组合的设计原理图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测疟原虫的引物探针组合及其数字PCR检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1引物探针设计
1.1依据5种疟原虫的18S的核苷酸序列，分别设计1对引物、5条特异性探针以及1条疟原虫通用探针，设计原理图见图1，具序列见表1：
表1
2样品来源
2.2.1阴性菌来自市售，采用Chelex裂解后测试。
3.2.2五种疟原虫核酸模板分别来自生物公司合成。
3数字PCR检测
表2扩增体系和程序
4结果
4.1特异性测试(单位：copies/μL)
以表1的引物探针、表2的扩增体系和程序对以下样本进行检测，结果如下：
表3
4.2最低检出限测试(单位：copies/μL)
将五种疟原虫DNA样本分别定量至1copies/μL，然后每个样本按照1：1的比例稀释后进行检测，检测设置8个重复，共40组检测，结果见表5。
结果显示，每组检测结果均为阳性。
表5
5结论
5.1特异性
本发明提供的引物探针组合无论是检测体系内部的靶标还是体系外的靶标，特异性良好，稳定性也较好。
5.2最低检出限
本发明提供的引物探探针组合对间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫五种疟原虫的最低检出限都能达到0.5copies/μL，
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测疟原虫的引物探针组合，其特征在于，包括：
检测疟原虫的序列如SEQ ID NO.1所示的上游通用引物NYC-SY、如SEQ ID NO.2所示的下游通用引物NYC-XY，和如下至少一种探针：
检测疟原虫的通用探针NYX-TZ，序列如SEQ ID NO.3所示；
检测诺氏疟原虫的探针NS-TZ，序列如SEQ ID NO.4所示；
检测间日疟原虫的探针JR-TZ，序列如SEQ ID NO.5所示；
检测恶性疟原虫的探针EX-TZ，序列如SEQ ID NO.6所示；
检测三日疟原虫的探针SR-TZ，序列如SEQ ID NO.7所示；
检测卵形疟原虫的探针LX-TZ，序列如SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
所述荧光基团为CY5.5、A425、FAM、VIC、ROX或CY5；所述淬灭基团为MGB、BHQ1或BHQ2。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，
所述通用探针NYX-TZ、探针NS-TZ、JR-TZ、EX-TZ、SR-TZ和LX-TZ的5’端分别标记荧光基团CY5.5、A425、FAM、VIC、ROX和CY5。
4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合在制备检测或区分疟原虫的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述疟原虫包括间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫中的至少一种。
6.一种检测疟原虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括数字PCR扩增试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR检测试剂包括ddPCR Mix和水。
9.一种非诊断目的的检测疟原虫的方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的引物探针组合或权利要求6～8任一项所述的试剂盒对待测样品的DNA进行数字PCR检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述数字PCR检测的程序包括：
98℃预变性5min；
98℃变性15秒，60℃退火60秒，循环40次。
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