CN104284986A - 用于高通量检测疟原虫的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents

用于高通量检测疟原虫的方法、组合物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测样品中疟原虫的方法。进一步地，本发明提供了用于检测样品中疟原虫的组合物和试剂盒。

Description

用于高通量检测疟原虫的方法、组合物和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于高通量且灵敏地检测疟原虫(Genus Plasmodium)的方法。本发明还涉及检测疟原虫的组合物和试剂盒。
背景技术
疟疾仍然是世界上最重要的传染病之一。可是，最近几年，在某些国家，疟疾传播的下降使得有可能考虑根治该疾病(WHO.World malaria report；2009)。随着各国疟疾根治运动的展开，疾病的监控、评价以及监测活动都要从对发病率和死亡率的测量转变为对感染的检测和对传播的测量。这就需新的诊断手段，其对于检测无症状感染者具有较高的灵敏度，而对于大规模筛查和监控具有较高的通量(A research agenda for malaria eradication:diagnoses and diagnostics.PLoS Med 2011；8:el000396)。例如，随着全球人口的移动和迁移，该疾病向非疫区的传播越来越多，从而迫切需要对可能表现或不表现临床症状的高危人群进行大规模、积极的疟疾筛查，因为亚临床感染的个体可能是一个严重的疟疾传播源(Harris I,Sharrock WW,Bain LM,etal.A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low andsub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of TemotuProvince,Solomon Islands:challenges for malaria diagnostics in an eliminationsetting.Malar J 2010；9:254)。引起疟疾的寄生虫是恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)以及诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)。恶性程度最高、甚至可能致命型的疟疾由恶性疟原虫引起，而最容易复发的疟疾由间日疟原虫引起(Galinski MR,Barnwell JW.Plasmodium vivax:who cares？Malar J 2008；7 Suppl 1:S9)。总体上来看，恶性疟原虫和间日疟原虫是引发疟疾最常见的寄生虫。因此，鼓励传播性低、不稳定的国家把重点放在恶性疟原虫和间日疟原虫的消除上，从而开展疟疾根治(WHO.World malaria report；2010)。
当前的诊断技术缺乏疟疾传播监控和控制所需要的灵敏度和通量。最广泛使用的显微镜镜检对于低于50个寄生虫/μl的疟原虫感染无法检出(Moody A.Rapid diagnostic tests for malaria parasites.Clinical MicrobiologyReviews 2002；15:66)。在调查流行人群时，显微镜镜检可能会漏掉大部分疟疾感染病例，特别是在疟疾感染传播低的地区(Okell LC,Ghani AC,Lyons E,Drakeley CJ.Submicroscopic infection in Plasmodium falciparum-endemicpopulations:a systematic review and meta-analysis.J Infect Dis 2009；200:1509-17)。最近的研发的分子方法，例如PCR(Snounou G,Viriyakosol S,JarraW,Thaithong S,Brown K.Identification of the four human malaria parasitespecies in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a highprevalence of mixed infections.Mol BiochemParasitol 1993；58:283-92)、定量PCR(Rougemont M,Van SaanenM,Sahli R,Hinrikson HP,Bille J,Jaton K.Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNA genesubunit-based and species-specific real-time PCR assays.J Clin Microbiol2004；42:5636-43)、基于核酸序列的扩增(NASBA)(Mens PF,Schoone GJ,Kager PA,Schallig HD.Detection and identification of human Plasmodiumspecies with real-time quantitative nucleic acid sequence-based amplification.Malar J 2006；5:80)、环介导的等温扩增(LAMP)(Lucchi NW,Demas A,Narayanan J,et al.Real-Time Fluorescence Loop Mediated IsothermalAmplification for the Diagnosis of Malaria.PLoS One 2010；5)更为灵敏，而且需要较少的疟疾专业知识，但是这些方法对于DNA/RNA提取的依赖，严重影响了诊断性能。而且，这样的依赖妨碍了这些技术在高通量病人筛查中的应用。基于蛋白的快速诊断实验(RDT)更加简便，也同样灵敏，可以用于疟疾的筛查。但是其对诊断恶性疟原虫感染更可靠，有时不能区分活动性感染和既往经历的疟疾感染，降低了其作为显微镜诊断替代选择的效果。
发明内容
本发明专利提供了一种简便、灵敏且可靠的适用于大规模检测疟原虫的方法。我们利用我们之前开发的RNA三明治杂交分析(Zheng Z,Luo Y,McMaster GK.Sensitive and quantitative measurement of gene expressiondirectly from a small amount of whole blood.Clin Chem 2006；52:1294-302；andUS专利申请US2007/016015)来检测样品中存在的疟原虫。参考文献的所有内容均并入文中。
具体地，本发明提供了一种用于检测样品中疟原虫的方法，包括：
a)提供可能含有靶标疟原虫的测试样品；
b)任选地，从测试样品a)中释放多聚核酸；
c)用探针混合物接触所述测试样品或者释放的多聚核酸，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间，所述探针混合物包括一个或多个捕获延伸(CE)探针和一个或多个标记延伸(LE)探针；
其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；
其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成；和
d)在所述步骤c)之后，用可检测分子与所述测试样品接触，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间；
e)检测步骤c)中发生的任何杂交；其中，杂交是否存在是所述测试样品中疟原虫是否存在的指征。
本发明的另一方面，提供了一种用于检测样品中疟原虫的方法，包括：
a)提供可能含有靶标疟原虫的测试样品；
b)任选地，从样品a)中释放多聚核酸；
c)用探针混合物接触测试样品或者释放出的多聚核酸，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间，所述探针混合物包括一个或多个CE探针、一个或多个LE探针、和至少一个封闭探针；
其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；
其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成；和
其中封闭探针由与疟原虫18S核糖体RNA杂交的核苷酸组成，以减少或消除其他探针对序列的非特异性杂交，且通过叠加效应增强相邻探针的杂交；和
d)在所述步骤c)之后，用可检测分子与所述测试样品接触，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间；
e)检测步骤c)中发生的任何杂交；其中，杂交是否存在是所述测试样品中疟原虫是否存在的指征。
在一个优选实施方案中，CE探针的含量占组合物总重量的1wt％至99wt％；LE探针的含量占组合物总重量的1wt％至99wt％；封闭探针的含量占组合物总重量的1wt％至99wt％。
在一个优选实施方案中，所述封闭探针具有如SEQ ID NO:22所示的序列。
在一个优选实施方案中，所述疟原虫选自恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)以及诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)。
在另一个实施方案中，所述测试样品是血液样品，包括血浆、血清或血凝块，培养的红细胞、或滤纸上干燥的血液样品。
在一个优选实施方案中，测试样品经过蛋白酶K处理。优选地，测试样品经过蛋白酶K在50℃至60℃处理1小时。更优选地，测试样品经过蛋白酶K在56℃处理1小时。
在一个优选实施方案中，所述一个或多个CE探针结合于固体支持物。更优选地，该固体支持物可以是平板固体支持物或珠子。最优选地，该支持物是96孔板。
在一个优选实施方案中，可被检测分子由酶或者荧光标签标记。
在一个优选实施方案中，与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸与SEQ ID NO：23至43所示的核苷酸具有至少80％的同一性，更优选地，至少85％的同一性，更优选地，至少90％的同一性，最优选地，至少95％的同一性。
在另一个实施方案中，至少一个或多个CE探针选自SEQ ID NO：1至7；并且至少一个或多个LE探针选自SEQ ID NO：8至21。
另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中疟原虫的方法，包括：
a)提供可能含有靶标疟原虫的测试样品；
b)任选地，从测试样品a)中释放多聚核酸；
c)用探针混合物接触所述测试样品或者释放的多聚核酸，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间，探针混合物包括所有SEQ ID NO：1至22所示的探针；和
d)在所述步骤c)之后，用可检测分子与所述测试样品接触，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间；
e)检测步骤c)中发生的任何杂交；其中，杂交是否存在是所述测试样品中疟原虫是否存在的指征。
另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中疟原虫的组合物，包括：
a)一个或多个CE探针，其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；
b)一个或多个LE探针，其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成。
另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中疟原虫的组合物，包括：
a)一个或多个CE探针，其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；
b)一个或多个LE探针，其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成；和
c)至少一个封闭探针；所述封闭探针由与疟原虫18S核糖体RNA杂交的核苷酸组成，以减少或消除其他探针对序列的非特异性杂交，且通过叠加效应增强相邻探针的杂交。
在一个优选实施方案中，与18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸与SEQID NO：23至43所示的核苷酸具有至少80％的同一性，更优选地，至少85％的同一性，更优选地，至少90％的同一性，最优选地，至少95％的同一性。
在一个优选实施方案中，所述探针选自SEQ ID NO：1至7；并且所述LE探针选自SEQ ID NO：8至21。
在一个优选实施方案中，封闭探针具有SEQ ID NO：22所示的序列。
另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中疟原虫的组合物，包括所有SEQ ID NO：1至23所示的探针。
另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中疟原虫的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)组合物，其包含：
i)一个或多个CE探针，其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；
ii)一个或多个LE探针，其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成；
b)固体支持物；
c)可检测分子。
另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中疟原虫的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)组合物，其包含：
i)一个或多个CE探针，其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；
ii)一个或多个LE探针，其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成；
iii)至少一个封闭探针；所述封闭探针由与疟原虫18S核糖体RNA杂交的核苷酸组成，以减少或消除其他探针对序列的非特异性杂交，且通过叠加效应增强相邻探针的杂交；
b)固体支持物；
c)可检测分子。
定义
除非特别限定，本专利申请中所有的技术和科学术语具有本专利相关领域从业者通常通常理解的含义。如下定义扩展了术语在本领域中的定义，涉及本申请，并不归因于其他相关或者不相关的案例(例如：任何通常已有的专利或者专利申请)。尽管任何类似或等效于本文描述的方法和材料都可以实际用于对本发明的验证，本文描述了优选的材料和方法。因此，文中使用的术语仅用于对特定实施方案的描述，不做任何限制目的。
如在本发明的说明书和权利要求书中使用的单数形式的“一个”、“一种”，除非特别声明，包括复数指代。因而，例如，“一种分子”包括多种这样的分子，等等。
术语“多聚核酸”、“多聚核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”在文中可互换使用，包括与一串核苷酸相对应的单体单元的任何物理字符串，包括核苷酸聚合物(如，典型的DNA或RNA聚合物)，肽核酸(PNA)，修饰的寡核苷酸(例如，含有不属于典型生物RNA或DNA的核苷酸的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。
术语“捕获延伸探针”或“CE探针”是一种多聚核苷酸，其能够与疟原虫18S核糖体RNA杂交，且能够与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交。典型地，该捕获延伸探针(CE探针)具有与疟原虫18S核糖体RNA互补的第一多聚核苷酸部分，以及与共价或非共价粘附于固体支持物的多聚核苷酸互补的第二多聚核苷酸部分。典型地，第一和第二多聚核苷酸部分不会彼此互补。优选CE探针是单链的。
术语“标记延伸探针”或“LE探针”是一种多聚核苷酸。LE探针能够与疟原虫18S核糖体RNA杂交，且能够与可检测分子杂交。典型地，该标记延伸探针(LE探针)具有与疟原虫18S核糖体RNA互补的第一多聚核苷酸部分，以及与可检测分子互补的第二核苷酸部分。典型地，第一和第二多聚核苷酸部分不会彼此互补。优选LE探针是单链的。
术语“可检测分子”包括一个或多个多聚核苷酸，其共同地包括标签和M-1多聚核苷酸序列，能够与至少一个LE探针杂交。标签直接或者间接地提供信号。M-1多聚核苷酸序列通常与LE探针的第二多聚核苷酸互补。
文中使用的术语“杂交”指互补核苷酸序列的配对，以产生DNA-DNA杂合体或DNA-RNA杂合体。限定合适的杂交条件属于本领域的技术范围内。
附图说明
图1表示了分析信号与培养的人红细胞中恶性疟原虫的相关性。如疟原虫检测方法中描述的，确定人红细胞培养物中的恶性疟原虫。检测限确定为加入红细胞中的培养疟原虫的最小量，其给出背景红细胞对照SD的3倍以上的信号净值。使用培养基制备各稀释液。分析中使用一式三份的样品，数据代表3个独立的次数。平均检测限是0.04个寄生虫/μl血液。RLU：相对光单位。
图2表示检测信号与保存不好的血液样品中寄生虫血症的相关性。保存的样品来自59例病人，由于来源有限，这些样品在采集后经过了多次冻融，分析样品(各20μl)，在采样时，对信号净值和认可的显微镜确定的寄生虫血症作图。每个样品都是一式两份检测，取平均信号。高于1×107的信号强度被认为接近光子检测仪的检测饱和值。
具体实施方式
实施例
样品收集
静脉肝素血液样品收集自缅甸克钦和中国云南的202例不明原因发热的病人。其中59例患者的血样采集于2008年，143例采集于2011年。用于分析评估的对照血液样品(n＝13)采自中国北京的健康受试者。在使用前所有样品冻存于－80℃。样品收集都有书面知情同意。本研究经过中国医学科学院基础医学研究所机构审查委员会(IRB)的伦理认可。由于来源有限，59例血液样品在检测前经过了多次冻融。
检测疟原虫的方法
1、显微镜镜检
采样时，从每个病人收集包括厚血膜和薄血膜的2个切片，用2％吉姆萨染液处理30分钟。然后切片分别由两位显微镜专家对疟原虫寄生虫进行查看，如果每个显微镜专家最小仔细检查了500个视野，也没有寄生虫的存在，则该样品为阴性样品。如果切片是阳性，则计数寄生虫密度。
2、RDT
本实验中的RDT检测采用CARESTARTTM(Accessbio,MonmouthJunction,NJ)，根据厂家说明书进行。该试剂盒选自世界卫生组织的采购推荐RDT列表。
3、实时qPCR
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)，按照厂家说明书从200μl融化的血液提取DNA。疟原虫18S筛选引物和探针序列以及实时qPCR的条件来自之前发表的文献。如果荧光信号在40个循环(Ct40)以内不增加，则认为样品为阴性。每次实验都包含至少1个阳性对照和1个阴性对照。每个样品都一式两份地进行检测。
4、三明治RNA核酸杂交分析
22个寡核苷酸探针(具有SEQ ID No:1至22所示的序列)靶向疟原虫18S核糖体RNA中的几处高度保守区域，包括恶性疟原虫(Genebank登录号M19172.1)、间日疟原虫(Genebank登录号U03079.1)、三日疟原虫(Genebank登录号AF488000.1)、卵形疟原虫(Genebank登录号L48987.1)以及诺氏疟原虫(Genebank登录号L07560.1)。
探针序列如下所示：
探针名称 SEQ ID NO: 序列
CE1 SEQ ID NO:1 atcaaaagctgataggtcagaaacTTTTTctcttggaaagaaagt
CE2 SEQ ID NO:2 ccatgttaggccaataccctaacTTTTTctcttggaaagaaagt
CE3 SEQ ID NO:3 cttgtcactacctctcttctttagaatTTTTTctcttggaaagaaagt
CE4 SEQ ID NO:4 aattggccttgcattgttatttTTTTTctcttggaaagaaagt
CE5 SEQ ID NO:5 actcccttaactttcgttcttgatTTTTTctcttggaaagaaagt
CE6 SEQ ID NO:6 cacctagtcggcatagtttatggtTTTTTctcttggaaagaaagt
CE7 SEQ ID NO:7 gcctttcggcggaggaaTTTTTctcttggaaagaaagt
LE1 SEQ ID NO:8 tttattacgtgttacttctttgttataattTTTTTgaagttaccgtttt
LE2 SEQ ID NO:9 tcgattgatacacactaaataaaataaaTTTTTctgagtcaaagcat
LE3 SEQ ID NO:10 accattccaattacaaaaccaaaTTTTTgaagttaccgtttt
LE4 SEQ ID NO:11 tctgggaaggttttaaattcccTTTTTctgagtcaaagcat
LE5 SEQ ID NO:12 gtattcaaacacagtaaatgctttaactTTTTTgaagttaccgtttt
LE6 SEQ ID NO:13 tgttcaattttgttattccatgctataTTTTTctgagtcaaagcat
LE7 SEQ ID NO:14 ctcctattaatcgtaactaagccaaTTTTTgaagttaccgtttt
LE8 SEQ ID NO:15 gaatacgaatgtccccaagctaTTTTTctgagtcaaagcat
LE9 SEQ ID NO:16 atctaagaatttcacctctgacatctTTTTTgaagttaccgtttt
LE10 SEQ ID NO:17 cgcagttgttcgtctccagaaTTTTTctgagtcaaagcat
LE11 SEQ ID NO:18 tcacgatatatattgataaagattacctacTTTTTgaagttaccgtttt
LE12 SEQ ID NO:19 ttaataattgcaataatctatccccaTTTTTctgagtcaaagcat
LE13 SEQ ID NO:20 tactaggcattcctcgttcaagaTTTTTgaagttaccgtttt
LE14 SEQ ID NO:21 agcacaatctgatgaatcatgctTTTTTctgagtcaaagcat
封闭探针 SEQ ID NO:22 tacgacggtatctgatcgtcttc
对于各分析，20μl恶性疟原虫的新鲜的或融化的血液或红细胞培养物样品用50μl的裂解混合物(Panomics/Affymetrix)、28μl水以及2μl蛋白酶K(50μg/ml)裂解，在60℃下剧烈震荡持续1小时。裂解产物与探针混合，杂交至含有上述22个寡核苷酸探针的探针组，其中CE、LE和BE探针量分别是150、600、300fmol。混合物在58℃下过夜静止孵育。洗掉未结合的探针后，捕获的靶标继续杂交，如Quantigene Assay试剂盒中描述的(Panomics/Affymetrix)，使用预先扩增物、扩增物、标签探针和底物依次孵育，孵育间冲洗。最终，获得的化学发光由Modulus读板机(TurnerBiosciences)定量，方法见之前发表的文章Zheng Z et al,2006(Zheng Z,LuoY,McMaster GK.Sensitive and quantitative measurement of gene expressiondirectly performed from a small amount of whole blood.Clin Chem 2006；52:1294-302)。对于疟疾的诊断，信号净值由样品信号减去空白对照的背景信号得出，如果样品的信号净值大于检测阈值(3X空白对照的SD)，则该样品为阳性，在该值以下为阴性。每个样品以一式两份进行检测。
实施例1
我们研究了我们开发的RNA杂交分析的检测限和定量能力。我们测试了3倍系列稀释的新鲜人红细胞培养的恶性疟原虫。该分析给出大约0.04个寄生虫/μl检测限，高于该阈值的信号与寄生虫数成比例(R2＝0.999)，(图1)，证明我们的分析方法高度灵敏、可定量，并且能够检测完整样品中的低的寄生虫血症。所有收集自健康志愿者(n＝13)的样品均为阴性，表明本发明的方法高度特异。
实施例2
我们对202名原因不明的发热病人的临床血样测试了我们的分析。所有样品中，66例被显微镜镜检阳性(27例恶性疟原虫和39例间日疟原虫)，寄生虫血症的范围从320个寄生虫/μl至6×105个寄生虫/μl，而其余136例样品被显微镜镜检为阴性。我们的分析方法鉴定出了66例显微镜镜检阳性的样品。在检测恶性疟原虫感染和间日疟原虫感染中没有无显著差异。虽然本发明方法需要过夜孵育，但是全程分析操作的时间少于2小时，因为样品是平行在96孔板上进行分析的。用于本发明分析的全血裂解液可在－20℃稳定保存至少6个月(数据未给出)。这些结果证明本发明的分析足以同时对大量样品进行疟疾感染的定量检测。
虽然显微镜检测和本发明方法具有高度一致性(66例阳性和131例阴性)，如可预期的，5例显微镜镜检阴性的样品在我们的分析中呈现阳性。我们决定进一步使用RDT和实时qPCR调查显微镜镜检阴性的样品，并比较结果(表1和表2)。我们用RDT检测了所有136例显微镜镜检阴性的样品和7例显微镜镜检阳性的样品。对134例阴性样品和4例阳性样品，两种方法具有一致性。但是，3例显微镜镜检阳性和2例显微镜镜检阴性的样品在RDT表现相反的结果。所有这5例样品随后被实时qPCR和本发明的分析证实为阳性。
表1：显微镜、实时qPCR、RDT和RNA杂交分析的结果
*P.f＝恶性疟原虫；P.v＝间日疟原虫
表2：显微镜镜检假阴性的样品
*RNA杂交分析的RLU检测阈值是5029。
在202例样品中总共有8例在显微镜、RDT和本发明分析中的结果不一致。我们对所有这8例样品以及随机选取的36例其他样品，进行了实时qPCR检测。对于这8例具有差异的样品，qPCR(包括DNA提取)和本发明的分析都重复两次，以确认。对于44例样品中的43例，检测结果与本发明的分析一致(20例阳性，23例阴性)，剩余一例样品在本发明的分析中为阳性，但是在实时qPCR和其他两种方法中为阴性。对于这一例样品，本发明的分析给出很弱的信号，但是仍然高于检测阈值，表明很低的寄生虫量；而实时qPCR对这例样品的Ct值＝41，接近阈值循环数40(表2)。实时qPCR分析中的双倍DNA输入量也没有提高该样品的Ct值。
使用显微镜镜检为金标准，本发明的分析的灵敏度为100％(66/66)；使用实时qPCR为金标准，本发明的分析的灵敏度为100％(20/20)。本发明方法检测阴性的样品其他方法检测也为阴性。
实施例3
为了确定分析的稳定性和确认该分析是否能够诊断质量欠佳的样品,我们检查了59例储存不良、可能部分降解的疟疾样品的分析结果。这些样品包括恶性疟原虫样品和间日疟原虫样品，并在收集和储存过程中经历了反复冻融，其显微镜镜检为阳性。尽管由于几次冻融循化和长期储存可能导致样品遭受RNA降解的事实，所有59例病人样品的信号均在检测阈值以上，其中大多数接近检测饱和(图2)。该分析的平均变异系数(CV)为5％。
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Claims (20)

1.一种用于检测样品中疟原虫的方法，其包括以下步骤：
a)提供可能含有靶标疟原虫的测试样品；
b)任选地，从步骤a)的测试样品中释放多聚核酸；
c)用探针混合物接触所述测试样品或者释放的多聚核酸，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间，所述探针混合物包括一个或多个CE探针和一个或多个LE探针，
其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；
其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成；
d)在所述步骤c)之后，用可检测分子与所述测试样品接触，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间；和
e)检测步骤c)中发生的任何杂交；其中，杂交是否存在是所述测试样品中疟原虫是否存在的指征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括用至少一个封闭探针接触所述测试样品的步骤，所述封闭探针由与疟原虫18S核糖体RNA杂交的核苷酸组成，以减少或消除其他探针对序列的非特异性杂交，且通过叠加效应增强相邻探针的杂交。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述封闭探针具有如SEQ IDNO:22所示的序列。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述疟原虫选自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)以及诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述测试样品是血液样品、培养的红细胞、或滤纸上干燥的血液样品。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述一个或多个CE探针结合于固体支持物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述支持物是平板固体支持物或珠子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述支持物是96孔板。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中可检测分子由酶或者荧光标签标记。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸选自与SEQ ID NO：23至43所示的核苷酸具有至少80％同一性的核苷酸。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，所述CE探针选自SEQ ID NO：1至7；并且所述LE探针选自SEQ ID NO：8至21。
12.一种用于检测样品中疟原虫的方法，其包括以下步骤：
a)提供可能含有靶标疟原虫的测试样品；
b)任选地，从步骤a)的测试样品中释放多聚核酸；
c)用探针混合物接触所述测试样品或者释放的多聚核酸，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间，所述探针混合物含有至少一个选自SEQ ID NO：1至21所示探针的探针；
d)在所述步骤c)之后，用可检测分子与所述测试样品接触，在足以使杂交发生的条件下持续一段时间；和
e)检测步骤c)中发生的任何杂交；其中，杂交是否存在是所述测试样品中疟原虫是否存在的指征。
13.一种用于检测样品中疟原虫的组合物，其包括：
a)一个或多个CE探针，其中所述CE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与共价或非共价地粘附于固体支持物的核酸杂交的核苷酸组成；和
b)一个或多个LE探针，其中所述LE探针由与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸，以及与可检测分子杂交的核苷酸组成；
其中所述所述CE探针和LE探针以足以使杂交发生的有效量存在。
14.根据权利要求13所述的组合物，其进一步可选地包括足以与疟原虫18S核糖体RNA杂交的有效量的封闭探针，以减少或消除其他探针对序列的非特异性杂交，且通过叠加效应增强相邻探针的杂交。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中CE探针的含量占组合物总重量的1wt％至99wt％；LE探针的含量占组合物总重量的1wt％至99wt％；封闭探针的含量占组合物总重量的1wt％至99wt％。
16.根据权利要求13或14所述的组合物，其中与疟原虫18S核糖体RNA区域杂交的核苷酸选自与SEQ ID NO：23至43所示的核苷酸具有至少80％同一性的核苷酸。
17.根据权利要求13至15任一项所述的组合物，其中所述CE探针选自SEQ ID NO：1至7；所述LE探针选自SEQ ID NO：8至21。
18.根据权利要求14至16任一项所述的组合物，其中所述封闭探针具有SEQ ID NO:22所示的序列。
19.一种用于检测样品中疟原虫的组合物，其包括所有SEQ IDNO：1至22所示的探针。
20.一种用于检测样品中疟原虫的试剂盒，其包含：a)根据权利要求13至18任一项所述的组合物；b)固体支持物；c)可检测分子和d)说明书。
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