CN113412335A - 用于检测疟原虫核酸的组合物和方法 - Google Patents

用于检测疟原虫核酸的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113412335A
CN113412335A CN201980091765.1A CN201980091765A CN113412335A CN 113412335 A CN113412335 A CN 113412335A CN 201980091765 A CN201980091765 A CN 201980091765A CN 113412335 A CN113412335 A CN 113412335A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
target
oligomer
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980091765.1A
Other languages
English (en)
Inventor
迪安娜·塞尔夫
杰弗里·M·林恩
瓦妮莎·布雷斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Killiffe Diagnostic Solutions Co ltd
Gene Probe Co ltd
Original Assignee
Killiffe Diagnostic Solutions Co ltd
Gene Probe Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Killiffe Diagnostic Solutions Co ltd, Gene Probe Co ltd filed Critical Killiffe Diagnostic Solutions Co ltd
Publication of CN113412335A publication Critical patent/CN113412335A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

公开了用于检测样品中的疟原虫核酸的核酸低聚物，所述核酸低聚物包含扩增低聚物、检测探针和捕获探针。还公开了特异性核酸扩增和检测的方法以及对应的反应混合物和试剂盒，所述方法包含使用所公开的低聚物实时扩增和检测靶核酸。

Description

用于检测疟原虫核酸的组合物和方法
相关申请交叉引用
本申请要求于2018年12月20日提交的美国临时申请第62/782,945号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
序列表的引用
本申请含有已经以ASCII格式经由EFS-Web递交的序列表并且将此序列表通过引用以其整体并入本文。创建于2019年10月28日的所述ASCII副本命名为“GDS_0110PC_20191028_Seq_Listing_ST25”，并且大小为56,087字节。
背景技术
疟疾是一种由属于疟原虫属的红细胞内寄生虫引起的严重疾病。这些寄生虫通过受感染的雌性按蚊(Anopheles mosquito)叮咬而实现感染。引起人类的疟疾的寄生虫有五个物种：恶性疟原虫(P.falciparum)、诺氏疟原虫(P.knowlesi)、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)。根据世界卫生组织(WHO)，2016年，世界范围内有2.16亿疟疾病例，并且其中，445,000例是致命的。
美国食品和药物管理局(U.S.FDA)已经实施了用于接受或延期前往疟疾流行区的供体的严格血液筛选指南。旅行者在前往流行区后延期一年，如果供体是流行区的前居民，则延期三年。被诊断患有疟疾的人在完成治疗且无症状后延期三年。在美国，尚未有经批准的测试来筛选血液捐献是否含有疟原虫属。这需要通过医疗问卷对预期供体进行仔细筛选。
在流行国家，WHO推荐通过厚血涂片或使用高度灵敏的酶免疫测定进行测试。在非流行国家，WHO推荐供体从最后一次潜在暴露开始延期六个月，与使用高度灵敏的酶免疫测定进行疟疾抗体测试组合。如果没有疟疾抗体的证据，则供体可能会被重新安置。存在这些方法无法有效检测可能发生传播的低水平寄生虫血症的风险。
在美国，输血传播疟疾(TTM)已有文件记录。1911年到2015年间已经报告了46例TTM病例，并且最新病例报告于2018年。需要用于检测样品中的疟原虫的特异性和灵敏性核酸测试(NAT)以减少TTM和延期供体的数量。
发明内容
一方面，本发明提供了一种用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的方法。所述方法通常包含：(1)使样品与用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物接触，所述样品疑似含有疟原虫核酸；(2)进行体外核酸扩增反应，其中所述样品中存在的任何疟原虫属靶核酸被用作用于生成扩增产物的模板；以及(3)检测所述扩增产物的存在或不存在，由此指示所述样品中疟原虫靶核酸的存在或不存在。在一些实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括：(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物，(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包含SEQ ID NO:163的序列，或者(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包含SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168；以及(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列的长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包含SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列。在其它实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括：(a')包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:187的序列；以及(b')包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:188的序列中并且包含SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(i)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的方法的一些实施例中，(a)(i)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:21、23-25、32、33、35、54和55。在其它实施例中，(a)(i)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包含SEQ ID NO:165的序列；在一些此类变化中，(a)(i)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:21、23-25、32、33和35。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(ii)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的方法的一些实施例中，(a)(ii)的所述靶杂交序列包含SEQ ID NO:167的序列；在一些此类变化中，(a)(ii)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:28-31、34、40、41和49-51。在其它实施例中，(a)(ii)的所述靶杂交序列包含SEQ ID NO:168的序列；在一些此类变化中，(a)(ii)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:38、39、43、44和53。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的方法的一些实施例中，(b)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:80-82和85-100。在其它实施例中，(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包含SEQ ID NO:171或SEQID NO:172的序列。在其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包含SEQ ID NO:171的序列的一些变化中，(b)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:81、82、85、87-90、94和96-98。在其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包含SEQID NO:172的序列的一些变化中，(b)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:80、82、85和87-100。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的如上所述的方法的一些实施例中，(a')的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:37、46、183和184。在其它实施例中，(a')的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:186的序列中；在一些此类变化中，(a')的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:184。在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的某些实施例中，(b')的所述靶杂交序列选自SEQ IDNO:83、84和182。在更具体的变化中，(a')的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:183或SEQ IDNO:184，并且(b')的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:182。
在如上所述的方法的一些实施例中，(b)或(b')的所述扩增低聚物是进一步包括分别位于(b)或(b')的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。特别合适的启动子序列是T7启动子序列，例如SEQ ID NO:179。在其中(b)的扩增低聚物包含启动子序列的特定的变化中，(b)的所述扩增低聚物包括选自SEQ ID NO:57-59和62-77的序列。在其中(b')的扩增低聚物包含启动子序列的特定的变化中，(b')的所述扩增低聚物包括选自SEQ ID NO:60、61和181的序列。
特别合适的(a)和(b)的扩增低聚物靶杂交序列对分别是(A)SEQ ID NO:30和SEQID NO:82、(B)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82、(C)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:82、(D)SEQID NO:21和SEQ ID NO:89、(E)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:89、(F)SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:89、(G)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:89、(H)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:92、(I)SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:92、(J)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:94、(K)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:94、(L)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:94、(M)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:95、(N)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:95和(O)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:95。在一些此类实施例中，(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的靶杂交序列的5'位的启动子序列(例如，T7启动子序列，例如SEQ ID NO:179)的启动子引物或启动子提供物。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的方法的一些实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括如(a)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。在一些此类变化中，所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(ii)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。特别合适的(a)(ii)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物包含包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:34的靶杂交序列)的第一扩增低聚物和包括包含SEQ ID NO:168的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:53的靶杂交序列)的第二扩增低聚物。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的方法的其它实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(i)中的扩增低聚物和如(a)(ii)中的扩增低聚物。在一些此类实施例中，如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括包含在SEQID NO:164的序列中并且包含SEQ ID NO:165的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:21的靶杂交序列)，并且如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:34的靶杂交序列)。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的方法的一些实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括(b)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。在一些此类实施例中，(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:170中并且包含SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列的靶杂交序列(例如，包括SEQ ID NO:94的靶杂交序列的第一扩增低聚物和包括SEQ ID NO:95的靶杂交序列的第二扩增低聚物)。在一些变化中，(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。特别合适的启动子序列是T7启动子序列，例如SEQID NO:179。在其中(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包含启动子序列的特定的变化中，(b)的所述第一扩增低聚物包括SEQ ID NO:71的序列，并且(b)的所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:72的序列。
在如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法的某些实施例中，所述方法进一步包含在步骤(1)之前从所述样品中的其它组分中纯化所述靶核酸。在一些此类变化中，纯化步骤包括使所述样品与至少一种捕获探针低聚物接触，所述至少一种捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列被配置成与所述疟原虫靶核酸特异性杂交。特别合适的捕获探针低聚物靶杂交序列包含长度为至多约30个连续核苷酸的序列，并且包含选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在更特定的变化中，所述捕获探针低聚物靶杂交序列选自SEQID NO:11-15、17、19和20，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在一些实施例中，纯化步骤包括使所述样品与至少两种捕获探针低聚物(例如，如上所述的至少两种捕获探针低聚物)接触；在一些此类变化中，所述至少两种捕获探针低聚物包含包括SEQ ID NO:19的靶杂交序列的第一捕获探针低聚物和包括SEQ ID NO:20的靶杂交序列的第二捕获探针低聚物。
在如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法的一些实施例中，检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种检测探针低聚物接触，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成在借此确定所述扩增产物的存在或不存在由此指示所述样品中疟原虫的存在或不存在的条件下与所述扩增产物特异性杂交的靶杂交序列。在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的一些此类实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。合适的检测探针低聚物靶杂交序列包含SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在某些实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:175的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在包括SEQ ID NO:174的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:148-155和159，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在包括SEQ ID NO:175或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的其它此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:147、156、157、160和161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在某些实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含选自SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156、157、160和161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在其中检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种检测探针低聚物接触并且其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的如上所述的方法的其它实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为至少约13个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:189的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。在一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:125-130和143，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在其中检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种检测探针低聚物接触并且其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法的具体变化中，(a)的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b)的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是(A)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:151或其补体或SEQ ID NO:151或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(B)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(C)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(D)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:150或其补体或SEQ ID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(E)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(F)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:89和SEQ IDNO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(G)SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(H)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ IDNO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(I)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(I)SEQID NO:33、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:158或其补体或SEQ ID NO:158或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(K)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:150或其补体或SEQID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(L)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(M)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(N)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(O)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(P)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(Q)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(R)SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(S)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(T)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(U)SEQ ID NO:53、SEQID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(V)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(W)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(X)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(Y)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(Z)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AA)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AB)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ IDNO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AC)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AD)SEQID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者(AE)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
在其中检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种检测探针低聚物接触并且其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法的具体变化中，(a')的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b')的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是(A)SEQ IDNO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(B)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:127或其补体或SEQID NO:127或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(C)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:128或其补体或SEQ ID NO:128或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(D)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:143或其补体或SEQ ID NO:143或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(E)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:129或其补体或SEQ ID NO:129或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者(F)SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
在如上所述的使用至少一种检测探针低聚物的方法的一些实施例中，所述检测探针低聚物在所述检测探针低聚物核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个核苷酸残基成员上包括2'甲氧基修饰。
在如上所述的使用至少一种检测探针低聚物的方法的一些实施例中，所述检测探针低聚物进一步包含可检测标记，例如荧光或化学发光标记。特别合适的化学发光标记是连接在检测探针低聚物的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(AE)化合物。在包括可检测标记的探针低聚物的一些实施例中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述检测探针低聚物进一步包含非荧光淬灭剂。
在如上所述的方法的一些实施例中，检测步骤(3)在所述扩增步骤(2)期间发生。在一些此类实施例中，所述方法使用包括荧光标记和淬灭剂(例如，分子火炬(moleculartorch)、分子信标或TaqMan检测探针)的检测探针低聚物。
在如上所述的使用至少一种检测探针低聚物的方法的一些实施例中，所述检测探针进一步包含非靶杂交序列。在具体变化中，包括非靶杂交序列的检测探针低聚物是发夹检测探针，例如分子信标或分子火炬。
在某些实施例中，如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法使用至少两种检测探针低聚物。在一些此类实施例中，所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物，其中(A)所述第一检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ IDNO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列，并且(B)所述第二检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列。在更特定的变化中，所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，并且所述第二检测探针低聚物包括选自SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法的某些变化中，步骤(2)处的所述体外核酸扩增反应是等温扩增反应(例如，转录介导的扩增(TMA)反应)。
在如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法的某些变化中，所述扩增反应是实时扩增反应。
在如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的方法的一些实施例中，所述样品是临床样品。在一些实施例中，所述样品是血液样品，例如红细胞样品(例如，裂解的血液细胞样品或裂解的红细胞样品)。
另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中疟原虫的存在或不存在的至少两种低聚物的组合。所述低聚物组合通常包含用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物。在一些实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物，(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包含SEQ ID NO:163的序列，或者(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包含SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168；以及(b)靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包括长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包含SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列。在其它实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括：(a')包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ IDNO:187的序列；以及(b')包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ IDNO:188的序列中并且包含SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(i)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的低聚物组合的一些实施例中，(a)(i)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:21、23-25、32、33、35、54和55。在其它实施例中，(a)(i)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包含SEQ ID NO:165的序列；在一些此类变化中，(a)(i)的所述靶杂交序列选自SEQ IDNO:21、23-25、32、33和35。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(ii)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的低聚物组合的一些实施例中，(a)(ii)的所述靶杂交序列包含SEQ ID NO:167的序列；在一些此类变化中，(a)(ii)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:28-31、34、40、41和49-51。在其它实施例中，(a)(ii)的所述靶杂交序列包含SEQ ID NO:168的序列；在一些此类变化中，(a)(ii)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:38、39、43、44和53。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的低聚物组合的一些实施例中，(b)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:80-82和85-100。在其它实施例中，(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包含SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列。在其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包含SEQ ID NO:171的序列的一些变化中，(b)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:81、82、85、87-90、94和96-98。在其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包含SEQ ID NO:172的序列的一些变化中，(b)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:80、82、85和87-100。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的如上所述的低聚物组合的一些实施例中，(a')的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:37、46、183和184。在其它实施例中，(a')的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:186的序列中；在一些此类变化中，(a')的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:184。在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的某些实施例中，(b')的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:83、84和182。在更具体的变化中，(a')的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:184，并且(b')的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:182。
在如上所述的低聚物组合的一些实施例中，(b)或(b')的所述扩增低聚物是进一步包括分别位于(b)或(b')的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。特别合适的启动子序列是T7启动子序列，例如SEQ ID NO:179。在其中(b)的扩增低聚物包含启动子序列的特定的变化中，(b)的所述扩增低聚物包括选自SEQ ID NO:57-59和62-77的序列。在其中(b')的扩增低聚物包含启动子序列的特定的变化中，(b')的所述扩增低聚物包括选自SEQ ID NO:60、61和181的序列。
特别合适的(a)和(b)的扩增低聚物靶杂交序列对分别是(A)SEQ ID NO:30和SEQID NO:82、(B)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82、(C)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:82、(D)SEQID NO:21和SEQ ID NO:89、(E)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:89、(F)SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:89、(G)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:89、(H)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:92、(I)SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:92、(J)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:94、(K)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:94、(L)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:94、(M)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:95、(N)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:95和(O)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:95。在一些此类实施例中，(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的靶杂交序列的5'位的启动子序列(例如，T7启动子序列，例如SEQ ID NO:179)的启动子引物或启动子提供物。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的低聚物组合的一些实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括如(a)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。在一些此类变化中，所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(ii)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。特别合适的(a)(ii)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物包含包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:34的靶杂交序列)的第一扩增低聚物和包括包含SEQ ID NO:168的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:53的靶杂交序列)的第二扩增低聚物。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的低聚物组合的其它实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(i)中的扩增低聚物和如(a)(ii)中的扩增低聚物。在一些此类实施例中，如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包含SEQ ID NO:165的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:21的靶杂交序列)，并且如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:34的靶杂交序列)。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的低聚物组合的一些实施例中，所述至少两种扩增低聚物包括(b)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。在一些此类实施例中，(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:170中并且包含SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列的靶杂交序列(例如，包括SEQ ID NO:94的靶杂交序列的第一扩增低聚物和包括SEQID NO:95的靶杂交序列的第二扩增低聚物)。在一些变化中，(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。特别合适的启动子序列是T7启动子序列，例如SEQ ID NO:179。在其中(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包含启动子序列的特定的变化中，(b)的所述第一扩增低聚物包括SEQ ID NO:71的序列，并且(b)的所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:72的序列。
在如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的低聚物组合的某些实施例中，所述低聚物组合进一步包含至少一种捕获探针低聚物，所述至少一种捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分的共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列被配置成与所述疟原虫靶核酸特异性杂交。特别合适的捕获探针低聚物靶杂交序列包含长度为至多约30个连续核苷酸的序列，并且包含选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在更特定的变化中，所述捕获探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在一些实施例中，所述低聚物组合包含至少两种捕获探针低聚物(例如，如上所述的至少两种捕获探针低聚物)；在一些此类变化中，所述至少两种捕获探针低聚物包含包括SEQ ID NO:19的靶杂交序列的第一捕获探针低聚物和包括SEQ ID NO:20的靶杂交序列的第二捕获探针低聚物。
在如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的低聚物组合的一些实施例中，所述低聚物组合进一步包含至少一种检测探针低聚物，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成与可由所述至少两种扩增低聚物扩增的疟原虫扩增子特异性杂交的靶杂交序列。在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的一些此类实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。合适的检测探针低聚物靶杂交序列包含SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在某些实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:175的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在包括SEQ ID NO:174的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:148-155和159，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在包括SEQ ID NO:175或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的其它此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:147、156、157、160和161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在某些实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156、157、160和161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的如上所述的进一步包含至少一种检测探针低聚物的低聚物组合的其它实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为至少约13个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:189的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。在一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:125-130和143，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)和(b)的所述扩增低聚物的如上所述的进一步包含至少一种检测探针低聚物的低聚物组合的具体变化中，(a)的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b)的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是(A)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:151或其补体或SEQ ID NO:151或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(B)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(C)SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(D)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:150或其补体或SEQ ID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(E)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(F)SEQ ID NO:21、SEQID NO:89和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(G)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(H)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(I)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(I)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:158或其补体或SEQ ID NO:158或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(K)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:150或其补体或SEQ ID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(L)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(M)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(N)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:92和SEQ IDNO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(O)SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(P)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ IDNO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(Q)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(R)SEQID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(S)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(T)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(U)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(V)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(W)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(X)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(Y)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(Z)SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AA)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AB)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AC)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(AD)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者(AE)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
在其中所述至少两种扩增低聚物包括(a')和(b')的所述扩增低聚物的如上所述的进一步包含至少一种检测探针低聚物的低聚物组合的具体变化中，(a')的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b')的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是(A)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(B)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:127或其补体或SEQ ID NO:127或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(C)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:128或其补体或SEQ ID NO:128或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(D)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:143或其补体或SEQ IDNO:143或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；(E)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:129或其补体或SEQ ID NO:129或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者(F)SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
在如上所述的进一步包含至少一种检测探针低聚物的低聚物组合的一些实施例中，所述检测探针低聚物在所述检测探针低聚物核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个核苷酸残基成员上包括2'甲氧基修饰。
在如上所述的进一步包含至少一种检测探针低聚物的低聚物组合的一些实施例中，所述检测探针低聚物进一步包含可检测标记，例如荧光或化学发光标记。特别合适的化学发光标记是连接在检测探针低聚物的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(AE)化合物。在包括可检测标记的探针低聚物的一些实施例中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述检测探针低聚物进一步包含非荧光淬灭剂；特别合适的检测探针低聚物包括荧光标记和淬灭剂，包含分子火炬、分子信标和TaqMan检测探针。
在如上所述的进一步包含至少一种检测探针低聚物的低聚物组合的一些实施例中，所述检测探针进一步包含非靶杂交序列。在具体变化中，包括非靶杂交序列的检测探针低聚物是发夹检测探针，例如分子信标或分子火炬。
在某些实施例中，如上所述的用于检测样品中的疟原虫核酸的低聚物组合包含至少两种检测探针低聚物。在一些此类实施例中，所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物，其中(A)所述第一检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含SEQ IDNO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列，并且(B)所述第二检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列。在更特定的变化中，所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，并且所述第二检测探针低聚物包括选自SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
另一方面，本发明提供了一种如上所述的至少两种低聚物的组合用于特异性扩增样品中的疟原虫核酸的用途。
另一方面，本发明提供了一种用于特异性检测样品中的疟原虫靶核酸的检测探针低聚物。在一些实施例中，所述检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸并且被配置成与包含在可由包括第一疟原虫属特异性扩增低聚物和第二疟原虫属特异性扩增低聚物的低聚物组合扩增的疟原虫靶区域内的靶序列特异性杂交，其中(a)所述第一扩增低聚物包括靶杂交序列，(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包含SEQ ID NO:163的序列，或者(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包含SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168的序列；并且(b)所述第二扩增低聚物包括长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包含SEQ ID NO:171、SEQID NO:172或SEQ ID NO:173的序列的靶杂交序列。在一些此类实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。合适的检测探针低聚物靶杂交序列包含SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在某些实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含SEQ ID NO:174或SEQID NO:175的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在包括SEQ ID NO:174的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:148-155和159，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在包括SEQ ID NO:175或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的其它此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:147、156、157、160和161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在某些实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体；在一些此类变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156、157、160和161，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在用于特异性检测样品中的疟原虫靶核酸的检测探针低聚物的其它实施例中，所述检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列的长度为至少约13个核苷酸并且被配置成与包含在可由包括第一疟原虫属特异性扩增低聚物和第二疟原虫属特异性扩增低聚物的低聚物组合扩增的疟原虫靶区域内的靶序列特异性杂交，其中(a)所述第一扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ IDNO:187的序列的靶杂交序列；并且(b)所述第二扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:188中并且包含SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列的靶杂交序列。在一些此类实施例中，所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:189的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。在更特定的变化中，所述检测探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:125-130和143，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在如上所述的检测探针低聚物的一些实施例中，所述检测探针低聚物在所述检测探针低聚物核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个核苷酸残基成员上包括2'甲氧基修饰。
在如上所述的检测探针低聚物的一些实施例中，所述检测探针低聚物进一步包含可检测标记，例如荧光或化学发光标记。特别合适的化学发光标记是连接在检测探针低聚物的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(AE)化合物。在包括可检测标记一些实施例中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述检测探针低聚物进一步包含非荧光淬灭剂；特别合适的检测探针低聚物包括荧光标记和淬灭剂，包含分子火炬、分子信标和TaqMan检测探针。
在如上所述的检测探针低聚物的一些实施例中，所述检测探针进一步包含非靶杂交序列。在具体变化中，包括非靶杂交序列的检测探针低聚物是发夹检测探针，例如分子信标或分子火炬。
另一方面，本发明提供了一种用于检测样品中的疟原虫靶核酸的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括如上所述的至少两种检测探针低聚物。在一些实施例中，所述至少两种检测探针低聚物包括：(A)第一检测探针低聚物，所述第一检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列；以及(B)第二检测探针低聚物，所述第二检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包含SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列。在更特定的变化中，所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，并且所述第二检测探针低聚物包括选自SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
另一方面，本发明提供了一种如上所述的检测探针低聚物或低聚物组合用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的用途。
另一方面，本发明提供了一种用于从样品中特异性分离疟原虫核酸的捕获探针低聚物。在一些实施例中，所述捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分的共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列的长度为至多约30个连续核苷酸并且包含选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。在更特定的变化中，所述捕获探针低聚物靶杂交序列选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
另一方面，本发明提供了一种用于从样品中特异性分离疟原虫核酸的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括如上所述的至少两种捕获探针低聚物。在一些实施例中，所述至少两种捕获探针低聚物包括包含SEQ ID NO:19的靶杂交序列或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的第一捕获探针低聚物和包含SEQ ID NO:20的靶杂交序列或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的第二捕获探针低聚物。
另一方面，本发明提供了一种如上所述的捕获探针低聚物或低聚物组合用于特异性捕获来自样品的疟原虫核酸的用途。
另一方面，本发明提供了一种包括如上所述的至少两种低聚物的组合的试剂盒。
另一方面，本发明一种包括如上所述的至少两种低聚物的组合的反应混合物。
通过参考本发明的以下详细描述和附图，本发明的这些方面和其它方面将变得显而易见。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所描述的方法和组合物相关的本领域普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，以下术语和短语具有赋予它们的含义，除非另有说明。
术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数个指示物，除非上下文中另外明确指出。
“样品”包含可以含有或疑似含有疟原虫或其组分(如核酸或疟原虫核酸的片段)的任何样本。样品可以是分离的样品。样品包含“生物样品”，其包含源自可以含有疟原虫寄生虫或其组分(例如，源自其的靶核酸)的活的或死亡的人的任何组织或物质，包含例如血液、外周血和红细胞。也设想了使用可以含有疟原虫寄生虫或其组分(例如，源自其的靶核酸)的其它样品类型，如血浆、血清、淋巴结、胃肠道组织、粪便、尿液、精液或其它体液或物质。可以处理生物样品以物理或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内组分释放到溶液中，所述溶液可以进一步含有酶、缓冲液、盐、洗涤剂等，这些溶液用于使用标准方法制备生物样品进行分析。例如，可以用细胞裂解试剂处理样品，例如，如美国专利第10,093,989号或PCT公开第WO 2017/189746号中所描述的裂解试剂，每个专利以引用的方式并入本文中。同样，样品可以包含处理后的样品，如通过使样品通过或穿过过滤装置，或然后进行离心，或通过粘附于介质、基质或载体而获得的样品。
“核酸”是指包括两个或更多个具有含氮杂环碱基或碱基类似物的共价键核苷或核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其它键连接在一起以形成多核苷酸。核酸包含RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“主链”可以由多种键构成，包含以下中的一或多个：糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(在“肽核酸”或PNA中，参见例如，PCT公开第WO 95/32305号)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代物(例如，2'甲氧基取代物和2'卤化物取代物(例如2'-F))的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如，肌苷、5-甲基异胞嘧啶、异鸟嘌呤；核酸的生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)5-36,Adams等人编辑,第11版,1992,《生物技术(BioTechniques)》(2007)43:617-24)，其包含嘌呤碱基或嘧啶碱基的衍生物(例如，N4-甲基脱氧甘氨酸、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基、在2、6和/或8位具有改变或替代取代基的嘌呤碱基(如，2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、06-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和04-烷基-嘧啶)以及吡唑化合物(诸如，未取代或3-取代的吡唑啉[3,4-d]嘧啶)；美国专利第5,378,825号、第6,949,367号和PCT公开第WO 93/13121号)。核酸可以包含“碱基”残基，其中主链不包含一个或多个残基的含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可以仅包含在RNA和DNA中发现的常规糖、碱基和键，或者可以包括常规组分和取代物(例如，由2'甲氧基主链连接的常规碱基，或者包含常规碱基和一种或多种碱基类似物的混合物的核酸)。核酸可以包含“锁定的核酸”(LNA)，其中一个或多个核苷酸单体具有锁定在模拟糖构象的RNA中的双环呋喃糖单元，这增强了对单链RNA(ssRNA)、单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)中互补序列的杂交亲和力(《生物化学(Biochemistry)》,(2004)43:13233-41)。核酸可以包含经修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如，添加3'末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加至核酸。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是众所周知的。
如本文所用，术语“多核苷酸”表示核酸链。在整个本申请中，核酸由5'末端至3'末端命名。标准核酸(例如，DNA和RNA)通常是合成的“5'到3'”，即，通过将核苷酸添加到生长的核酸的3'端。
如本文所用，“核苷酸”是由磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基组成的核酸的亚基。RNA中的5-碳糖是核糖。在DNA中，5-碳糖是2'-脱氧核糖。所述术语还包含此类亚基的类似物，如核糖(2'-0-Me)的2'位置处的甲氧基。
如本文所用，“基于核酸的检测测定”是用于检测靶核酸内的靶序列并使用与靶序列特异性杂交的一种或多种寡核苷酸的测定。
在某些实施例中，基于核酸的检测测定是“基于扩增的测定”，即，使用一个或多个用于扩增核酸靶序列的步骤的测定。用于检测测定的各种扩增方法在本领域中是已知的，本文进一步概述了其中的几种方法。为了清楚起见，基于扩增的测定可以包含一个或多个没有扩增靶序列的步骤，例如基于非扩增的测定方法(例如，杂交测定或基于切割的测定)中使用的步骤。
在其它实施例中，基于核酸的检测测定是“基于非扩增的测定”，即，不依赖于任何用于扩增核酸靶序列的步骤的测定。为了清楚起见，包含用于在不存在任何对应的下游扩增低聚物的情况下延伸引物(例如，通过逆转录酶延伸引物以生成RNA:DNA双链体，然后对RNA进行RNase消化，从而产生与RNA靶互补的单链cDNA，而不生成cDNA的拷贝)的反应的基于核酸侧检测测定应被理解为基于非扩增的测定。
示例性基于非扩增的测定是“基于切割的测定”，其是依赖于通过瓣状核酸内切酶对线性双链体切割结构进行的特异性切割的测定，所述线性双链体切割结构通过重叠寡核苷酸与靶核酸的特异性杂交而形成。在这些测定中，含有非靶杂交瓣状区域的探针寡核苷酸被瓣状核酸内切酶以重叠依赖性方式切割以释放然后检测到的切割产物。基于切割的测定的原理在本领域中是众所周知的，并且在以下中对示例性测定进行了描述，例如，《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》(1999)17:292-296、《分子诊断(Mol.Diagn.)》(1999)4:135-144、《临床微生物学期刊(J.Clin.Microbiol.)》(2006)44:3443-3447以及美国专利第5,846,717号、第6,706,471号和第5,614,402号。基于切割的测定包含例如可商购获得的
Figure BDA0003205779690000201
测定(威斯康星州麦迪逊的美国豪洛捷有限公司(Hologic,Inc.))。
如本文所用，“靶核酸”是包括待检测靶序列的核酸。靶核酸可以是如本文中所描述的DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。除了靶序列，靶核酸还可以包含其它序列。
“分离的”意指含有靶核酸的样品取自其天然环境，但所述术语并不暗含任何程度的纯化。
如本文所用，术语“靶序列”是指待检测的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包含在检测过程(例如，基于扩增的检测测定(例如，TMA或PCR)或基于非扩增的检测测定(例如，基于切割的测定))期间寡核苷酸(例如，探针寡核苷酸、引发寡核苷酸和/或启动子寡核苷酸)与之复合的复合序列。当靶核酸最初是单链时，术语“靶序列”也指靶核酸中存在的与“靶序列”互补的序列。当靶核酸最初是双链时，术语“靶序列”指有义(+)链和反义(-)链两者。在选择靶序列时，本领域技术人员将理解，应该选择“独特的”序列，以便区分不相关或密切相关的靶核酸。
“靶杂交序列”在本文中用于指被配置成与靶核酸序列杂交的低聚物部分。优选地，靶杂交序列被配置成与靶核酸序列特异性杂交。靶杂交序列可以与其被配置成与之杂交的靶序列部分100％互补，但不是必须的。靶杂交序列也可以包含相对于靶序列插入、缺失和/或经取代的核苷酸残基。例如，当靶核酸是某个物种内的多个菌株时(如低聚物被配置成与各种疟原虫菌株杂交的情况)，可能会出现靶杂交序列与靶序列的互补性低于100％。应当理解，存在其它原因将靶杂交序列配置成与靶核酸具有小于100％的互补性。
如本文所用，关于疟原虫核酸区的术语“靶向序列”是指由此寡核苷酸以允许进行如本文中所描述的检测的方式与靶序列杂交的过程。在一个实施例中，寡核苷酸与靶向的疟原虫核酸序列互补并且不含错配。在另一个实施例中，寡核苷酸与靶向的疟原虫核酸序列互补，但是含有1个、2个、3个、4个或5个错配。优选地，与靶核酸序列杂交的寡核苷酸包含与靶序列互补的至少10个到至多50个核苷酸。应当理解，至少10个和至多50个是使得10、50和其之间的每个整数包含在内的包含范围。优选地，低聚物与靶序列特异性杂交。
术语“被配置成”表示参考寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际布置。例如，被配置成与靶序列特异性杂交的寡核苷酸具有在严格杂交条件下与参考序列特异性杂交的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“被配置成与……特异性杂交”意指寡核苷酸的靶杂交区被设计成具有可以靶向参考疟原虫靶区域的序列的多核苷酸序列。此种寡核苷酸不限于仅靶向所述序列，而是可在用于靶向疟原虫靶核酸的试剂盒或方法中用作组合物。寡核苷酸被设计成用作用于测定来自样品的疟原虫的测定的组分，并且因此被设计成在存在通常发现于测试样品中的其它核酸的情况下靶向疟原虫。如本领域所理解的，“与……特异性杂交”并不意指与非靶核酸唯一地杂交，因为与所述非靶核酸的一些低水平杂交可能发生。而是，“与……特异性杂交”意指寡核苷酸被配置成在测定中起作用以主要地杂交靶，使得可以确定样品中靶核酸的准确检测。术语“被配置成”表示寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际布置。
如本文所用，关于疟原虫靶向核酸的术语“片段”是指连续核酸的片段。
如本文所用，术语“区域”是指核酸的一部分，其中所述部分比整个核酸小。例如，当提及的核酸是寡核苷酸启动子引物时，术语“区域”可以用于指整个寡核苷酸的较小启动子部分。作为非限制性实例，当提及的核酸是扩增子时，术语区域可以用于指经鉴定用于通过探针的靶杂交序列杂交的较小核苷酸序列。
可互换的术语“低聚物”、“寡”和“寡核苷酸”是指具有通常少于1,000个核苷酸(nt)残基的核酸，包含处于下限为约5nt残基且上限为约500至900nt残基的范围内的聚合物。在一些实施例中，寡核苷酸处于下限为约12至15nt且上限为约50至600nt的大小范围内，而其它实施例处于下限为约15至20nt且上限为约22至100nt的范围内。寡核苷酸可以从天然存在的来源中纯化或可以使用多种众所周知的酶或化学方法中的任何一种来进行合成。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；而是，其通常用于覆盖本文中所描述的所有此类试剂。寡核苷酸可以发挥各种不同的功能。例如，如果寡核苷酸对互补链具有特异性并能够与互补链进行杂交，并且可以在存在核酸聚合酶的情况下进一步延伸，则所述寡核苷酸可以用作引物；如果寡核苷酸含有被RNA聚合酶识别的序列并允许转录，则这种寡核苷酸可以用作引物并提供启动子(例如，T7引物)；以及如果寡核苷酸能够与靶核酸或其扩增子进行杂交，则所述寡核苷酸可以起到检测靶核酸的作用，并进一步提供可检测的部分(例如，吖啶酯化合物)。
如本文所用，寡核苷酸可以“基本上对应于”特定的参考核酸序列，这意指所述寡核苷酸与所述参考核酸序列足够类似，使得所述寡核苷酸具有与所述参考核酸序列类似的杂交特性，因为其将在严格杂交条件下与相同的靶核酸序列杂交。本领域技术人员将理解“基本对应的寡核苷酸”可以与参考序列不同并且仍然与相同的靶核酸序列杂交。还应理解，除非上下文另有明确规定，否则对应于第二核酸的第一核酸包含其RNA和DNA并且包含其补体。这种核酸间的变化可以用序列内相同碱基的百分比或探针或引物与其靶序列之间完全互补的碱基的百分比来表述。因此，在某些实施例中，如果碱基同一性或互补性的这些百分比为100％到约80％，则寡核苷酸“基本上对应”于参考核酸序列。在优选实施例中，百分比为100％到约85％。在更优选实施例中，百分比为100％到约90％；在其它优选实施例中，百分比为100％到约95％。类似地，核酸或经扩增的核酸的区域在本文中可以被称为对应于参考核酸序列。本领域技术人员将理解可能需要在各种互补性百分比下对杂交条件进行各种修改，以允许在不会导致不可接受的非特异性杂交水平的情况下与特定靶序列杂交。
疟原虫靶核酸的示例性序列在下表19中示出。具体地，SEQ ID NO:180和192-195是分别与恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的核糖体RNA序列相对应的参考序列。在疟原虫的靶区域在本文中被描述为“对应于”SEQ ID NO:180的限定区域的情况下，应当理解，此种提及包含SEQ ID NO:192-195中的任何一个或多个的同源区域。还应理解，对“对应于”SEQ ID NO:180的限定区域的区域的此种提及包含可能存在于样品中的SEQ ID NO:180和192-195中的任何一个或多个的天然存在的变体的同源区域。
“扩增低聚物”是至少其3'端与靶核酸互补并且与靶核酸或其补体杂交并参与核酸扩增反应的低聚物。扩增低聚物的实例是与靶核酸杂交的“引物”，并含有在扩增过程中通过聚合酶延伸的3'OH端。扩增低聚物的另一个实例是不通过聚合酶延伸(例如，因为其具有3'阻断端)但参与或促进扩增的低聚物。例如，扩增寡核苷酸的5'区域可以包含与靶核酸不互补的启动子序列(其可被称为“启动子引物”或“启动子提供物”)。本领域技术人员应理解，用作引物的扩增低聚物可被修饰以包含5'启动子序列，并因此用作启动子引物。掺入3'阻断端进一步修饰了启动子引物，所述启动子引物现在能够与靶核酸杂交并提供用于启动转录的上游启动子序列，但不提供用于寡核苷酸延伸的引物。此种经修饰的寡核苷酸在本文中被称为“启动子提供物”低聚物。扩增寡核苷酸的大小范围包含约10到约70nt长的寡核苷酸(不包含任何启动子序列或聚-A尾)，并且含有至少约10个连续碱基，或者甚至至少12个与靶核酸序列(或其互补链)区域互补的连续碱基。连续碱基与扩增低聚物所结合的靶序列至少80％或至少90％或完全互补。扩增低聚物可任选地包含修饰的核苷酸或类似物，或参与扩增反应但与靶核酸或模板序列不互补或不包含在靶核酸或模板序列中的另外的核苷酸。应当理解，当提及寡核苷酸、扩增子或其它核酸的长度范围时，所述范围包含所有的整数(例如，长度为19到25个连续核苷酸，包含19、20、21、22、23、24和25个)。
如本文所用，“启动子”是被DNA依赖性RNA聚合酶(“转录酶”)识别为与核酸结合并在特定位点开始RNA转录的信号的特定核酸序列。
如本文所用，“启动子提供物”或“提供物”是指包括第一和第二区域并且被修饰以防止从其3'末端启动DNA合成的寡核苷酸。启动子提供物寡核苷酸的“第一区域”包括与DNA模板杂交的碱基序列，其中杂交序列位于启动子区域的3'，但不一定与所述启动子区域相邻。启动子寡核苷酸的杂交部分的长度通常为至少10个核苷酸，并且其长度可以延伸到至多50个或更多个核苷酸。“第二区域”包括RNA聚合酶的启动子序列。启动子寡核苷酸被工程化成使得其能够通过RNA或DNA依赖性DNA聚合酶(例如，逆转录酶)延伸，从而优选地在如上文所描述的其3'末端处包括阻断部分。如本文所提及，“T7提供物”是阻断的启动子提供物寡核苷酸，其提供被T7 RNA聚合酶识别的寡核苷酸序列。
“扩增”是指用于获得靶核酸序列或其互补体或其片段的多个拷贝的任何已知步骤。所述多个拷贝可以被称为扩增子或扩增产物。已知的扩增方法包含热循环方法和等温扩增方法两者。在一些实施例中，等温扩增方法是优选的。复制酶介导的扩增、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和转录介导的或转录相关的扩增是核酸扩增方法的非限制性实例。复制酶介导的扩增使用自我复制的RNA分子和复制酶(如QB-复制酶(例如，美国专利第4,786,600号))。PCR扩增使用DNA聚合酶、引物对和热循环来合成dsDNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝(例如，美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；和第4,800,159号)。LCR扩增使用四个或更多个不同寡核苷酸，通过使用多个杂交、接合和变性的循环来扩增靶和其互补链(例如，美国专利第5,427,930号和美国专利第5,516,663号)。SDA使用含有限制性核酸内切酶的识别位点的引物和核酸内切酶，所述核酸内切酶切割包含靶序列的经半修饰的DNA双链体的一个链，由此扩增在一系列引物延伸和链置换步骤中发生(例如，美国专利第5,422,252号；美国专利第5,547,861号；和美国专利第5,648,211号)。优选实施例使用适于扩增RNA靶核酸的扩增方法，如转录介导的扩增(TMA)或NASBA，但对本领域普通技术人员显而易见的是，本文中所公开的低聚物可以容易地用作其它扩增方法中的引物。
“转录相关的扩增”(在本文中也被称为“转录介导的扩增”(TMA))是指使用RNA聚合酶从核酸模板产生多个RNA转录物的核酸扩增。这些方法通常使用RNA聚合酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和模板互补的寡核苷酸—其包含启动子序列，并且任选地可包含一个或多个其它寡核苷酸。TMA方法是用于扩增和检测如本文中所描述的疟原虫属靶序列的扩增方法的实施例。转录相关的扩增的变型是本领域众所周知的，如先前详细公开的(例如，美国专利第4,868,105号；第5,124,246号；第5,130,238号；第5,437,990号；第5,554,516号；和第7,374,885号；以及PCT公开第WO 88/01302号、第WO 88/10315号和第WO 95/03430号)。本领域普通技术人员应理解，所公开的组合物可以用于基于通过聚合酶延伸低聚物序列的扩增方法。
如本文所用，术语“实时TMA”是指通过实时检测手段监测的靶核酸的转录介导的扩增(“TMA”)。
术语“扩增子”(其可与“扩增产物”互换使用)是指在扩增程序期间生成的与靶序列内含有的序列互补或同源的核酸分子。这些术语可用于指单链扩增产物、双链扩增产物或双链扩增产物的链之一。
“探针”、“检测探针”、“检测寡核苷酸”和“检测探针低聚物”在本文中可互换使用，是指在促进杂交以允许检测靶序列或经扩增的核酸的条件下与核酸或经扩增的核酸中的靶序列特异性杂交的核酸低聚物。检测可以是直接的(例如，直接与其靶序列杂交的探针)或间接的(例如，通过中间分子结构与其靶连接的探针)。探针可以是DNA、RNA、其类似物或其组合，并且它们可以是经标记的或未经标记的。探针的“靶序列”通常指通过标准碱基配对与探针低聚物的至少一部分特异性杂交的较大核酸序列内的较小核酸序列。探针可以包括靶特异性序列和有助于探针的三维构象的其它序列(例如，美国专利第5,118,801号；第5,312,728号；第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号；以及美国公开第20060068417号)。在优选实施例中，检测探针包括2'甲氧基主链，这可以使得获得较高的信号。
术语“
Figure BDA0003205779690000241
探针”是指含有荧光染料(通常在5'碱基上)和非荧光淬灭染料(淬灭剂)(通常在3'碱基上)的检测寡核苷酸。当被照射时，被激发的荧光染料将能量转移到附近的猝灭染料分子(而不是荧光)，从而产生非荧光底物。在扩增期间，聚合酶的核酸外切酶活性切割TaqMan探针以将荧光团与淬灭剂分离，由此允许荧光团发出未淬灭的信号作为扩增的指示。
如本文所用，“标记物”是指与被检测或导致可检测信号的探针直接或间接地接合的部分或化合物。直接标记可以通过将标记与探针连接的键或相互作用(包含共价键或非共价相互作用，例如氢键、疏水和离子相互作用)或通过形成螯合物或配位复合物来发生。间接标记可以通过使用如结合对成员、抗体或附加低聚物等桥接部分或“接头”发生，所述桥接部分或“接头”可以被直接地或间接地标记并且可以扩增可检测信号。标记包含任何可检测部分，如放射性核素、配体(例如，生物素、亲和素)、酶或酶底物、反应性基团或发色团(例如，赋予可检测颜色的染料、颗粒或珠)、发光化合物(例如，生物发光、磷光或化学发光标记)或荧光团。可以在均质测定中检测到标记，在所述均质测定中，混合物中的结合的经标记的探针具有与未结合的经标记的探针不同的可检测变化，例如，不稳定性或差异降解特性。可以在没有物理去除未结合形成到结合形式的标记或经标记的探针的情况下检测到“均质可检测标记”(例如，美国专利第5,283,174号、第5,656,207号和第5,658,737号)。标记包含化学发光化合物，例如包含标准AE和衍生物的吖啶酯(“AE”)化合物(例如，美国专利第5,656,207号、第5,658,737号和第5,639,604号)。合成标记和将标记附接到核酸并检测标记的方法是众所周知的(例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验手册(MolecularCloning,A Laboratory Manual)》,第2版(冷泉港出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),冷泉港,纽约,1989),第10章；美国专利第5,658,737号、第5,656,207号、第5,547,842号、第5,283,174号和第4,581,333号)。特定探针上可以存在多于一个标记以及多于一种类型的标记，或者检测可以使用探针的混合物，在所述混合物中，每个探针都标记有产生可检测信号的化合物(例如，美国专利第6,180,340号和第6,350,579号)。
如本文所用，被称为“分子火炬”的结构被设计成包含通过接合区域(“靶结合结构域”)连接并在预定的杂交测定条件下彼此杂交的不同的自身互补性区域(“闭合结构域”)。包括闭合结构域的全部或部分核苷酸序列也可以作为靶结合结构域。因此，闭合结构域可以包含靶结合序列、非靶结合序列和其组合。
如本文所用，被称为“分子信标”的结构被设计成包含彼此互补且在预定的杂交测定条件下彼此杂交的序列侧接在其5'端和3'端两者上的靶结合序列。侧接互补区域可以被称为“开关序列”。
“捕获探针”、“捕获寡核苷酸”、“靶捕获寡核苷酸”和“捕获探针低聚物”可互换使用，是指通过标准碱基配对与靶核酸中的靶序列特异性杂交并且与固定探针上的结合配偶体接合以将靶核酸捕获到载体的核酸低聚物。捕获低聚物的一个实例包含包括以下两个结合区域的寡核苷酸：靶杂交序列和固定探针结合区域。这个实例的变化，两个区域可以存在于通过一个或多个接头接合在一起的两个不同的低聚物上。在捕获低聚物的另一个实施例中，靶杂交序列是包含随机或非随机的聚-GU、聚-GT或聚U序列以与靶核酸非特异性结合并将其连接到载体上的固定探针的序列(参见例如，PCT公开第WO 2008/016988号)。固定探针结合区域可以是被称为尾的核酸序列。尾包含与附接到载体颗粒或载体基质的互补固定序列结合的约10个到约40个核苷酸(例如，A10到A40)或约17到33nt(例如，T3A14到T3A30)的基本上均聚的尾。因此，在一些实施例中，优选的核酸尾的非限制性实例可以包含T0-4A10-40序列。捕获低聚物的另一个实例包括两个区域：靶杂交序列和不是核酸序列的结合对成员。
如本文所用，“固定寡核苷酸”、“固定探针”、或“固定核酸”是指将捕获低聚物直接或间接地接合到载体的核酸结合配偶体。与载体连接的固定探针有助于将捕获探针结合的靶与样品中未结合的物质分离。固定探针的一个实施例是与载体接合的低聚物，其有助于将结合的靶序列与样品中未结合的物质分离。载体可以包含已知的物质(如不溶于溶液的基质和颗粒)，其可以由硝化纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷、聚丙烯、金属或其它组合物构成，其中的一个实施例可磁性吸引的粒子。载体可以是单分散磁球(例如，均匀大小+5％)，固定探针与所述单分散磁球直接地接合(通过共价键、螯合或离子相互作用)或间接地接合(通过一或多个接头)，其中在杂交条件期间，探针与载体之间的键或相互作用是稳定的。
具体实施方式
本发明总体上涉及用于确定样品(例如，血液样品)中原生动物寄生虫疟原虫的存在或不存在的方法和组合物。适当地，本文中所描述的方法和组合物能够检测恶性疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和/或间日疟原虫的存在或不存在。在一些实施例中，本发明提供了用于检测样品中的疟原虫的方法，其中所述方法包含对来自疟原虫的核酸进行基于扩增的检测。本发明进一步提供了包括用于检测样品中的疟原虫的低聚物组合的组合物(包含反应混合物)和试剂盒，所述疟原虫包含：恶性疟原虫和/或诺氏疟原虫和/或三日疟原虫和/或卵形疟原虫和/或间日疟原虫。所述低聚物组合通常包含用于检测样品中的疟原虫的至少两种扩增低聚物，所述疟原虫包含：恶性疟原虫和/或诺氏疟原虫和/或三日疟原虫和/或卵形疟原虫和/或间日疟原虫，并且所述低聚物组合可以进一步包含如本文中所描述的用于对疟原虫进行基于扩增的检测的一个或多个另外的低聚物，所述疟原虫包含：恶性疟原虫和/或诺氏疟原虫和/或三日疟原虫和/或卵形疟原虫和/或间日疟原虫，例如捕获探针和/或检测探针。
用于检测来自受试者的样品中疟原虫的存在或不存在的方法通常包含进行基于核酸的检测测定以对样品中的疟原虫核酸进行特异性检测。基于核酸的检测测定通常使用与疟原虫的靶核酸特异性杂交且与疑似存在于样品中的其它核酸的交叉反应性最小的寡核苷酸。在一些变化中，用于对疟原虫进行基于核酸的检测的寡核苷酸或寡核苷酸组合与巴贝虫(Babesia sp.)(例如，果氏巴贝虫(B.microti))核酸的交叉反应性最小。
在本发明的某些方面，提供了一种用于确定样品中疟原虫的存在或不存在的至少两种低聚物的组合。通常，所述低聚物组合至少包含用于扩增对应于SEQ ID NO:180的区域的疟原虫靶区域的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。在此类实施例中，至少一种扩增低聚物包括处于有义朝向的靶杂交序列(“有义THS”)，并且至少一种扩增低聚物包括处于反义朝向的靶杂交序列(“反义THS”)，其中所述扩增低聚物的所述有义THS和所述反义THS各自被配置成与对应于SEQ ID NO:180内含有的序列的疟原虫靶序列特异性杂交，并且其中所述靶杂交序列被选择成使得所述反义THS所靶向的疟原虫属序列位于所述反义THS所靶向的疟原虫属序列的下游(即，所述至少两种扩增低聚物被定位成使得它们侧接要扩增的靶区域)。
在一些实施例中，疟原虫靶区域对应于SEQ ID NO:180的从约核苷酸位置844或约核苷酸位置910到约核苷酸位置1038、约核苷酸位置1051、约核苷酸位置1060或约核苷酸位置1077的区域。在其它实施例中，疟原虫靶区域对应于SEQ ID NO:180的从约核苷酸位置1153、约核苷酸位置1169或约核苷酸位置1182到约核苷酸位置1327、约核苷酸位置1354或约核苷酸位置1382的区域。
在一些实施例中，组合物包含包括基本上对应于SEQ ID NO:21-56、80-102和182-184中的任何一个中所示的序列或与所述序列相同的疟原虫属特异性靶杂交序列的扩增低聚物。在此类变化中，所述低聚物组合包含包括具有与如上所述的低聚物的靶杂交序列相反的极性(有义对反义或反之亦然)的疟原虫属特异性靶杂交序列的至少一种扩增低聚物，使得至少两种扩增低聚物侧接要扩增的靶区域。
在一些实施例中，组合物包含(1)包括基本上对应于下表1中所描绘的至少一个有义低聚物序列的疟原虫属特异性靶杂交区域的至少一种扩增低聚物，以及(2)包括基本上对应于下表1中所描绘的至少一个反义低聚物序列的疟原虫属特异性靶杂交区域的至少一种扩增低聚物。在具体变化中，扩增低聚物组合的一个或多个有义和/或反义靶杂交序列包括选自表1的一个或多个有义和/或反义序列或由所述一个或多个有义和/或反义序列组成。
表1.用于扩增疟原虫靶区域的示例性有义和反义扩增低聚物靶杂交序列
Figure BDA0003205779690000271
Figure BDA0003205779690000281
Figure BDA0003205779690000291
1这些序列的有义/反义名称仅出于示例性目的。此种名称不一定将序列限制于所附名称。
在一些实施例中，低聚物组合包括：(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物，(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包含SEQ ID NO:163的序列，或者(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包含SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168；以及(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列的长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQID NO:169中并且包含SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列。在一些此类实施例中，所述低聚物组合包括(a)(i)的扩增低聚物，其中的所述靶杂交序列选自SEQID NO:21、23-25、32、33、35、54和55，或者其中所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包含SEQ ID NO:165的序列(例如，选自SEQ ID NOs:21、23-25、32、33和35的靶杂交序列)。在又其它实施例中，所述低聚物组合包括(a)(ii)的扩增低聚物，其中的所述靶杂交序列包含SEQ ID NO:167的序列(例如，选自SEQ ID NO:28-31、34、40、41和49-51的靶杂交序列)，或者其中所述靶杂交序列包含SEQ ID NO:168的序列(例如，选自SEQ ID NO:38、39、43、44和53的靶杂交序列)。在如上所述的低聚物组合的某些实施例中，(b)的所述靶杂交序列选自SEQ ID NO:80-82和85-100。在其它实施例中，(b)的所述靶杂交序列包含在SEQID NO:170的序列中并且包含SEQ ID NO:171的序列(例如，选自SEQ ID NO:81、82、85、87-90、94和96-98的靶杂交序列)，或者包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包含SEQ ID NO:172的序列(例如，选自SEQ ID NO:80、82、85和87-100的靶杂交序列)。
在一些实施例中，低聚物组合包括(a')包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ IDNO:187的序列；以及(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:188的序列中并且包含SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列。在一些实施例中，(a')的所述扩增低聚物包括选自SEQ ID NO:37、46、183和184的靶杂交序列，或包含在SEQ ID NO:186的序列中的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:184的靶杂交序列)。在某些实施例中，(b')的所述扩增低聚物包括选自SEQ ID NO:83、84和182的靶杂交序列。
在某些实施例中，如本文中所描述的扩增低聚物是进一步包括位于靶杂交序列的5'位并且与疟原虫靶核酸不互补的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。例如，在如本文中所描述的低聚物组合的一些实施例中，如上文所描述的(b)或(b')的扩增低聚物是进一步包括5'启动子序列的启动子引物。在具体实施例中，所述启动子序列是T7 RNA聚合酶启动子序列，例如具有SEQ ID NO；179中所示的序列的T7启动子序列。在特定的变化中，扩增低聚物是具有选自SEQ ID NO:57-77和181的所示的序列的启动子引物。
表2示出了用于检测疟原虫靶核酸的扩增低聚物靶杂交序列(“Amp 1”和“Amp 2”)的特别合适的组合。
表2.扩增低聚物靶杂交序列的示例性组合。
Amp 1(SEQ ID NO) Amp 2(SEQ ID NO)
30 5
33 8
49 11
21 14
30 17
33 20
49 23
21 26
30 29
21 32
34 35
53 38
21 41
34 44
53 46
183 182
184 182
在一些实施例中，如上所述的低聚物组合包含侧接疟原虫靶区域的至少两个有义扩增低聚物和/或至少两个反义扩增低聚物。例如，低聚物组合可以包含(a)各自包括长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包含SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:16的靶杂交序列的至少两种扩增低聚物(例如，两种或三种扩增低聚物)，和/或(b)各自包括长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包含SEQ IDNO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列的靶杂交序列的至少两种扩增低聚物(例如，两种或三种扩增低聚物)；在一些此类变化中，所述低聚物组合包含(a)包括包含SEQ IDNO:167的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:34的靶杂交序列)的第一扩增低聚物和包括包含SEQ ID NO:168的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:53的靶杂交序列)的第二扩增低聚物。在包括至少两个有义扩增低聚物和/或至少两个反义扩增低聚物的其它实施例中，低聚物组合包括(a)(i)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包含SEQ ID NO:163的序列，以及(ii)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包含SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168；和/或(b)各自包括长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包含SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列的靶杂交序列的至少两种扩增低聚物(例如，两种或三种扩增低聚物)；在一些此类变化中，所述低聚物组合包含(a)(i)包括包含在SEQID NO:164的序列中并且包含SEQ ID NO:165的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:21的靶杂交序列)的扩增低聚物，以及(a)(ii)包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列(例如，SEQ ID NO:34的靶杂交序列)的扩增。在如上所述的包括(b)的至少两种扩增低聚物的低聚物组合的一些实施例中，低聚物组合包括(b)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物，各自包括包含在SEQ ID NO:170中并且包含SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列的靶杂交序列(例如，包括SEQ ID NO:94的靶杂交序列的第一扩增低聚物和包括SEQ ID NO:95的靶杂交序列的第二扩增低聚物)。
在一些实施例中，如本文中所描述的低聚物组合进一步包括至少一种捕获探针低聚物，所述至少一种捕获探针低聚物包括被配置成与疟原虫靶核酸特异性杂交的靶杂交序列。在一些此类实施例中，所述捕获探针低聚物包括靶杂交序列(基本上对应于包含在SEQID NO:180的补体中的序列的序列)。在一些实施例中，捕获探针低聚物靶杂交序列与同固定探针结合的序列或部分共价连接。合适的捕获探针低聚物靶杂交序列包含长度为至多约30个连续核苷酸的序列并且包含与选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20的序列基本上对应的序列(例如，包括选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20的序列或由其组成的靶杂交序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体)。在一些实施例中，捕获探针低聚物包括选自SEQ ID NO:1-5、7、9和10的序列或由其组成。在一些实施例中，所述低聚物组合包含至少两种捕获探针低聚物(例如，如上所述的至少两种捕获探针低聚物)。包括SEQ ID NO:19的靶杂交序列的第一捕获探针低聚物(例如，包括SEQ ID NO:9的序列的捕获探针低聚物)和包括SEQ ID NO:20的靶杂交序列的第二捕获探针低聚物(例如，包括SEQ ID NO:10的序列的捕获探针低聚物)特别适于一起用于如本文中所描述的低聚物组合中。
在某些变化中，如本文中所描述的低聚物组合进一步包括被配置成与可使用靶向疟原虫靶区域的至少两种扩增低聚物扩增的疟原虫靶序列特异性杂交的至少一种检测探针低聚物。在其中疟原虫靶区域对应于SEQ ID NO:180的从约核苷酸位置844或约核苷酸位置910到约核苷酸位置1038、约核苷酸位置1051、约核苷酸位置1060或约核苷酸位置1077的区域的一些实施例中，所述低聚物组合包含与对应于SEQ ID NO:180的从约核苷酸位置951到约核苷酸位置998的区域或其完整补体的靶区域特异性杂交的检测探针低聚物。例如，检测探针低聚物可以包含长度为约13个到约40个核苷酸并且(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体中并且(ii)包含选自SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ IDNO:178的序列(包含其补体)的靶杂交序列。在更特定的变化中，检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体中，并且(ii)包含SEQ ID NO:174或SEQ IDNO:175的序列，包含其补体。在其它变化中，检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ IDNO:196的序列或其补体中，并且(ii)包含选自SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178的序列，包含其补体。特别合适的检测探针低聚物靶杂交序列包含SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161，包含其补体。合适的检测探针进一步包含以上中的任何一个的DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
在其中疟原虫靶区域对应于SEQ ID NO:180的从约核苷酸位置1153、约核苷酸位置1169或约核苷酸位置1182到约核苷酸位置1327、约核苷酸位置1354或约核苷酸位置1382的区域的一些实施例中，所述低聚物组合包含与对应于SEQ ID NO:180的从约核苷酸位置1210到约核苷酸位置1233的区域或其完整补体的靶区域特异性杂交的检测探针低聚物。例如，检测探针低聚物可以包含长度为至少约13个核苷酸并且(i)包含在SEQ ID NO:189的序列或其补体中并且(ii)包含选自SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191的序列(包含其补体)的靶杂交序列。特别合适的检测探针低聚物靶杂交序列包含SEQ ID NO:125-130和143，包含其补体。合适的检测探针进一步包含以上中的任何一个的DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
表3示出了用于检测疟原虫靶核酸的检测探针靶杂交序列与第一和第二扩增低聚物靶杂交序列(“Amp 1”和“Amp 2”)一起的示例性组合。
表3.扩增低聚物和检测探针靶杂交序列的示例性组合。
Figure BDA0003205779690000331
在一些变化中，低聚物组合包含至少两种检测探针低聚物(例如，如本文中所描述的至少两个特异性检测探针)。例如，其中疟原虫靶区域对应于SEQ ID NO:180的从约核苷酸位置844或约核苷酸位置910到约核苷酸位置1038、约核苷酸位置1051、约核苷酸位置1060或约核苷酸位置1077的区域，低聚物组合可以包含：(A)第一检测探针低聚物，所述第一检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体中并且(ii)包含SEQ IDNO:175的序列或其补体的靶杂交序列；以及(B)第二检测探针低聚物，所述第二检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体中并且(ii)包含SEQ ID NO:176的序列或其补体(包含前述的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体)的靶杂交序列。第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物的特别合适的组合包含包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的第一检测探针低聚物和包括选自SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152的靶杂交序列(包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体)的第二检测探针低聚物。
检测探针低聚物可以在核酸主链中的一个或多个键处含有2'-甲氧基主链。在一些实施例中，扩增子检测反应混合物中提供了至少一种检测探针低聚物。
通常，根据本发明的检测探针低聚物进一步包含标记。特别合适的标记包含发射可检测光信号的化合物，例如可以在均质混合物中检测的荧光团或发光(例如，化学发光)化合物。特定探针上可以存在多于一个标记以及多于一种类型的标记，或者检测可以依赖于使用探针的混合物，在所述混合物中，每个探针都标记有产生可检测信号的化合物(参见例如，美国专利第6,180,340号和第6,350,579号，每个美国专利通过引用的方式并入本文中)。标记可以通过各种手段附接到探针，包含共价键、螯合和离子相互作用，但是优选地，标记是共价连接的。例如，在一些实施例中，检测探针具有附接的化学发光标记，例如吖啶酯(AE)化合物(参见例如美国专利第5,185,439号；第5,639,604号；第5,585,481号；和第5,656,744号；每个美国专利以引用的方式并入本文中)，在典型变化中，所述化学发光标记通过非核苷酸接头附接到探针(参见例如，美国专利第5,585,481号；第5,656,744号；和第5,639,604号(具体地，第10列，第6行到第11列、第3行)和实例8，每个美国文献通过引用的方式并入本文中)。在其它实施例中，检测探针包括荧光标记和淬灭剂两者(在荧光共振能量转移(FRET)测定中特别有用的组合)。此种检测探针的特定的变化包含例如TaqMan检测探针(罗氏分子诊断学公司(Roche Molecular Diagnostics))和“分子信标”(参见例如，Tyagi等人,《自然生物技术》,16:49-53,1998；美国专利第5,118,801号和第5,312,728号，每个文献通过引用的方式并入本文中)。
根据本发明的检测探针低聚物可以进一步包含非靶杂交序列。这种检测探针的具体实施例包含，例如，形成分子内杂交所保持的构型的探针，如通常称为发夹的构型。特别合适的发夹探针包含“分子火炬”(参见例如，美国专利第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号，每个美国专利通过引用的方式并入本文中)和“分子信标”(参见例如，Tyagi等人,同上；US 5,118,801和US 5,312,728，同上)。使用这种发夹探针的方法在本领域中是众所周知的。
在又其它实施例中，检测探针是基本上不形成由分子内键保持的构象的线性低聚物。在特定的变化中，线性检测探针低聚物包含作为标记的化学发光化合物，优选地吖啶酯(AE)化合物。
本发明还提供了如本文中所描述的检测探针低聚物、捕获探针低聚物和其组合。
在其它方面，本发明提供了用于检测来自受试者的样品中疟原虫的存在或不存在的方法。此类方法通常包含进行基于核酸的检测测定以对样品中的疟原虫核酸进行特异性检测。用于对疟原虫进行特异性检测的基于核酸的检测测定可以使用如本文中所描述的任何一个或多个疟原虫特异性低聚物(例如，如本文中所描述的包括至少两种扩增低聚物的低聚物组合；或如本文中所描述的检测探针或检测探针组合)。来自根据本发明的基于核酸的检测测定的阳性信号指示样品中存在恶性疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和/或间日疟原虫中的一个或多个。
在包括使用基于核酸的检测测定的方法的一些实施例中，基于扩增的测定用于检测疟原虫。此类基于扩增的测定方法通常包含对疟原虫靶区域进行核酸扩增以及检测经扩增的产物(例如，通过使经扩增的产物与提供用于指示样品中存在疟原虫的信号的核酸检测探针特异性杂交)。扩增步骤包含如果样品中存在疟原虫核酸，则使样品与对疟原虫靶核酸中的靶序列具有特异性的一种或多种扩增低聚物接触，以产生经扩增的产物。在具体实施例中，在扩增步骤处使用如本文中所描述的至少两种扩增低聚物的组合。扩增通过使用至少一个核酸聚合酶和扩增低聚物来合成靶序列或其补体的另外的拷贝以从模板链产生拷贝(例如，通过使用模板链使序列从引物延伸)。合适的扩增方法包含例如复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)以及转录介导或转录相关的扩增(TMA)。此类扩增方法在本领域中是众所周知的(参见例如，定义部分中对扩增方法的讨论，同上)并且容易地根据本公开的方法使用。
对经扩增的产物的检测可以通过多种方法来完成以检测与经扩增的靶序列特异性相关的信号。核酸可以与导致物理变化(如可检测的电变化)的表面相关。经扩增的核酸可以通过将其浓缩在基质中或上并检测核酸或与其相关的染料(例如，嵌入剂，如溴化乙锭或cyber green)或检测溶液相中与核酸相关的染料的增加来检测。检测的其它方法可以使用杂交步骤，所述杂交步骤包含使经扩增的产物与被配置成与经扩增的产物中的序列特异性杂交的至少一个检测探针接触，以及检测探针:产物复合物的存在，或者通过使用探针复合物，所述探针可以扩增与经扩增的产物相关的可检测信号(例如，美国专利第5,424,413号；第5,451,503号；和第5,849,481号)。与经扩增的产物特异性缔合的直接或间接标记的探针提供了可检测信号，所述可检测信号指示样品中存在靶核酸。在一些实施例中，使用基于扩增的测定来检测疟原虫的方法使用如本文中所描述的一种或多种检测探针低聚物来检测经扩增的产物。
与互补的经扩增的序列杂交的检测探针可以是DNA或RNA低聚物，或含有DNA和RNA核苷酸组合的低聚物，或用经修饰的主链合成的低聚物，例如包含一个或多个2'-甲氧基取代的核糖核苷酸的低聚物。用于检测经扩增的序列的探针可以被标记且间接地被检测到(例如，通过使另一个结合配偶体与探针上的部分结合)，或者可以用各种可检测标记来标记。在用于检测疟原虫的方法的一些实施例中，如在使用转录介导的扩增(TMA)的某些实施例中，检测探针是线性的经化学发光标记的探针，例如线性吖啶酯(AE)标记的探针。检测步骤还可以提供关于经扩增的序列的另外的信息，例如其核酸碱基序列的全部或部分。检测可以在扩增反应完成后进行，或者可以与扩增靶区域同时进行(例如，实时)。在一个实施例中，检测步骤允许均质检测(例如，检测杂交的探针而没有从混合物中去除未杂交的探针(参见，例如美国专利第5,639,604号和第5,283,174号))。
在扩增步骤接近结束或结束时检测经扩增的产物的实施例中，线性检测探针可以用于提供用于指示探针与经扩增的产物杂交的信号。这种检测的一个实例是使用与靶核酸杂交的发光标记的探针。然后，从未杂交的探针中水解发光标记。使用发光计通过化学发光进行检测(参见例如，国际专利申请公开第WO 89/002476号)。在使用实时检测的其它实施例中，检测探针可以是发夹探针，例如用报告部分标记的分子信标、分子火炬或杂交开关探针，当探针与经扩增的产物结合时检测到所述报告部分。此类探针可以包括靶杂交序列和非靶杂交序列。先前已经描述了各种形式的此类探针(参见例如，美国专利第5,118,801号；第5,312,728号；第5,925,517号；第6,150,097号；第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号；以及美国专利申请公开第20060068417A1号和第20060194240A1号)。
一些使用TMA扩增的扩增方法包含以下步骤。简而言之，提供了含有要扩增的序列的靶核酸作为单链核酸(例如，ssRNA或ssDNA)。本领域技术人员应了解，双链核酸(例如，dsDNA)的常规解链可以用于提供单链靶核酸。启动子引物在其靶序列处与靶核酸特异性结合，并且逆转录酶(RT)使用靶链作为模板延伸启动子引物的3'端，以产生靶序列链的cDNA拷贝，从而产生RNA:DNA双链体。RNase消化RNA:DNA双链体的RNA链，并且第二引物与其靶序列特异性结合，所述靶序列位于启动子引物端下游的cDNA链上。RT通过使用第一cDNA模板延伸第二引物的3'端来合成新的DNA链以产生含有功能启动子序列的dsDNA。然后，对启动子序列具有特异性的RNA聚合酶启动转录以产生RNA转录物，所述转录物是反应中的初始靶链的约100到1000个经扩增的拷贝(“扩增子”)。当第二引物在扩增子中的每个扩增子中与其靶序列特异性结合时，扩增继续，并且RT从扩增子RNA模板中产生DNA拷贝，以产生RNA:DNA双链体。反应混合物中的RNase消化来自RNA:DNA双链体的扩增子RNA，并且启动子引物在新合成的DNA中与其互补序列特异性结合。RT延伸启动子引物的3'端以产生含有功能启动子的dsDNA，RNA聚合酶与所述功能启动子结合以转录与靶链互补的另外的扩增子。产生更多扩增子拷贝的自动催化循环在反应过程期间重复，从而导致样品中存在的靶核酸扩增约十亿倍。经扩增的产物可以在扩增期间进行实时检测，或者在扩增反应结束时通过使用与包含在经扩增的产物中的靶序列特异性结合的探针进行检测。检测到结合的探针产生的信号指示样品中存在靶核酸。
在一些实施例中，所述方法使用“反向”TMA反应。在此类变化中，初始或“正向”扩增低聚物是在靶区域的3'端附近与靶核酸杂交的引发寡核苷酸。逆转录酶(RT)通过使用靶核酸作为模板延伸引物的3'端来合成cDNA链。第二或“反向”扩增低聚物是具有被配置成与包含在合成的cDNA链内的靶序列杂交的靶杂交序列的启动子引物或启动子提供物。在第二扩增低聚物是启动子引物的情况下，RT使用cDNA链作为模板延伸启动子引物的3'端以产生靶序列链的第二cDNA拷贝，由此产生含有功能启动子序列的dsDNA。然后，扩增基本上如上文所描述的继续以使用RNA聚合酶从启动子序列启动转录。可替代地，在第二扩增低聚物是启动子提供物的情况下，与靶区域的5'端附近的靶序列杂交的终止寡核苷酸通常用于在终止寡核苷酸的3'端处终止引发低聚物的延伸，由此为通过从引发低聚物延伸而合成的初始cDNA链提供限定的3'端。然后，启动子提供物的靶杂交序列与初始cDNA链的限定的3'端杂交，并且cDNA链的3'端被延伸以添加与启动子提供物的启动子序列互补的序列，从而形成双链启动子序列。然后，使用识别双链启动子并从其启动转录的RNA聚合酶，使用初始cDNA链作为模板来转录与初始cDNA链互补的多个RNA转录物，不包含启动子部分。然后，这些RNA转录物中的每一个都可用作模板，以用于从第一引发扩增低聚物进一步扩增。
在包括使用基于核酸的检测测定的方法的一些实施例中，基于非扩增的测定用于检测疟原虫。在一些此类实施例中，基于非扩增的测定是杂交测定，其包括使特异性检测探针与靶核酸杂交。用于进行多核苷酸杂交测定的方法在本领域中已得到很好的发展。杂交测定程序和条件将取决于应用而有所不同，并根据已知的一般结合方法对其进行选择，包含例如以下文献中提及的那些一般结合方法：Maniatis等人,《分子克隆：实验室手册》(第3版冷泉港,纽约,2002)以及Berger和Kimmel,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,第152卷,《分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.),圣地亚哥,加利福尼亚州,1987)。通常，探针和样品在允许特异性核酸杂交的条件下混合，并且然后检测探针与其相应的靶的特异性杂交。核酸杂交适用于多种测定形式。一种合适的形式是夹心测定形式，其特别适用于非变性条件下的杂交。夹心型测定的主要组分是已经吸附到或共价偶联到未经标记且与DNA序列的一部分互补的固定核酸探针的固体载体。靶核酸与固定探针杂交，并且第二未经标记的检测探针(其与固定的未经标记的核酸探针与其杂交的相同DNA链的第二不同区域互补)与[靶核酸]:[固定探针]双链体杂交以检测靶核酸。另一种示例性形式使用与固定在合适的电极表面上作为信号转导物的未经标记的检测探针杂交的靶核酸的电化学检测。参见例如，Drummond等人,《自然生物技术》21:1192,2003；Gooding,《电解分析(Electroanalysis)》14:1149,2002；Wang,《分析化学学报(Anal.Chim.Acta 469:63,2002；Cagnin等人,《传感器(Sensors)》9:3122,2009；Katz和Willner,《电解分析》15:913,2003；Daniels和Pourmand,《电解分析》19:1239,2007。
在包括杂交测定的用于检测疟原虫的方法的某些实施例中，杂交测定使用如本文中所描述的一种或多种检测探针低聚物。
在一些实施例中，用于检测疟原虫的基于非扩增的测定是基于切割的测定，在所述基于切割的测定中，含有非靶杂交瓣状区域的探针寡核苷酸被瓣状核酸内切酶以重叠依赖性方式切割以释放然后检测到的切割产物。示例性基于切割的测定试剂在例如以下文献中进行了描述，Lyamichev等人(《自然生物技术》17:292-296,1999)、Ryan等人(《分子诊断》4:135-144,1999)和Allawi等人(《临床微生物学期刊》44:3443-3447,2006)。
瓣状核酸内切酶反应的适合的条件是已知的，或者可以使用本领域已知的方法容易地确定(参见例如，Kaiser等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》274:2138-721394,1999)。可以在所述方法中使用的示例性瓣状核酸内切酶包含水生栖热菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶I、哺乳动物FEN-1、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)FEN-1、甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)FEN-1、激烈热球菌(Pyrococcusfiiriosus)FEN-1、热自参甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)FEN-1、嗜热栖热菌FEN-1、
Figure BDA0003205779690000381
(威斯康星州麦迪逊的美国豪洛捷有限公司)、酿酒酵母(S.cerevisiae)RTH1、酿酒酵母RAD27、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)rad2、噬菌体T5 5'-3'核酸外切酶、掘越氏热球菌(Pyrococcushorikoshii)FEN-1、人核酸内切酶1、小牛胸腺5'-3'核酸外切酶，包含真细菌、真核生物和古细菌中的其同源物(如结构特异性酶的II类家族的成员)以及其酶促活性突变体或变体。对瓣状核酸内切酶的描述可以在例如以下文献中发现：Lyamichev等人,《科学(Science)》260:778-783,1993；Eis等人,《自然生物技术》19:673-676,2001；Shen等人,《生物技术科学趋势(Trends in Bio.Sci.)》23:171-173,1998；Kaiser等人,《生物化学杂志》274:21387-21394,1999；Ma等人,《生物化学杂志》275:24693-24700,2000；Allawi等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》328:537-554,2003；Sharma等人,《生物化学杂志》278:23487-23496,2003；和Feng等人,《自然结构与分子生物学(Nat.Struct.Mol.Biol.)》11:450-456,2004。
在某些变化中，基于切割的测定检测疟原虫的RNA靶核酸，并且基于切割的测定使用能够进行切割的瓣状核酸内切酶和RNA:DNA线性双链体结构。在一些替代性实施例中，基于切割的测定检测疟原虫的DNA靶核酸，并且基于切割的测定使用能够进行切割的瓣状核酸内切酶和DNA:DNA线性双链体结构。能够切割RNA:DNA双链体的示例性瓣状核酸内切酶包含栖热菌属的聚合酶缺陷型5'核酸酶以及某些
Figure BDA0003205779690000391
酶(威斯康星州麦迪逊的美国豪洛捷有限公司)，例如
Figure BDA0003205779690000392
BN(Taq聚合酶的BstX-Notl缺失，参见美国专利第5,614,402号)、
Figure BDA0003205779690000393
II(全长Taq聚合酶的“AG”突变体，参见美国专利第5,614,402号)、
Figure BDA0003205779690000394
VII(全长嗜热栖热菌聚合酶的合成缺陷型突变)、
Figure BDA00032057796900003910
IX(TthDNA聚合酶的聚合酶缺陷型突变体)和
Figure BDA0003205779690000395
XII(由taq DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶的片段构建的聚合酶缺陷型嵌合聚合酶)。能够切割DNA:DNA双链体的示例性瓣状核酸内切酶包含上文所指示的瓣状核酸内切酶，以及
Figure BDA0003205779690000396
2.0(闪烁古生球菌FEN-1)、
Figure BDA0003205779690000397
2.1(在C末端上具有6个组氨酸的闪烁古生球菌FEN-1)、
Figure BDA0003205779690000398
3.0(维氏古生球菌(Archaeoglobusveneficus)FEN-1)和
Figure BDA0003205779690000399
3.1(在C末端上具有6个组氨酸的维氏古生球菌FEN-1)。
在一些实施例中，基于切割的测定检测疟原虫的RNA靶核酸，并且所述测定包含用于合成RNA靶区域的DNA补体的步骤，cDNA链然后与所述补体杂交以使第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸重叠，以形成由瓣状核酸内切酶切割的线性双链体切割结构。使用RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)从RNA模板合成cDNA的反应条件在本领域中是众所周知的。
在使用基于核酸的检测测定的某些实施例中，所述方法进一步包含从样品中的其它组分中纯化疟原虫靶核酸。此种纯化可以包含将样品中含有的生物体与其它样品组分分离和/或浓缩的方法。在特定的实施例中，纯化靶核酸包含捕获靶核酸以特异性或非特异性地将靶核酸与其它样品组分分离。非特异性靶捕获方法可以涉及从基本上含水的混合物中选择性沉淀核酸，将核酸粘附到被洗涤以去除其它样品组分的载体，或从含有疟原虫核酸和其它样品组分的混合物中物理分离核酸的其它方法。在一些实施例中，纯化包含裂解细胞(例如，血液样品(例如，红细胞))的样品并从裂解的细胞样品中纯化任何疟原虫靶核酸。用于根据本发明使用的示例性裂解试剂和方法在美国专利第10,093,989号和PCT公开第WO2017/189746号中进行了描述，每个专利通过引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，疟原虫的靶核酸通过使靶核酸与捕获探针低聚物杂交与其它样品组分分离。捕获探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列被配置成与靶核酸特异性或非特异性杂交，以便形成[靶核酸]:[捕获探针]复合物，所述复合物与其它样品组分分离。适于非特异性捕获靶核酸的包括靶杂交序列的捕获探针在例如PCT公开第WO 2008/016988号中进行了描述。在包括被配置成与疟原虫靶核酸特异性杂交的一个或多个靶杂交序列的一些特定的变化中，疟原虫特异性捕获探针包括长度为至多约30个连续核苷酸并且包含与选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20的序列基本上对应的序列的靶杂交序列(例如，包括选自SEQ ID NO:11-15、17、19和20的序列或由其组成的靶杂交序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体)。在优选变化中，捕获探针将[靶核酸]:[捕获探针]复合物与固定探针结合，以形成[靶核酸]:[捕获探针]:[固定探针]复合物，所述复合物与样品分离，并且任选地被洗涤以去除非靶样品组分(参见例如，美国专利第6,110,678号；第6,280,952号和第6,534,273号)。在此类变化中，捕获探针低聚物进一步包括将捕获探针通过其结合的靶序列与附接到固体载体的固定探针结合的序列或部分，由此允许杂交的靶核酸与其它样品组分分离。
在更特定的实施例中，捕获探针低聚物包含尾部分(例如，3'尾)，所述尾部分与靶核酸不互补，但是与固定探针上的序列特异性杂交，由此充当允许靶核酸与其它样品组分分离的部分，如先前在美国专利第6,110,678号中所描述的。尾部分中可以使用任何序列，所述尾部分通常长约5到50nt，并且优选实施例包含与附接到固体载体(例如，基质或颗粒)的互补固定序列(例如，聚-T)结合的约10到40nt(例如，A10到A40)、更优选地约14到33nt(例如，A14到A30或T3A14到T3A30)的基本上均聚的尾。在包括被配置成与疟原虫靶核酸特异性杂交的一个或多个靶杂交序列的一些此类实施例中，疟原虫特异性捕获探针包括选自SEQ ID NO:1-5、7、9和10的核苷酸序列或由其组成。
靶捕获通常在含有一种或多种捕获探针低聚物的溶液相混合物中发生，所述一种或多种捕获探针低聚物在杂交条件下与靶核酸杂交，通常在高于[尾序列]:[固定探针序列]双链体的温度的温度下。对于包括捕获探针尾的实施例，[靶核酸]:[捕获探针]复合物通过调整杂交条件而被捕获，使得捕获探针尾与固定探针杂交，并且然后，固体载体上的整个复合物与其它样品组分分离。可以将具有附接的[固定探针]:[捕获探针]:[靶核酸]的载体洗涤一次或多次，以进一步去除其它样品组分。优选实施例使用颗粒状固体载体(如顺磁性珠)，使得具有附接的[靶核酸]:[捕获探针]:[固定探针]复合物的颗粒可以悬浮于洗涤溶液中并从洗涤溶液中收回，优选地通过使用磁吸引。在包括使用基于扩增的检测测定的方法的实施例中，为了限制处理步骤的数量，可以通过简单地将载体上的复合物中的靶核酸与扩增低聚物混合并且进行扩增步骤来扩增靶核酸。
根据本公开，检测疟原虫的存在或不存在可以单独地进行(例如，在单独的反应容器中)，或者与另一个测定一起作为多重反应系统进行。因此，在一些实施例中，如本文中所描述的方法使用多重反应，其中反应混合物含有用于并行地测定多个(例如，至少两个、三个、四个或更多个)不同的靶序列的试剂。在这些情况下，反应混合物可以含有多个不同的靶特异性寡核苷酸以用于进行检测测定。例如，在使用基于扩增的检测测定的方法中，多重反应可以含有多组(例如，多对)扩增低聚物(例如，多对PCR引物或多对TMA扩增低聚物(例如，对于TMA，多对启动子引物和非启动子引物，或多对启动子提供物和非启动子引物))。在使用基于切割的检测测定的其它实施例中，多重反应可以含有具有不同瓣的多个探针寡核苷酸、多个不同的重叠探针寡核苷酸以及用于一旦不同瓣被切割就对其进行检测的多个不同的FRET盒。
本文中所描述的低聚物组合可以呈包括低聚物的反应混合物或试剂盒的形式。反应混合物或试剂盒可以进一步包含许多任选的组分，例如捕获探针核酸或捕获探针核酸阵列。对于扩增反应混合物，反应混合物通常将包含适于进行体外扩增的其它试剂，例如缓冲液、盐溶液、适合的核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP)和/或酶(例如，逆转录酶和/或RNA聚合酶)，并且通常将包含测试样品组分，其中疟原虫靶核酸可以或可以不存在。包括用于扩增疟原虫的低聚物组合的试剂盒还可以包含适于进行体外扩增的其它试剂，例如缓冲液、盐溶液、适合的核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP)和/或酶(例如，逆转录酶和/或RNA聚合酶)。对于包含与扩增低聚物组合一起靶向共同的靶核酸的检测探针的低聚物组合(例如，反应混合物或试剂盒)，选择通过共同的靶区域连接的扩增低聚物和检测探针低聚物(即，组合物将包含与可通过扩增低聚物组合扩增的序列结合的探针)。
通过以下非限制实例对用于检测疟原虫属核酸的组合物、方法、反应混合物、系统、试剂盒等进行进一步的说明。
实例
“寄生虫运送溶液”通常是指被调配用于保存样品的溶液，并且在一些情况下被调配用于至少部分地裂解样品中的一种或多种细胞类型。一种示例性寄生虫运送溶液包括15mM磷酸二氢钠、15mM磷酸氢二钠、1mM EDTA、1mM EGTA和110mM十二烷磺酸锂(LLS)，pH为6.7。另一种示例性寄生虫运送溶液包括100mM TRIS、30mM氯化镁和6％(v/v)LLS的水溶液，pH为7.5。另外的示例性寄生虫运送溶液包括14mM碳酸氢钠、250mM氯化铵、5％(v/v)LLS和0.1mM EDTA的水溶液，pH为7.4。寄生虫运送溶液的其它调配可能同样起作用。
“靶捕获试剂”通常是指含有有助于从溶液中捕获核酸的多种组分的溶液。一种示例性靶捕获试剂包括250mM HEPES、310mM氢氧化锂、1.88M氯化锂、100mM EDTA，pH为6.4，以及dT14低聚物与其共价结合的250μg/ml的磁性颗粒(1微米SERA-MAG^TM MG-CM颗粒，通用医疗生命科学公司(GE Healthcare Lifesciences))。另一种示例性靶捕获试剂包括790mMHEPES、453mM氢氧化锂、10％w/v LLS、230mM琥珀酸、0.03％w/v Foam Ban MS-575以及dT14低聚物共价结合的0.0125％w/v的磁性颗粒(1微米SERA-MAG^TM MG-CM颗粒，通用医疗生命科学公司)。靶捕获试剂的其它调配也可能同样起作用。
“洗涤溶液”通常是指含有10mM HEPES、150mM氯化钠、6.5mM氢氧化钠、1mM EDTA、0.3％(v/v)乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯和0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠，pH为7.5。
“探针试剂”通常是指含有一种或多种经标记的检测探针的溶液。一种示例性探针试剂是由约75到约100mM琥珀酸锂、2％(w/v)LLS、15mM巯基乙磺酸、1.2M氯化锂、20mM EDTA和3％(v/v)乙醇构成的溶液，pH为4.7。另一种示例性探针试剂是由约75到约100mM琥珀酸、3.5％(w/v)LLS、75mM氢氧化锂、15mM aldrithiol-2、1.0M氯化锂、1mM EDTA和3.0％(v/v)乙醇构成的溶液，pH为4.1-4.3。其它调配也可能同样发挥作用。
“扩增试剂”通常是指用于促进扩增反应的反应组分的浓缩混合物。取决于例如扩增类型(PCR、TMA等)、靶核酸(GC含量)等因素，扩增试剂将包括不同浓度的多种不同试剂。一种示例性扩增试剂包括47.6mM Na-HEPES、12.5mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、2.5％TRITONTMX-100、54.8mM KCl、23mM MgCl2、3mM NaOH、0.35mM的每种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、7.06mM rATP、1.35mM rCTP、1.35mM UTP、8.85mM rGTP、0.26mM Na2EDTA、5％v/v甘油、2.9％海藻糖、0.225％乙醇、0.075％对羟基苯甲酸甲酯、0.015％对羟基苯甲酸丙酯和0.002％酚红，pH为7.5-7.6。另一种示例性扩增试剂包括19.1mM Trizma碱、7.5mM Trizma盐酸盐、23.3mM KCl、21.5mM MgCl2、1mM的每种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、6.5mM rATP、4.0mM rCTP、4.0mM UTP、6.5mM rGTP、3.33％v/v甘油、0.05mM乙酸锌、6ppm Pro Clin 300防腐剂，pH为8.25-8.45。扩增试剂的其它调配可能同样地起作用。可以将引物添加到扩增试剂，或者添加到与扩增试剂分开的扩增反应。扩增试剂中的酶可以包含以下中的一种或多种：莫洛尼鼠白血病毒逆转录酶(MMLV-RT)和噬菌体T7 RNA聚合酶，其单位在功能上定义为：1U的MMLV-RT使用200-400微摩尔的寡核苷酸dT引发的poly(A)作为模板在37℃下在10分钟内掺入1nmol的dTTP，并且1U的T7 RNA聚合酶使用含有T7启动子的DNA模板在37℃下在1小时内将1nmol的ATP掺入到RNA中。
“杂交试剂”通常是指由浓度范围约如下的以下试剂构成的溶液：75-100mM琥珀酸、2％-3.5％(w/v)LLS、75-100mM氢氧化锂、14-16mM aldrithiol-2、1.0-1.2M氯化锂、20-1000mM EDTA和2.0-4.0％(v/v)乙醇，pH为4-5。杂交试剂的其它调配可能同样起作用。
“选择试剂”通常是指含有600mM硼酸、182.5mM氢氧化钠、1％(v/v)辛苯聚醇(
Figure BDA0003205779690000431
X-100)的溶液，pH为8.5。
“检测试剂”包含“检测试剂I”(其通常是指含有1mM硝酸和32mM过氧化氢的溶液)以及“检测试剂II”(其通常是指1.5M氢氧化钠溶液)。
实例1
在使用恶性疟原虫体外转录物(IVT)的手动Procleix增强型半自动化系统(eSAS)上使用转录介导的扩增(TMA)进行引物筛选。测定架由10行十管单元(TTU)组成。将七十五微升(75μL)的扩增试剂和5皮摩尔的每种T7启动子提供物寡核苷酸和非T7引物寡核苷酸添加到架上的适合的管，使得在适用的情况下，扩增低聚物的每种组合用每个反应30个和10个拷贝的恶性疟原虫IVT进行三次重复测试并且用每个反应1,000,000个拷贝的果氏巴贝虫IVT的进行两次重复测试。果氏巴贝虫由于巴贝虫属与疟原虫属之间的保守区域而被包含在初始筛选中作为交叉反应性样本。有必要确定扩增和检测系统对疟原虫属具有特异性。为了实现每个反应的目标拷贝，将以3c/μL或1c/μL稀释于缓冲液中的10μL的恶性疟原虫IVT掺入到适合的管中，并将以100,000c/μL稀释于缓冲液中的10μL的果氏巴贝虫掺入到适合的管中。对各种引物组合进行测试。这种设置允许每架测试10种引物组合。一旦掺入引物组合和IVT，将200μL的油添加到每个管，并且然后将架用密封卡片覆盖并涡旋至少20秒。
然后，将架在水浴中在60±1℃下温育10±1分钟，然后在41.5±1℃的水浴中温育9到20分钟。当架保留在水浴中时，将密封卡片去除，并将25μL的可商购获得的ProcleixUltrio Plus酶试剂(基立福诊断解决方案股份有限公司(Grifols Diagnostic SolutionsInc.))添加到每个反应管，并且然后再次用密封卡片覆盖。将架轻轻摇动以进行混合，并且然后再次用密封卡片覆盖，并在41.5±1℃水浴中温育另外的60±5分钟。
温育完成后，将架转移到杂交保护测定(HPA)区域，在所述区域处，将密封卡片去除。将100μL的由吖啶酯(AE)标记的探针组成的探针试剂以每个反应至少2.5e6相对光单位(RLU)的总期望浓度添加到杂交试剂。然后，将探针试剂添加到适合的反应管。将管用密封卡片覆盖，并将架涡旋至少20秒，然后将架在水浴中在61±2℃下温育15±1分钟。
将架从水浴中去除，将密封卡片去除，并将250μL的可商购获得的ProcleixUltrio Plus选择试剂(基立福诊断解决方案股份有限公司)添加到每个管。将管用密封卡片覆盖并涡旋至少20秒，并且然后放回到61±2℃的水浴中并温育10±1分钟。温育后，允许架在23±4℃的水浴中冷却至少10分钟。
为了进行检测，将TTU从架去除并装载到自动化Leader仪器上，以便随后使用可商购获得的Procleix自动检测1和2试剂(基立福诊断解决方案股份有限公司)进行点火，并将结果导出以对以相对光单位(RLU)计的信号进行分析。
本实例中筛选出的AE标记的探针示出在下表4中。在四个实验组中用扩增低聚物对筛选探针：第1组、第2a和2b组以及第3组。
表4.
探针# SEQ ID NO: 2MeAE接头位点
1 159 7,8
3 159 9,10
4 151 6,7
5 151 7,8
6 151 8,9
7 150 8,9
8 155 7,8
12 160 13,14
14 147 11,12
15 157 10,11
16 156 10,11
20 158 6,7
21 158 7,8
22 158 10,11
第1组。探针1、3、4-6、12和14-16各自用SEQ ID NO:59(T7启动子提供物低聚物)和SEQ ID NO:30(非T7低聚物)进行测试。这个探针筛选的结果示出在下表5中。候选者没有示出与每个反应1e6个拷贝的果氏巴贝虫IVT具有交叉反应性。另外，具有相同的核苷酸序列但具有不同的2MeAE接头位点的探针(参见例如，探针1和3；还参见探针4、5和6)表现良好，无论其不同的标记如何。
表5.
Figure BDA0003205779690000451
第2a和2b组。在第2a组中，对以下引物/探针组合进行了测试：与SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:33(T7/NT7)配对的探针8和20-22中的每个探针、与SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:52(T7/NT7)配对的探针7和20-22中的每个探针以及与SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:49(T7/NT7)配对的探针7和8中的每个探针。在第2b组中，对以下引物/探针组合进行了测试：与SEQID NO:66和SEQ ID NO:33(T7/NT7)配对的探针20-22中的每个探针、与SEQ ID NO:66和SEQID NO:52(T7/NT7)配对的探针7和20-22中的每个探针以及与SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:49(T7/NT7)配对的探针7。
这个探针筛选的结果示出在下表6和7中。具有SEQ ID NO:52的非T7低聚物的系统没有扩增疟原虫属。虽然具有与探针20-22中的任何探针配对的SEQ ID NO:59/SEQ ID NO:33的T7/NT7低聚物对的系统没有检测到疟原虫属，但是这些探针在与SEQ ID NO:66/SEQID NO:33的T7/NT7低聚物对一起使用检测到疟原虫属。
表6.
Figure BDA0003205779690000461
表7.
Figure BDA0003205779690000462
第3组。对SEQ ID NO:33的非T7引物的重新设计进行了测试。探针7和8中的每个探针与SEQ ID NO:66/SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:66/SEQ ID NO:35(T7/NT7)中的每一个配对。另外，探针20与SEQ ID NO:66/SEQ ID NO:33(T7/NT7)配对。
这个探针筛选的结果示出在下表8中。SEQ ID NO:66/SEQ ID NO:33的T7/NT7低聚物对与探针20一起表现良好。在探针7和8的情况下，对SEQ ID NO:33(SEQ ID NO:25和SEQID NO:35)的非T7低聚物的重新设计诱导了假阳性。
表8.
Figure BDA0003205779690000471
实例2
这个实例描述了用于在全自动化Procleix Panther系统(基立福诊断解决方案股份有限公司)上筛选使用TMA的候选扩增系统的材料和方法。
样本包含稀释于缓冲液中的恶性疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和/或间日疟原虫IVT。样本还可以包含果氏巴贝虫IVT作为交叉反应样本。有必要确定扩增和检测系统对疟原虫属具有特异性。包括500c/mL的恶性疟原虫IVT板的测定校准器包含在内以确定运行内的分析物截止值。测定软件使用分析物截止值来确定样品是反应性的还是非反应性的。信号与截止值的比率>1的样品被认为是反应性的，而<1的那些样品是非反应性的。所使用的测定试剂包含以下：包括至少一个靶捕获低聚物(TCO)的靶捕获试剂(TCR)；包括至少一个T7启动子提供物和至少一个非T7引物的扩增试剂；由至少一个AE标记的探针组成的探针试剂；Ultrio Plus酶试剂；和选择试剂。
实例3：疟原虫靶捕获探针筛选
用含有以500c/mL制备于具有1mL全血的3mL寄生虫运送培养基(PTM；100mM TRIS、30mM氯化镁和6％(v/v)LLS，pH为7.5)中的恶性疟原虫IVT的样品筛选候选靶捕获探针(TCO)。在基本上如实例2中所描述的全自动化Procleix Panther系统上进行TMA反应。SEQID NO:1-5、7、9和10的TCO在使用SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:69的T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:30的非T7低聚物(各自为5pmol/rxn)和SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152的检测探针(各自为1.9e6 RLU/rxn)的反应中进行测试。
结果示出在下表9和10中。TCO SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的测定性能最佳。SEQID NO:3在这个测定中不是最佳的。
表9.
TCO 平均总RLU*
SEQ ID NO:3 663,034
SEQ ID NO:1 873,914
SEQ ID NO:9 1,474,284
SEQ ID NO:2 985,039
SEQ ID NO:10 1,455,387
SEQ ID NO:7 793,219
SEQ ID NO:5 951,504
SEQ ID NO:4 952,023
*对于所有TCO，N＝10，除SEQ ID NO:3(N＝20)之外
表10.
TCO ％CV总RLU*
SEQ ID NO:3 19.2
SEQ ID NO:1 19.7
SEQ ID NO:9 2.6
SEQ ID NO:2 11.2
SEQ ID NO:10 3.6
SEQ ID NO:7 28.1
SEQ ID NO:5 14.4
SEQ ID NO:4 14.4
*对于所有TCO，N＝10，除SEQ ID NO:3(N＝20)之外
实例4：分析灵敏度-RNA的LoD(拷贝/mL)
使用恶性疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的体外合成的转录物通过概率元分析来评估候选扩增系统的检测极限(LoD)。在基本上如实例2中所描述的全自动化Procleix Panther系统上进行TMA反应。将每个物种的IVT在缓冲液中连续稀释到100、30、10、3、1和0拷贝/mL，并针对每个物种的每个水平进行32次重复测试。在全自动化Procleix Panther系统(基立福诊断解决方案股份有限公司)上使用TMA对样本进行测试。包括500c/mL的恶性疟原虫IVT板的测定校准器包含在内以确定运行内的分析物截止值。测定软件使用分析物截止值来确定样品是反应性的还是非反应性的。信号与截止值的比率>1的样品被认为是反应性的，而<1的那些样品是非反应性的。对于这个测定，使用以下低聚物：SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:69的T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:30的非T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152的检测探针(各自为1.9e6 RLU/rxn)以及SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的TCO。
结果示出于下表11中。观察到所测试的五个物种的LoD值类似。95％LoD范围为9.4到14.8拷贝/mL。
表11.
Figure BDA0003205779690000491
实例5：分析灵敏度-RNA的LoD(寄生虫/mL)
使用培养的寄生虫感染细胞通过概率元分析来评估候选扩增系统的检测极限(LoD)。具体地，使用裂解的阴性全血样本和稀释的培养的恶性疟原虫感染红细胞来对条件进行测试。在具有已知的寄生虫血症百分比和通过荧光活化细胞分选(FACS)确定的RBC计数的情况下接受培养的样品以估计浓度(寄生虫/mL值)。基于估计的寄生虫/mL值，将样品在正常阴性人全血中稀释到估计的6、4、2、1和0.5个寄生虫/mL。将稀释的疟原虫属感染全血以2.7mL的寄生虫运送培养基(PTM；100mM TRIS、30mM氯化镁和6％(v/v)LLS，pH为7.5)含0.9mL的全血的比率裂解。在全自动化Procleix Panther系统(基立福诊断解决方案股份有限公司)上使用TMA对样本进行测试。包括500c/mL的恶性疟原虫IVT板的测定校准器包含在内以确定运行内的分析物截止值。测定软件使用分析物截止值来确定样品是反应性的还是非反应性的。信号与截止值的比率>1的样品被认为是反应性的，而<1的那些样品是非反应性的。所使用的测定试剂包含以下：包括SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的TCO的靶捕获试剂(TCR)；包括SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:69的T7低聚物的扩增试剂(各自为5pmol/rxn)、SEQID NO:21和SEQ ID NO:30的非T7低聚物(各自为5pmol/rxn)；包括SEQ ID NO:148和SEQ IDNO:152的AE标记的检测探针的探针试剂(各自为1.9e6 RLU/rxn)；Ultrio Plus酶试剂；和选择试剂。
结果示出于下表12中。95％LoD为2.14个寄生虫/mL。对内部对照缓冲液、PTM和阴性裂解液中的每一个进行480次重复评价，没有假阳性(0/1,440)。
表12.
Figure BDA0003205779690000501
实例6：与巴贝虫属的干扰和交叉反应性
使用体外合成的转录物评估与果氏巴贝虫(同源原生动物)的干扰和交叉反应性。在基本上如实例2中所描述的全自动化Procleix Panther系统上进行的TMA反应中用介于100-1c/mL的恶性疟原虫IVT稀释液在添加和未添加1e6 c/mL的果氏巴贝虫的情况下进行测试。使用以下低聚物：SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、SEQID NO:34和SEQ ID NO:53的非T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:157的AE标记的检测探针(各自为1.9e6 RLU/rxn)以及SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的TCO。
结果示出在下表13和14中。在存在或不存在果氏巴贝虫IVT的情况下，观察到恶性疟原虫的相当的反应性和分析物RLU。
表13.
Figure BDA0003205779690000502
表14.
Figure BDA0003205779690000503
实例7：冗余探针的评价
使用体外合成的转录物评估冗余探针组合。在基本上如实例2中所描述的全自动化Procleix Panther系统上进行的TMA反应中进行测试。使用以下低聚物：(i)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、(ii)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:53的非T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、(iii)SEQ ID NO:148(4,5 2MeAE接头)和SEQ ID NO:157的AE标记的检测探针(各自为1.27e6 RLU/rxn)以及SEQ ID NO:148(5,6 2MeAE接头)或SEQID NO:148(6,7 2MeAE接头)以及(iv)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的TCO。
结果示出于下表15中。“C1”是指含有SEQ ID NO:148(5,6 2MeAE接头)的探针组合；“C2”是指含有SEQ ID NO:148(6,7 2MeAE接头)的探针组合。在具有冗余探针组合的情况下，观察到所有30和10c/mL的疟原虫的相当的反应性。与实例1中的结果一致，具有相同核苷酸序列(SEQ ID NO:148)但具有不同的2MeAE接头位点的探针表现良好，无论其不同的标记如何。
表15.
Figure BDA0003205779690000511
实例8：分析灵敏度-RNA的LoD(寄生虫/mL)
使用培养的恶性疟原虫感染红细胞通过概率元分析来评估候选扩增系统的检测极限(LoD)。在基本上如实例5中所描述的全自动化Procleix Panther系统上进行的TMA反应中进行测试。使用以下低聚物：(i)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、(ii)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:53的非T7低聚物(各自为5pmol/rxn)、(iii)SEQ ID NO:148(4,5 2MeAE接头)、SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:148(5,6 2MeAE接头)的AE标记的检测探针(分别为1.17e6、7.92e5和2.03e6 RLU/rxn)以及(iv)SEQ ID NO:9和SEQID NO:10的TCO。
结果示出于下表16中。95％LoD为2.31个寄生虫/mL。在所测试的阴性样本中没有假阳性。这些结果与实例5中所评价的系统是相当的，其中95％LoD为2.14个寄生虫/mL。
表16.
Figure BDA0003205779690000512
实例9
使用手动双相实时TMA测定的程序进行引物筛选。对于靶捕获步骤，将包括至少1个靶捕获寡核苷酸(TCO)和1个T7启动子提供物的400μL的靶捕获试剂(TCR)添加到2mL深孔96孔板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)目录号95040450)，然后添加500μL的样本。样本由稀释于用于疟原虫属检测的缓冲液中的疟原虫体外转录物(IVT)和稀释于用于巴贝虫属检测的缓冲液中的巴贝虫IVT组成。由于巴贝虫属与疟原虫属之间的保守区域，样本还可以包含果氏巴贝虫IVT或恶性疟原虫IVT作为相对的检测系统的交叉反应性样本。有必要确定扩增和检测系统对分析物系统具有特异性。将板用密封卡片覆盖，并装载到Torrey Pines板温育箱上并用盖覆盖。Torrey Pines温育箱的温育步骤包含在80℃下7分钟，然后分别在62℃下17分钟和在25℃下15到25分钟。
在靶捕获温育步骤之后，将板用深孔梳状尖端(赛默飞世尔科技公司目录号97002534)装载，并放置于装配有深孔磁铁的Kingfisher 96仪器(赛默飞世尔科技公司710型号REF 5400500)上。Kingfisher仪器另外地装载有由用500μL的可商购获得的Procleix洗涤缓冲液试剂(基立福诊断解决方案股份有限公司)制备的2mL 96孔板(Nunc深孔板目录号278752)组成的洗涤板和由含有200μL的洗涤缓冲液的200μL 96孔板(赛默飞世尔科技公司目录号97002540)组成的第二洗涤板。对于深孔洗涤步骤，将含有杂交的TCR样品混合物的板混合5分钟，然后收集磁珠20次并洗脱20秒到含有500μL的洗涤缓冲液的板。将500μL洗涤板混合1分钟，然后收集磁珠10次并洗脱20秒到含有200μL的洗涤缓冲液的洗涤板。
将含有杂交磁珠和洗涤缓冲液的混合物的第二洗涤板从Kingfisher仪器中去除，用小的PCR尖梳(赛默飞世尔科技公司97002514)装载，并转移到装配有PCR磁铁的第二Kingfisher 96仪器(赛默飞世尔科技公司710型号REF 5400500)。Kingfisher仪器另外地装载有96孔PCR板(爱思进公司(Axygen)目录号PCR-96-HS-C)，其含有含有至少1个非T7引物(扩增板)的30μL的扩增试剂(不含酚红)。为了将杂交磁珠转移到扩增板，将洗涤板混合5分钟，然后收集磁珠30次并洗脱30秒到扩增板。将洗涤板再次混合1分钟，然后收集磁珠30次并洗脱30秒到扩增板，以完成转移。
将扩增板用密封卡片覆盖，并装载到Stratagene仪器(Mx3005P多重定量PCR系统)上，以在43℃下温育5分钟。将板转移到设置为42℃的加热块，并揭开覆盖以添加10μL的可商购获得的Ultrio Plus酶试剂(基立福诊断解决方案股份有限公司)，并用密封卡片重新覆盖。将板在加热块上以1400RMP混合1分钟，并重新装载在Stratagene仪器上，以在43℃下温育5分钟。将板再次转移到加热块，并揭开覆盖以添加含有至少1个T7启动子提供物和至少1个荧光标记的分子火炬或信标(疟原虫属的5'-Hexochloro-荧光素(HEX)或巴贝虫属的5'-荧光素(FAM))的混合物的15μL的启动子试剂(不含酚红的扩增试剂)，并用透明胶粘板盖密封。将板在加热块上以1400RMP混合1分钟，并重新装载在Stratagene上，以进行读取协议。读取协议由以下组成：在43℃下温育，并且每30秒读取一次，循环120或150次。
使用内部软件工具分析从Stratagene仪器导出的原始数据。使用1,000个相对荧光单位(RFU)的阈值分析荧光曲线。样本符合或超过阈值的时间(TTime)由软件来确定。具有TTime的样本被认为对HEX通道中的疟原虫属或FAM通道中的巴贝虫属具有反应性。较低的TTime指示所测试的系统的性能较好。没有TTime或低于阈值的样本被认为是非反应性的。
在这个实例中，分子火炬或信标探针和扩增低聚物对的组合分成三组(第1组、第2组和第3组)进行测试。所测试的低聚物组合示出在下表17中。
表17.扩增低聚物和火炬探针的组合。
Figure BDA0003205779690000531
第1组结果。SEQ ID NO:104-107和121的探针成功地检测到其荧光曲线在10c/mL下生成的平均TTime小于或等于30.69分钟的疟原虫属。对于SEQ ID NO:108的探针，没有生成具有TTime的荧光曲线，从而得出结论：其无法检测到疟原虫属。
第2组结果。SEQ ID NO:181和184的扩增低聚物与SEQ ID NO:104的火炬探针组合成功地检测到疟原虫属，这通过荧光曲线在10c/mL下生成的TTime小于或等于20.89分钟证实，并且没有示出与巴贝虫属IVT具有交叉反应性，这通过不存在具有TTime的荧光曲线证实。
第2组结果。SEQ ID NO:51、31和50的非T7扩增低聚物各自与SEQ ID NO:59的T7扩增低聚物和SEQ ID NO:123的火炬探针组合成功地检测到疟原虫属，如通过荧光曲线生成的TTime小于或等于22.82分钟所证实的。
实例10
在安装有实时荧光计(美国豪洛捷有限公司)的全自动化Panther系统上使用实时TMA对候选扩增系统进行测试。样本由稀释于用于疟原虫属检测的缓冲液中的疟原虫IVT和稀释于用于巴贝虫属检测的缓冲液中的巴贝虫IVT组成。样本还可以包含果氏巴贝虫IVT或恶性疟原虫IVT作为交叉反应样本。有必要确定扩增和检测系统对分析物系统具有特异性。所使用的测定试剂包含以下：包括至少一个TCO和一个T7启动子提供物的TCR；包括至少一个非T7引物的扩增试剂；由至少一个T7启动子提供物和至少一个荧光标记的分子火炬或信标(疟原虫属的5'-Hexochloro-荧光素(HEX)或巴贝虫属的5'-荧光素(FAM))组成的启动子试剂(不含酚红的扩增试剂)；和Ultrio Plus酶试剂。
为了分析从Panther系统导出的原始数据，使用Panther RT-Dev工具(美国豪洛捷有限公司)。使用1,000个相对荧光单位(RFU)的阈值分析荧光曲线。样本符合或超过阈值的时间(TTime)由软件来确定。具有TTime的样本被认为对HEX通道中的疟原虫属或FAM通道中的巴贝虫属具有反应性。较低的TTime指示所测试的系统的性能较好。没有TTime或低于阈值的样本被认为是非反应性的。
在这个实例中测试的低聚物是SEQ ID NO:59的T7低聚物、SEQ ID NO:30的非T7低聚物和SEQ ID NO:123的火炬探针。结果证实，在30c/mL下测试的8次重复中有8次检测出疟原虫属IVT，并且在10c/mL下测试的8次重复中有3次。对于在10c/mL下检测到的重复，荧光曲线生成的TTime小于或等于33.18分钟。
实例11：在临床样本中检测疟原虫属
在安装有实时荧光计(美国豪洛捷有限公司)的全自动化Panther系统上使用实时TMA对候选扩增系统进行测试。样本由在缓冲液中稀释到300c/mL的果氏巴贝虫和恶性疟原虫IVT的阳性对照和由阴性缓冲液组成的阴性对照组成。临床样本由恶性疟原虫和卵形疟原虫全血和血浆样本组成。通过将100μL手动添加到3mL的裂解缓冲液(14mM碳酸氢钠、250mM氯化铵、5％(v/v)LLS和0.1mM EDTA，pH为7.4)来制备全血样本。通过将100μL手动添加到3mL的经处理的人血浆来制备血浆样本。在Panther系统上对样本进行测试。所使用的测定试剂包含以下：包括至少一个TCO和一个T7启动子提供物的TCR；包括至少一个非T7引物的扩增试剂；由至少一个T7启动子提供物和至少一个荧光标记的分子火炬或信标(疟原虫属的5'-Hexochloro-荧光素(HEX)或巴贝虫属的5'-荧光素(FAM))组成的启动子试剂(不含酚红的扩增试剂)；和酶试剂。
为了分析从Panther系统导出的原始数据，使用Panther RT-Dev工具(美国豪洛捷有限公司)。使用1,000个相对荧光单位(RFU)的阈值分析荧光曲线。样本符合或超过阈值的时间(TTime)由软件来确定。具有TTime的样本被认为对HEX通道中的疟原虫属或FAM通道中的巴贝虫属具有反应性。较低的TTime指示所测试的系统的性能较好。没有TTime或低于阈值的样本被认为是非反应性的。
在这个实例中测试的低聚物是SEQ ID NO:59的T7低聚物、SEQ ID NO:30的非T7低聚物和SEQ ID NO:123的火炬探针。结果示出于下表18中。所测试的低聚物的实时TMA结果与PCR结果100％一致。基于使用体外恶性疟原虫感染红细胞生成的校准曲线，所测试的样品在全血中具有介于7.14E6个到2.14E8个寄生虫/mL。没有观察到与巴贝虫属的交叉反应性。
表18.疟原虫属阳性临床样本的检测。
Figure BDA0003205779690000551
实例12
在安装有实时荧光计(美国豪洛捷有限公司)的全自动化Panther系统上使用实时TMA对候选扩增系统进行测试。样本由5个疟原虫菌株感染红细胞组成：US 05F Benin I、US05 F Santa Lucia、US 08F Nigeria XII、US05 F FC27/A3和US 05 F PH1。为受感染的红细胞提供估计的寄生虫/mL值。将每个菌株在正常阴性人全血中连续稀释至10个寄生虫/mL的估计值。以3mL的裂解缓冲液(14mM碳酸氢钠、250mM氯化铵、5％(v/v)LLS和0.1mM EDTA，pH为7.4)含1mL的全血的比率手动裂解稀释的疟原虫属感染全血。在Panther系统上对样本进行测试。所使用的测定试剂包含以下：包括至少一个TCO和一个T7启动子提供物的TCR；包括至少一个非T7引物的扩增试剂；由至少一个T7启动子提供物和至少一个荧光标记的分子火炬或信标(疟原虫属的5'-Hexochloro-荧光素(HEX)或巴贝虫属的5'-荧光素(FAM))组成的启动子试剂(不含酚红的扩增试剂)；和酶试剂。
为了分析从Panther系统导出的原始数据，使用Panther RT-Dev工具(美国豪洛捷有限公司)。使用1,000个相对荧光单位(RFU)的阈值分析荧光曲线。样本符合或超过阈值的时间(TTime)由软件来确定。具有TTime的样本被认为对HEX通道中的疟原虫属或FAM通道中的巴贝虫属具有反应性。较低的TTime指示所测试的系统的性能较好。没有TTime或低于阈值的样本被认为是非反应性的。
在这个实例中测试的低聚物是SEQ ID NO:59的T7低聚物、SEQ ID NO:30的非T7低聚物和SEQ ID NO:123的火炬探针。结果证实，在10个寄生虫/mL下测试的6次重复中有6次检测到全部5个疟原虫菌株感染红细胞，其中荧光曲线生成的TTime的范围为14.29到17.17分钟。
表19.示例性序列。
Figure BDA0003205779690000561
Figure BDA0003205779690000571
Figure BDA0003205779690000581
Figure BDA0003205779690000591
Figure BDA0003205779690000601
Figure BDA0003205779690000611
Figure BDA0003205779690000621
Figure BDA0003205779690000631
实施例
实施例1.一种用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的方法，所述方法包括：
(1)使样品与用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物接触，所述样品疑似含有疟原虫核酸，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物
(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包括SEQ ID NO:163的序列；或者
(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包括SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列的长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包括SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列；
(2)进行体外核酸扩增反应，其中所述样品中存在的任何疟原虫属靶核酸被用作用于生成扩增产物的模板；以及
(3)检测所述扩增产物的存在或不存在，由此指示所述样品中疟原虫靶核酸的存在或不存在。
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(i)的所述扩增低聚物。
实施例3.根据实施例2所述的方法，其中(a)(i)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:21、23-25、32、33、35、54和55组成的组。
实施例4.根据实施例2所述的方法，其中(a)(i)的所述靶杂交序列包含在SEQ IDNO:164的序列中并且包括SEQ ID NO:165的序列。
实施例5.根据实施例4所述的方法，其中(a)(i)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:21、23-25、32、33和35组成的组。
实施例6.根据实施例1所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(ii)的所述扩增低聚物。
实施例7.根据实施例6所述的方法，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ IDNO:167的序列。
实施例8.根据实施例7所述的方法，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:28-31、34、40、41和49-51组成的组。
实施例9.根据实施例6所述的方法，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ IDNO:168的序列。
实施例10.根据实施例9所述的方法，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列选自由SEQID NO:38、39、43、44和53组成的组。
实施例11.根据实施例1到10中任一项所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:80-82和85-100组成的组。
实施例12.根据实施例1到10中任一项所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170中并且包括SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列。
实施例13.根据实施例12所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列包括SEQ ID NO:171的序列。
实施例14.根据实施例13所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:81、82、85、87-90、94和96-98组成的组。
实施例15.根据实施例12所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列包括SEQ ID NO:172的序列。
实施例16.根据实施例15所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:80、82、85和87-100组成的组。
实施例17.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。
实施例18.根据实施例17所述的方法，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
实施例19.根据实施例18所述的方法，其中所述T7启动子序列是SEQ ID NO:179。
实施例20.根据实施例19所述的方法，其中(b)的所述扩增低聚物包括选自由SEQID NO:57-59和62-77组成的组的序列。
实施例21.根据实施例1所述的方法，其中(a)和(b)的所述靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:82；
(B)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82；
(C)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:82；
(D)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:89；
(E)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:89；
(F)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:89；
(G)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:89；
(H)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:92；
(I)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:92；
(J)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:94；
(K)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:94；
(L)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:94；
(M)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:95；
(N)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:95；或者
(O)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:95。
实施例22.根据实施例21所述的方法，其中(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。
实施例23.根据实施例22所述的方法，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
实施例24.根据实施例23所述的方法，其中所述T7启动子序列是SEQ ID NO:179。
实施例25.根据实施例1所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。
实施例26.根据实施例25所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(ii)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。
实施例27.根据实施例26所述的方法，其中
如(a)(ii)中的所述第一扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列；并且
如(a)(ii)中的所述第二扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:168的序列的靶杂交序列。
实施例28.根据实施例27所述的方法，其中所述第一扩增低聚物包括SEQ ID NO:34的靶杂交序列，并且所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:53的靶杂交序列。
实施例29.根据实施例25所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(i)中的扩增低聚物和如(a)(ii)中的扩增低聚物。
实施例30.根据实施例29所述的方法，其中
如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包括SEQID NO:165的序列的靶杂交序列；并且
如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:167的序列。
实施例31.根据实施例30所述的方法，其中如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括SEQID NO:21的靶杂交序列，并且如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:34的靶杂交序列。
实施例32.根据实施例1和25到31中任一项所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括(b)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。
实施例33.根据实施例32所述的方法，其中(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包括SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列的靶杂交序列。
实施例34.根据实施例33所述的方法，其中如(b)中的所述第一扩增低聚物包括SEQ ID NO:94的靶杂交序列，并且如(b)中的所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:95的靶杂交序列。
实施例35.根据实施例32到34中任一项所述的方法，其中(b)的所述扩增低聚物中的每种扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。
实施例36.根据实施例35所述的方法，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
实施例37.根据实施例36所述的方法，其中所述T7启动子序列是SEQ ID NO:179。
实施例38.根据前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(1)之前从所述样品中的其它组分中纯化所述靶核酸。
实施例39.根据实施例38所述的方法，其中纯化步骤包括使所述样品与至少一种捕获探针低聚物接触，所述至少一种捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分的共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列的长度为至多约30个连续核苷酸并且包括选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例40.根据实施例39所述的方法，其中所述捕获探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例41.根据实施例39所述的方法，其中纯化步骤包括使所述样品与至少两种捕获探针低聚物接触。
实施例42.根据实施例41所述的方法，其中所述至少两种捕获探针低聚物包括
第一捕获探针低聚物，所述第一捕获探针低聚物包括SEQ ID NO:19的靶杂交序列；以及
第二捕获探针低聚物，所述第二捕获探针低聚物包括SEQ ID NO:20的靶杂交序列。
实施例43.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种检测探针低聚物接触，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成在借此确定所述扩增产物的存在或不存在由此指示所述样品中疟原虫的存在或不存在的条件下与所述扩增产物特异性杂交的靶杂交序列。
实施例44.根据实施例43所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例45.根据实施例44所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例46.根据实施例44所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:175的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例47.根据实施例46所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:174或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例48.根据实施例47所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:148-155和159组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例49.根据实施例46所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:175或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例50.根据实施例49所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例51.根据实施例44所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括选自由SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例52.根据实施例51所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156，157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例53.根据实施例43到52中任一项所述的方法，其中所述检测探针低聚物在所述检测探针低聚物核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个核苷酸残基成员上包括2'甲氧基修饰。
实施例54.根据实施例43到53所述的方法，其中(a)的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b)的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:151或其补体或SEQ ID NO:151或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(B)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(C)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(D)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:150或其补体或SEQ ID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(E)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(F)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(G)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(H)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(I)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(I)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:158或其补体或SEQ ID NO:158或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(K)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:150或其补体或SEQ ID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(L)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(M)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(N)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(O)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(P)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(Q)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(R)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(S)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(T)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(U)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(V)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(W)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(X)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(Y)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(Z)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AA)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AB)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AC)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AD)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者
(AE)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例55.根据实施例43到54中任一项所述的方法，其中所述检测探针低聚物包括可检测标记。
实施例56.根据实施例55所述的方法，其中所述可检测标记是化学发光标记或荧光标记。
实施例57.根据实施例56所述的方法，其中所述可检测标记是连接在所述检测探针低聚物的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(AE)化合物。
实施例58.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中检测步骤(3)在所述扩增步骤(2)期间发生。
实施例59.根据实施例56或58所述的方法，其中所述检测探针包括荧光标记和淬灭剂。
实施例60.根据实施例59所述的方法，其中所述检测探针选自由分子火炬、分子信标和TaqMan检测探针组成的组。
实施例61.根据实施例43到60中任一项所述的方法，其中所述检测探针进一步包括非靶杂交序列。
实施例62.根据实施例61所述的方法，其中所述检测探针是分子火炬或分子信标。
实施例63.根据实施例43所述的方法，其中所述至少一种检测探针低聚物包括至少两种检测探针低聚物。
实施例64.根据实施例44所述的方法，其中所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物，其中
(A)所述第一检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列；并且
(B)所述第二检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包括SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列。
实施例65.根据实施例64所述的方法，其中
所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；并且
所述第二检测探针低聚物包括选自由SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152组成的组的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例66.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤(2)处的所述扩增反应是等温扩增反应。
实施例67.根据实施例66所述的方法，其中所述扩增反应是转录介导的扩增(TMA)反应。
实施例68.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述扩增反应是实时扩增反应。
实施例69.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述样品是临床样品。
实施例70.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品。
实施例71.根据实施例70所述的方法，其中所述样品是裂解的血液细胞样品，任选地其中所述样品是裂解的红细胞样品。
实施例72.根据实施例70所述的方法，其中所述样品是红细胞样品。
实施例73.一种用于确定样品中疟原虫的存在或不存在的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物
(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包括SEQ ID NO:163的序列；或者
(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包括SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列的长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包括SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列。
实施例74.根据实施例73所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(i)的所述扩增低聚物。
实施例75.根据实施例74所述的低聚物组合，其中(a)(i)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:21、23-25、32、33、35、54和55组成的组。
实施例76.根据实施例74所述的低聚物组合，其中(a)(i)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包括SEQ ID NO:165的序列。
实施例77.根据实施例76所述的低聚物组合，其中(a)(i)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:21、23-25、32、33和35组成的组。
实施例78.根据实施例73所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(ii)的所述扩增低聚物。
实施例79.根据实施例78所述的低聚物组合，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ ID NO:167的序列。
实施例80.根据实施例79所述的低聚物组合，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:28-31、34、40、41和49-51组成的组。
实施例81.根据实施例78所述的低聚物组合，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ ID NO:168的序列。
实施例82.根据实施例81所述的低聚物组合，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:38、39、43、44和53组成的组。
实施例83.根据实施例73到82中任一项所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:80-82和85-100组成的组。
实施例84.根据实施例73到82中任一项所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170中并且包括SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列。
实施例85.根据实施例84所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列包括SEQID NO:171的序列。
实施例86.根据实施例85所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:81、82、85、87-90、94和96-98组成的组。
实施例87.根据实施例84所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列包括SEQID NO:172的序列。
实施例88.根据实施例87所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:80、82、85和87-100组成的组。
实施例89.根据前述实施例中任一项所述的低聚物组合，其中(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。
实施例90.根据实施例89所述的低聚物组合，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
实施例91.根据实施例90所述的低聚物组合，其中所述T7启动子序列是SEQ IDNO:179。
实施例92.根据实施例91所述的低聚物组合，其中(b)的所述扩增低聚物包括选自由SEQ ID NO:57-59和62-77组成的组的序列。
实施例93.根据实施例73所述的低聚物组合，其中(a)和(b)的所述靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:82；
(B)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82；
(C)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:82；
(D)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:89；
(E)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:89；
(F)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:89；
(G)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:89；
(H)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:92；
(I)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:92；
(J)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:94；
(K)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:94；
(L)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:94；
(M)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:95；
(N)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:95；或者
(O)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:95。
实施例94.根据实施例93所述的低聚物组合，其中(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。
实施例95.根据实施例94所述的低聚物组合，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
实施例96.根据实施例95所述的低聚物组合，其中所述T7启动子序列是SEQ IDNO:179。
实施例97.根据实施例73所述的低聚物组合物，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。
实施例98.根据实施例97所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(ii)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。
实施例99.根据实施例98所述的低聚物组合，其中
如(a)(ii)中的所述第一扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列；并且
如(a)(ii)中的所述第二扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:168的序列的靶杂交序列。
实施例100.根据实施例99所述的低聚物组合，其中所述第一扩增低聚物包括SEQID NO:34的靶杂交序列，并且所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:53的靶杂交序列。
实施例101.根据实施例97所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(i)中的扩增低聚物和如(a)(ii)中的扩增低聚物。
实施例102.根据实施例101所述的低聚物组合，其中
如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包括SEQID NO:165的序列的靶杂交序列；并且
如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:167的序列。
实施例103.根据实施例102所述的低聚物组合，其中如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:21的靶杂交序列，并且如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:34的靶杂交序列。
实施例104.根据实施例73和97到103中任一项所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括(b)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物。
实施例105.根据实施例104所述的低聚物组合，其中(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:170中并且包括SEQ IDNO:171或SEQ ID NO:172的序列的靶杂交序列。
实施例106.根据实施例105所述的低聚物组合，其中如(b)中的所述第一扩增低聚物包括SEQ ID NO:94的靶杂交序列，并且如(b)中的所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:95的靶杂交序列。
实施例107.根据实施例93所述的低聚物组合，其中(b)的所述扩增低聚物中的每种扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物。
实施例108.根据实施例107所述的低聚物组合，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
实施例109.根据实施例108所述的低聚物组合，其中所述T7启动子序列是SEQ IDNO:179。
实施例110.根据前述实施例中任一项所述的低聚物组合，其进一步包括至少一种捕获探针低聚物，所述至少一种捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分的共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列的长度为至多约30个连续核苷酸并且包括选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例111.根据实施例110所述的低聚物组合，其中所述捕获探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例112.根据实施例110所述的低聚物组合，其中所述低聚物组合包括至少两种捕获探针低聚物。
实施例113.根据实施例112所述的低聚物组合，其中所述至少两种捕获探针低聚物包括
第一捕获探针低聚物，所述第一捕获探针低聚物包括SEQ ID NO:19的靶杂交序列或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；以及
第二捕获探针低聚物，所述第二捕获探针低聚物包括SEQ ID NO:20的靶杂交序列或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例114.根据前述实施例中任一项所述的低聚物组合，其进一步包括至少一种检测探针低聚物，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成与能够由所述至少两种扩增低聚物扩增的疟原虫扩增子特异性杂交的靶杂交序列。
实施例115.根据实施例114所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例116.根据实施例115所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例117.根据实施例115所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:175组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例118.根据实施例117所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:174的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例119.根据实施例118所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:148-155和159组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例120.根据实施例117所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例121.根据实施例120所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例122.根据实施例115所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括选自由SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例123.根据实施例122所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例124.根据实施例114到123中任一项所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物在所述检测探针低聚物核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个核苷酸残基成员上包括2'甲氧基修饰。
实施例125.根据实施例114到124所述的低聚物组合，其中(a)的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b)的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:151或其补体或SEQ ID NO:151或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(B)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(C)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(D)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:150或其补体或SEQ ID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(E)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:155或其补体或SEQ ID NO:155或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(F)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(G)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(H)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(I)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(I)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:158或其补体或SEQ ID NO:158或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(K)SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:150或其补体或SEQ ID NO:150或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(L)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(M)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(N)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(O)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(P)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(Q)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(R)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(S)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(T)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(U)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(V)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(W)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(X)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(Y)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(Z)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AA)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AB)SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AC)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:148或其补体或SEQ ID NO:148或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(AD)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:152或其补体或SEQ ID NO:152或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者
(AE)SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:157或其补体或SEQ ID NO:157或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例126.根据实施例114到125中任一项所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物包括可检测标记。
实施例127.根据实施例126所述的低聚物组合，其中所述可检测标记是化学发光标记或荧光标记。
实施例128.根据实施例127所述的低聚物组合，其中所述可检测标记是连接在所述检测探针低聚物的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(AE)化合物。
实施例129.根据实施例127所述的低聚物组合，其中所述检测探针包括荧光标记和淬灭剂。
实施例130.根据实施例129所述的低聚物组合，其中所述检测探针选自由分子火炬、分子信标和TaqMan检测探针组成的组。
实施例131.根据实施例114到130中任一项所述的低聚物组合，其中所述检测探针进一步包括非靶杂交序列。
实施例132.根据实施例131所述的低聚物组合，其中所述检测探针是分子火炬或分子信标。
实施例133.根据实施例114所述的低聚物组合，其中所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物。
实施例134.根据实施例115所述的低聚物组合，其中所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物，其中
(A)所述第一检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列；并且
(B)所述第二检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包括SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列。
实施例135.根据实施例134所述的低聚物组合，其中
所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；并且
所述第二检测探针低聚物包括选自由SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152组成的组的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例136.一种用于特异性检测样品中的疟原虫靶核酸的检测探针低聚物，所述检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸并且被配置成与包含在能够由包括第一疟原虫属特异性扩增低聚物和第二疟原虫属特异性扩增低聚物的低聚物组合扩增的疟原虫靶区域内的靶序列特异性杂交，其中
(a)所述第一扩增低聚物包括靶杂交序列，(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包括SEQ ID NO:163的序列，或者(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包括SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168的序列；并且
(b)所述第二扩增低聚物包括长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ IDNO:169中并且包括SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列的靶杂交序列。
实施例137.根据实施例136所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例138.根据实施例137所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例139.根据实施例137所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:175的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例140.根据实施例139所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括序列SEQ ID NO:174的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例141.根据实施例140所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:148-155和159组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例142.根据实施例139所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例143.根据实施例142所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例144.根据实施例137所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括选自由SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例145.根据实施例144所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例146.根据实施例136到145中任一项所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物在所述检测探针低聚物核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个核苷酸残基成员上包括2'甲氧基修饰。
实施例147.根据实施例136到146中任一项所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针低聚物包括标记。
实施例148.根据实施例147所述的检测探针低聚物，其中所述标记是化学发光标记或荧光标记。
实施例149.根据实施例148所述的检测探针低聚物，其中所述标记是连接在所述检测探针低聚物的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(AE)化合物。
实施例150.根据实施例148所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针包括荧光标记和淬灭剂。
实施例152.根据实施例150所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针选自由分子火炬、分子信标和TaqMan检测探针组成的组。
实施例153.根据实施例136到152中任一项所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针进一步包括非靶杂交序列。
实施例154.根据实施例153所述的检测探针低聚物，其中所述检测探针是分子火炬或分子信标。
实施例155.一种用于检测样品中的疟原虫靶核酸的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括根据实施例136所述的至少两种检测探针低聚物。
实施例156.根据实施例155所述的低聚物组合，其中所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物，其中
(A)所述第一检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列；并且
(B)所述第二检测探针低聚物包括(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中并且(ii)包括SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体的靶杂交序列。
实施例157.根据实施例156所述的低聚物组合，其中
所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；并且
所述第二检测探针低聚物包括选自由SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152组成的组的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例158.一种用于从样品中特异性分离疟原虫核酸的捕获探针低聚物，所述捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分的共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列的长度为至多约30个连续核苷酸并且包括选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例159.根据实施例158所述的捕获探针低聚物，其中所述捕获探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例160.一种用于从样品中特异性分离疟原虫核酸的至少两种低聚物的组合，其中所述低聚物组合包括根据实施例158所述的至少两种捕获探针低聚物。
实施例161.根据实施例160所述的低聚物组合，其中所述至少两种捕获探针低聚物包括
第一捕获探针低聚物，所述第一捕获探针低聚物包括SEQ ID NO:19的靶杂交序列或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；以及
第二捕获探针低聚物，所述第二捕获探针低聚物包括SEQ ID NO:20的靶杂交序列或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例162.一种试剂盒，其包括根据实施例73到135、155到157、160和161中任一项所述的至少两种低聚物的组合。
实施例163.一种反应混合物，其包括根据实施例73到135、155到157、160和161中任一项所述的至少两种低聚物的组合。
实施例164.一种根据实施例73到135中任一项所述的至少两种低聚物的组合用于特异性扩增样品中的疟原虫核酸的用途。
实施例165.一种根据实施例136到157中任一项所述的检测探针低聚物或低聚物组合用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的用途。
实施例166.一种根据实施例158到161中任一项所述的捕获探针低聚物或低聚物组合用于特异性捕获来自样品的疟原虫核酸的用途。
实施例167.一种用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的方法，所述方法包括：
(1)使样品与用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物接触，所述样品疑似含有疟原虫核酸，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:187的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:188中并且包括SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列；
(2)进行体外核酸扩增反应，其中所述样品中存在的任何疟原虫属靶核酸被用作用于生成扩增产物的模板；以及
(3)检测所述扩增产物的存在或不存在，由此指示所述样品中疟原虫靶核酸的存在或不存在。
实施例168.根据实施例167所述的方法，其中(a)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:37、46、183和184组成的组。
实施例169.根据实施例168所述的方法，其中(a)的所述靶杂交序列包含在SEQ IDNO:186的序列中。
实施例170.根据实施例169所述的方法，其中(a)的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:184。
实施例171.根据实施例167到170中任一项所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:83、84和182组成的组。
实施例172.根据实施例167所述的方法，其中(a)的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:184，并且(b)的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:182。
实施例173.根据实施例167到172中任一项所述的方法，其中检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种检测探针低聚物接触，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成在借此确定所述扩增产物的存在或不存在由此指示所述样品中疟原虫的存在或不存在的条件下与所述扩增产物特异性杂交的靶杂交序列。
实施例174.根据实施例173所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为至少约13个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:189的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例175.根据实施例174所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:125-130和143组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例176.根据实施例173所述的方法，其中(a)的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b)的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(B)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:127或其补体或SEQ ID NO:127或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(C)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:128或其补体或SEQ ID NO:128或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(D)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:143或其补体或SEQ ID NO:143或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(E)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:129或其补体或SEQ ID NO:129或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者
(F)SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例177.一种用于确定样品中疟原虫的存在或不存在的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:187的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:188中并且包括SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列。
实施例178.根据实施例177所述的低聚物组合，其中(a)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:37、46、183和184组成的组。
实施例179.根据实施例178所述的低聚物组合，其中(a)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:186的序列中。
实施例180.根据实施例179所述的低聚物组合，其中(a)的所述靶杂交序列是SEQID NO:183或SEQ ID NO:184。
实施例181.根据实施例177到180中任一项所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:83、84和182组成的组。
实施例182.根据实施例177所述的低聚物组合，其中(a)的所述靶杂交序列是SEQID NO:183或SEQ ID NO:184，并且(b)的所述靶杂交序列是SEQ ID NO:182。
实施例183.根据实施例177到182中任一项所述的低聚物组合，其进一步包括至少一种检测探针低聚物，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成与能够由所述至少两种扩增低聚物扩增的疟原虫扩增子特异性杂交的靶杂交序列。
实施例184.根据实施例183所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为至少约13个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:189的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
实施例185.根据实施例174所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:125-130和143组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
实施例186.根据实施例173所述的低聚物组合，其中(a)的所述扩增低聚物靶杂交序列、(b)的所述扩增低聚物靶杂交序列和所述检测探针低聚物靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(B)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:127或其补体或SEQ ID NO:127或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(C)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:128或其补体或SEQ ID NO:128或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(D)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:143或其补体或SEQ ID NO:143或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；
(E)SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:129或其补体或SEQ ID NO:129或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；或者
(F)SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:126或其补体或SEQ ID NO:126或其补体的DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体。
实施例187.一种用于特异性检测样品中的疟原虫靶核酸的检测探针低聚物，所述检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列的长度为至少约13个核苷酸并且被配置成与包含在能够由包括第一疟原虫属特异性扩增低聚物和第二疟原虫属特异性扩增低聚物的低聚物组合扩增的疟原虫靶区域内的靶序列特异性杂交，其中
(a)所述第一扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:187的序列的靶杂交序列；并且
(b)所述第二扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:188中并且包括SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列的靶杂交序列。
实施例188.一种试剂盒，其包括根据实施例177到186中任一项所述的至少两种低聚物的组合。
实施例189.一种反应混合物，其包括根据实施例177到186中任一项所述的至少两种低聚物的组合。
实施例190.一种根据实施例177到186中任一项所述的至少两种低聚物的组合用于特异性扩增样品中的疟原虫核酸的用途。
实施例191.一种根据实施例177到187中任一项所述的检测探针低聚物或低聚物组合用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的用途。
根据前文，应当了解，尽管本文出于说明的目的已经描述了本发明的具体实施例，但是可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下作出各种修改。因此，除所附的权利要求书之外本发明不受限制。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。
************************
序列表
<110> 基因探针股份有限公司
基立福诊断解决方案股份有限公司
迪安娜·塞尔夫
杰弗里·M.·林恩
瓦妮莎·布雷斯
<120> 用于检测疟原虫核酸的组合物和方法
<130> GDS-0110PC
<150> US 62/782,945
<151> 2018-12-20
<160> 197
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(55)
<400> 1
ggauugggua auuugcgcgc cctttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 55
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(61)
<400> 2
caagaaagag cuaucaaucu gucaaucctt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
a 61
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(59)
<400> 3
cccguguuga gucaaauuaa gccgcattta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(55)
<400> 4
ggguaauuug cgcgccugcu gctttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 55
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(59)
<400> 5
uuucucaggc ucccucuccg gaaucgttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(57)
<400> 6
acaucugaau acgaaugucc ccaatttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 57
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(56)
<400> 7
cuagucggca uaguuuaugg uuatttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 56
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(57)
<400> 8
aaaaacggcc augcaucacc aucctttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 57
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(54)
<400> 9
uaggccaaua cccuaccguc ctttaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 54
<210> 10
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
aaagacuuug auuucucuca aggtttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 56
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
ggauugggua auuugcgcgc cc 22
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
caagaaagag cuaucaaucu gucaaucc 28
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
cccguguuga gucaaauuaa gccgca 26
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
ggguaauuug cgcgccugcu gc 22
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
uuucucaggc ucccucuccg gaaucg 26
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
acaucugaau acgaaugucc ccaa 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
cuagucggca uaguuuaugg uua 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
aaaaacggcc augcaucacc aucc 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
uaggccaaua cccuaccguc c 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
aaagacuuug auuucucuca agg 23
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
aatactacag catgg 15
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
ggaaggcagc aggcgcgta 19
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
aatactacag catgga 16
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
aatactacag catggaa 17
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
atactacagc atggaata 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
attcagatgt cagaggtga 19
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
gtattcagat gtcagaggtg a 21
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
gttacgatta ataggagt 18
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
gttacgatta ataggagta 19
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
gttacgatta ataggagtag 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
gttacgatta ataggagtag c 21
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
aatactacag catggaat 18
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
aatactacag catggaata 19
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
tacgattaat aggagt 16
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
tactacagca tggaata 17
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
tattcagatg tcagaggtga 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 37
tcagtncctt atgagaaatc 20
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
tggcttagtt acgatt 16
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
tggcttagtt acgattaata g 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
ttaataggag tagcttgggg 20
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
ttacgattaa taggagt 17
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
ttcagatgtc agaggtga 18
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
ttggcttagt tacgat 16
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
ttggcttagt tacgatta 18
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
ttggggacat tcgtattcag a 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
tttagattgc ttccttcagt 20
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 47
tttgaatact anagca 16
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
acattcgtat tcagatgtca g 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
cttagttacg attaatagga 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
cgattaatag gagtagcttg g 21
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
cttagttacg attaatagga gtag 24
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 52
cttgaatact ncagca 16
<210> 53
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
ggcttagtta cgatta 16
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 54
aatactanag catgg 15
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 55
aatactanag catggaata 19
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
aattctaaag aagagag 17
<210> 57
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 57
aatttaatac gactcactat agggagattc actcccttaa ctttcgttct tg 52
<210> 58
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 58
aatttaatac gactcactat agggagactt gattaatgga agtattttag a 51
<210> 59
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 59
aatttaatac gactcactat agggagactt aactttcgtt cttgattaat ggaagt 56
<210> 60
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 60
aatttaatac gactcactat agggagacct actcttgtct taaacta 47
<210> 61
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 61
aatttaatac gactcactat agggagaaaa cggccatgca tcaccatcca aga 53
<210> 62
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 62
aatttaatac gactcactat agggagactc ccttaacttt cgttcttgat taatggaagt 60
<210> 63
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 63
aatttaatac gactcactat agggagacga cggtatctga tcgtcttcac tccc 54
<210> 64
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 64
aatttaatac gactcactat agggagactt aactttcgtt cttgattaat ggaag 55
<210> 65
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 65
aatttaatac gactcactat agggagactt aactttcgtt cttgattaat ggaagta 57
<210> 66
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 66
aatttaatac gactcactat agggagacac tcccttaact ttcgttcttg attaatg 57
<210> 67
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 67
aatttaatac gactcactat agggagacac tcccttaact ttcgttcttg attaatgg 58
<210> 68
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 68
aatttaatac gactcactat agggagactt cactccctta actttcgttc ttgatt 56
<210> 69
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 69
aatttaatac gactcactat agggagactt cactccctta actttcgttc ttgat 55
<210> 70
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 70
aatttaatac gactcactat agggagaatc gtcttcactc ccttaacttt cgttc 55
<210> 71
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 71
aatttaatac gactcactat agggagactc ccttaacttt cgttcttgat taatg 55
<210> 72
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 72
aatttaatac gactcactat agggagatca ctcccttaac tttcgttctt gat 53
<210> 73
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 73
aatttaatac gactcactat agggagaccc ttaactttcg ttcttgatta atg 53
<210> 74
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 74
aatttaatac gactcactat agggagactt aactttcgtt cttgattaat g 51
<210> 75
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 75
aatttaatac gactcactat agggagataa ctttcgttct tgattaatg 49
<210> 76
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 76
aatttaatac gactcactat agggagaact cccttaactt tcgttcttga t 51
<210> 77
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 77
aatttaatac gactcactat agggagatcc cttaactttc gttcttgat 49
<210> 78
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 78
aatttaatac gactcactat agggagaagg caaatgcttt cgcagttgtt ngtct 55
<210> 79
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<400> 79
aatttaatac gactcactat agggagaagg caaatgcttt cgcagttgtt tgtct 55
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
ttcactccct taactttcgt tcttg 25
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
cttgattaat ggaagtattt taga 24
<210> 82
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
cttaactttc gttcttgatt aatggaagt 29
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
cctactcttg tcttaaacta 20
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
aaacggccat gcatcaccat ccaaga 26
<210> 85
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
ctcccttaac tttcgttctt gattaatgga agt 33
<210> 86
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 86
cgacggtatc tgatcgtctt cactccc 27
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 87
cttaactttc gttcttgatt aatggaag 28
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 88
cttaactttc gttcttgatt aatggaagta 30
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 89
cactccctta actttcgttc ttgattaatg 30
<210> 90
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 90
cactccctta actttcgttc ttgattaatg g 31
<210> 91
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 91
cttcactccc ttaactttcg ttcttgatt 29
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 92
cttcactccc ttaactttcg ttcttgat 28
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 93
atcgtcttca ctcccttaac tttcgttc 28
<210> 94
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 94
ctcccttaac tttcgttctt gattaatg 28
<210> 95
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 95
tcactccctt aactttcgtt cttgat 26
<210> 96
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 96
cccttaactt tcgttcttga ttaatg 26
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 97
cttaactttc gttcttgatt aatg 24
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 98
taactttcgt tcttgattaa tg 22
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 99
actcccttaa ctttcgttct tgat 24
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 100
tcccttaact ttcgttcttg at 22
<210> 101
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 101
aggcaaatgc tttcgcagtt gttngtct 28
<210> 102
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 102
aggcaaatgc tttcgcagtt gtttgtct 28
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 103
cgcgcaagcg agaaagcgcg 20
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 104
gcucgcauuc gcgcaagcga gc 22
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 105
gcuugcgagu auucgcgcaa gc 22
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
ggcaagcgag aaagucuugc c 21
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
ccgagguauu cgcgcaacuc gg 22
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
ggcucacuuu cucgcuugga gcc 23
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 109
cucuggagac nagcaccaga g 21
<210> 110
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
gucucauuuu cuggagac 18
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
gccuaaaaua cuuccuaggc 20
<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
cauggaaaua cuuccaug 18
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
ccgagauuuu cuggagaccu cgg 23
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
ccgaggccua aaauacuucc cucgg 25
<210> 115
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
gggaauuuaa aaccuuccc 19
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
ggaaggaauu uaaaaccuuc c 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
gugggaauuu aaaaccccca c 21
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
uccagaaauu cuuagauuuu cugga 25
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
acuccgaacg aaaguuaagg gagu 24
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
agggagugaa gacgaucauc ccu 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
ucgcgcaagc gagaaaggcg cga 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 122
ccgaagugnc uaaaauacuu cgg 23
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
caccucagau gucagaggug 20
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
cuaccucuaa agaagagagg uag 23
<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
cgcgcaagcg agaaag 16
<210> 126
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
auucgcgcaa gcgagc 16
<210> 127
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
gaguauucgc gcaagc 16
<210> 128
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 128
ggcaagcgag aaagu 15
<210> 129
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 129
guauucgcgc aa 12
<210> 130
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 130
acuuucucgc uug 13
<210> 131
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 131
cucuggagac nagca 15
<210> 132
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 132
auuuucugga gac 13
<210> 133
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 133
gccuaaaaua cuucc 15
<210> 134
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 134
aaauacuucc aug 13
<210> 135
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 135
auuuucugga gac 13
<210> 136
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 136
ccuaaaauac uuc 13
<210> 137
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 137
gggaauuuaa aacc 14
<210> 138
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 138
ggaauuuaaa accuucc 17
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 139
gugggaauuu aaaacc 16
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 140
gaaauucuua gauuuucugg a 21
<210> 141
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 141
gaacgaaagu uaagggagu 19
<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 142
agggagugaa gacgauca 18
<210> 143
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 143
ucgcgcaagc gagaaag 17
<210> 144
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 144
ugncuaaaau acuucgg 17
<210> 145
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 145
cagaugucag aggug 15
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 146
ucuaaagaag agagguag 18
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 147
ucuuagauuu ucuggagac 19
<210> 148
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 148
uucagauguc agagg 15
<210> 149
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 149
uucagauguc agaggt 16
<210> 150
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 150
uauucagaug ucagaggt 18
<210> 151
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 151
uauucagaug ucagaggug 19
<210> 152
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 152
ucagauguca gaggt 15
<210> 153
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 153
uucagauguc agaggt 16
<210> 154
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 154
auucagaugu cagaggt 17
<210> 155
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 155
auucagaugu cagaggug 18
<210> 156
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 156
cuuagauuuu cuggaga 17
<210> 157
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 157
cuuagauuuu cuggagac 18
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 158
cuuaguuacg auuaauagga 20
<210> 159
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 159
guauucagau gucagaggug a 21
<210> 160
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 160
auucuuagau uuucuggaga c 21
<210> 161
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 161
cuaagauuuu cuggagac 18
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 162
tttgaatact anagcatgga ata 23
<210> 163
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 163
tactanagca 10
<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 164
tttgaatact acagcatgga ata 23
<210> 165
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 165
tactacagca 10
<210> 166
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 166
ttggcttagt tacgattaat aggagtagct tgggg 35
<210> 167
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 167
ttaataggag t 11
<210> 168
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 168
ggcttagtta cgat 14
<210> 169
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 169
cgacggtatc tgatcgtctt cactccctta actttcgttc ttgattaatg gaagtatttt 60
aga 63
<210> 170
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 170
atcgtcttca ctcccttaac tttcgttctt gattaatgga agtattttag a 51
<210> 171
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 171
cttgattaat g 11
<210> 172
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 172
taactttcgt tc 12
<210> 173
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 173
cttcactccc 10
<210> 174
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 174
ucagauguca gagg 14
<210> 175
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 175
cuaagauuuu cuggaga 17
<210> 176
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 176
cagaugucag agg 13
<210> 177
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> y意指t/u或c
<400> 177
yucuggagac 10
<210> 178
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 178
auuuucugga 10
<210> 179
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 179
aatttaatac gactcactat agggaga 27
<210> 180
<211> 2087
<212> DNA
<213> 恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）
<300>
<308> XR_002273081.2
<309> 2018-03-28
<313> (1)..(2087)
<400> 180
aacctggttg atcttgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtga 60
aagtatatat atattttata tgtagaaact gcgaacggct cattaaaaca gttatagtct 120
acttgacatt tttattataa ggataactac ggaaaagctg tagctaatac ttgctttatt 180
atcctttgat ttttatcttt ggataagtat ttgttaggcc ttataagaaa aaagttatta 240
acttaaggaa ttataacaaa gaagtaacac gtaataaatt tattttattt agtgtgtatc 300
aatcgagttt ctgacctatc agcttttgat gttagggtat tggcctaaca tggctatgac 360
gggtaacggg gaattagagt tcgattccgg agagggagcc tgagaaatag ctaccacatc 420
taaggaaggc agcaggcgcg taaattaccc aattctaaag aagagaggta gtgacaagaa 480
ataacaatgc aaggccaatt tttggttttg taattggaat ggtgggaatt taaaaccttc 540
ccagagtaac aattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaattc cagctccaat 600
agcgtatatt aaaattgttg cagttaaaac gctcgtagtt gaatttcaaa gaatcgatat 660
tttattgtaa ctattctagg ggaactattt tagctttcgc tttaatacgc ttcctctatt 720
attatgttct ttaaataaca aagattcttt ttaaaatccc cacttttgct tttgcttttt 780
ggggattttg ttactttgag taaattagag tgttcaaagc aaacagttaa agcatttact 840
gtgtttgaat actatagcat ggaataacaa aattgaacaa gctaaaattt tttgttcttt 900
tttcttattt tggcttagtt acgattaata ggagtagctt ggggacattc gtattcagat 960
gtcagaggtg aaattcttag attttctgga gacgaacaac tgcgaaagca tttgtctaaa 1020
atacttccat taatcaagaa cgaaagttaa gggagtgaag acgatcagat accgtcgtaa 1080
tcttaaccat aaactatgcc gactaggtgt tggatgaaag tgttaaaaat aaaagtcatc 1140
tttcgaggtg acttttagat tgcttccttc agtaccttat gagaaatcaa agtctttggg 1200
ttctggggcg agtattcgcg caagcgagaa agttaaaaga attgacggaa gggcaccacc 1260
aggcgtggag cttgcggctt aatttgactc aacacgggga aactcactag tttaagacaa 1320
gagtaggatt gacagattaa tagctctttc ttgatttctt ggatggtgat gcatggccgt 1380
ttttagttcg tgaatatgat ttgtctggtt aattccgata acgaacgaga tcttaacctg 1440
ctaattagcg gcgagtacac tatattctta tttgaaattg aacataggta actatacatt 1500
tattcagtaa tcaaattagg atatttttat taaaatatcc ttttccctgt tctactaata 1560
atttgttttt tactctattt ctctcttctt ttaagaatgt acttgcttga ttgaaaagct 1620
tcttagagga acattgtgtg tctaacacaa ggaagtttaa ggcaacaaca ggtctgtgat 1680
gtccttagat gaactaggct gcacgcgtgc tacactgata tatataacga gtttttaaaa 1740
atatgcttat atttgtatct ttgcttatat tttgcatact tttcctccgc cgaaaggcgt 1800
aggtaatctt tatcaatata tatcgtgatg gggatagatt attgcaatta ttaatcttga 1860
acgaggaatg cctagtaagc atgattcatc agattgtgct gactacgtcc ctgccctttg 1920
tacacaccgc ccgtcgctcc taccgattga aagatatgat gaattgtttg gacaagaaaa 1980
attgaattat attctttttt tttctggaaa aaccgtaaat cctatctttt aaaggaagga 2040
gaagtcgtaa caaggtttcc gtaggtgaac ctgcggaagg atcatta 2087
<210> 181
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(27)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 181
aatttaatac gactcactat agggagatca agaaagagct atnaatctgt caatcc 56
<210> 182
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 182
tcaagaaaga gctatnaatc tgtcaatcc 29
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 183
gaaatcaaag tctttgggtt ctg 23
<210> 184
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 184
caaagtcttt gggttctgg 19
<210> 185
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 185
tttagattgc ttccttcagt nccttatgag aaatcaaagt ctttgggttc tgg 53
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 186
gaaatcaaag tctttgggtt ctgg 24
<210> 187
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 187
caaagtcttt gggttctg 18
<210> 188
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 188
aaacggccat gcatcaccat ccaagaaatc aagaaagagc tatnaatctg tcaatcctac 60
tcttgtctta aacta 75
<210> 189
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> s意指g或c。
<400> 189
gaguauucgs gcaagcgaga aagu 24
<210> 190
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 190
auucgcgcaa 10
<210> 191
<400> 191
000
<210> 192
<211> 1557
<212> DNA
<213> 间日疟原虫（Plasmodium vivax）
<300>
<308> JQ627153.1
<309> 2012-08-14
<313> (1)..(1557)
<400> 192
caaagattac gccatgcaag tgaaagtata tgcatatttt atatgtagaa actgcgaacg 60
gctcattaaa acagttataa tctacttgac attttttcta taaggataac tacggaaaag 120
ctgtagctaa tacttgcttt agcactcttg attcatttct tgagtgtgta cttgttaagc 180
cttttaagaa aaaagttatt aacttaagga attataacaa agaagcgaca cgtaatggat 240
ccgtccattt ttagtgtgta tcaatcgagt ttctgaccta tcagcttttg atgttagggt 300
attggcctaa catggctatg acgggtaacg gggaattaga gttcgattcc ggagagggag 360
cctgagaaat agctaccaca tctaaggaag gcagcaggcg cgtaaattac ccaattctaa 420
agaagagagg tagtgacaag aaataacaat acaaggccaa tctggctttg taattggaat 480
gatgggaatt taaaaccttc ccaaaactca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg 540
cggtaattcc agctccaata gcgtatatta aaattgttgc agttaaaacg ctcgtagttg 600
aatttcaaag aatcgatatt ttaagcaacg cttctagctt aatccacata actgatactt 660
cgtatcgact ttgtgcgcat tttgctatta tgtgttcttt taattaaaat gattcttttt 720
aaggactttc tttgcttcgg cttggaatcc cttgttactt tgagtaaatt agagtgttca 780
aagcaaacag atatagcatt gcgcgtttga atactacagc atggaataac aaaattgaac 840
aagtcagaat tttgttcttt tttcttattt tggcttagtt acgattaata ggagtagctt 900
gggggcattt gtattcagat gtcagaggtg aaattcttag attttctgga gacaaacaac 960
tgcgaaagca tttgcctaaa atacttccat taatcaagaa cgaaagttaa gggagtgaag 1020
acgatcagat accgtcgtaa tcttaaccat aaactatgcc gactaggctt tggatgaaag 1080
attttaaaat aagaattttc tcttcggagt ttattcttag attgcttcct tcagtgcctt 1140
atgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg cgagtattcg cgcaagcgag aaagttaaaa 1200
gaattgacgg aagggcacca ccaggcgtgg agcttgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1260
aaaactcact agtttaagac aagagtagga ttgacagatt aatagctctt tcttgatttc 1320
ttggatggtg atgcatggcc gtttttagtt cgtgaatatg atttgtctgg ttaattccga 1380
taacgaacga gatcttaacc tgctaattag cggcaaatac gatatattct tacgtgggac 1440
tgaattcggt tgatttgctt actttgaaga aaatattggg atacgtaaca gtttcccttt 1500
cccttttcta cttagttcgc ttttcatact gtttcttttt cgcgtaagaa tgtattt 1557
<210> 193
<211> 2096
<212> DNA
<213> 诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）
<300>
<308> L07560.1
<309> 2008-10-02
<313> (1)..(2096)
<400> 193
aacctggttg atcttgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtga 60
aagtatatgc atattttata tgtagaaact gcgaacggct cattaaaaca gttataatct 120
acttgacatt ttctatataa ggataactac ggaaaagctg tagctaatac ttgctttagc 180
actcttgatt tctttcttga gtgtgtactt gttaagcctt ataagaaaag agttattaac 240
ttaaggaatt ataacaaaga agtaacacgt aatggattct tccattttta gtgtgtatca 300
atcgagtttc tgacctatca gcttttgatg ttagggtatt ggcctaacat ggctatgacg 360
ggtaacgggg aattagagtt cgattccgga gagggagcct gagaaatagc taccacatct 420
aaggaaggca gcaggcgcgt aaattaccca attctaaaga agagaggtag tgacaagaaa 480
taacaataca aggccaatct ggctttgtaa ttggaatgat gggaatttaa aaccttccca 540
aaattcaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg 600
tatattaaaa ttgttgcagt taaaacgctc gtagttgaat ttcaaagaat cgatatttta 660
agcaacgctt ctagctataa atccacataa ctgatgcctc cgcgtatcga ctttgtgcgc 720
attttagcta ttatgtgttc ttttaattaa aatgattctt tttaagattc atctattaaa 780
aattcgcttc ggcataattt ttttgatgat cttgttactt tgagtaaatt agagtgttca 840
aagcaaacag atatagcatt tgtgcgtttg aatactacag catggaataa caaaattgaa 900
caagtcagaa tttttttgtt cttttttctt attttggctt agttacgatt aataggagta 960
gcttgggggc atttgtattc agatgtcaga ggtgaaattc ttagattttc tggagacaaa 1020
caactgcgaa agcatttgcc taaaatactt ccattaatca agaacgaaag ttaagggagt 1080
gaagacgatc agataccgtc gtaatcttaa ccataaacta tgccgactag gctttggatg 1140
aaagatttta aaataagagt ttttcttttc tctccggaga ttagaactct tagattgctt 1200
ccttcagtgc cttatgagaa atcaaagtct ttgggttctg gggcgagtat tcgcgcaagc 1260
gagaaagtta aaagaattga cggaagggca ccaccaggcg tggagcttgc ggcttaattt 1320
gactcaacac gggaaaactc actagtttaa gacaagagta ggattgacag attaatagct 1380
ctttcttgat ttcttggatg gtgatgcatg gccgttttta gttcgtgaat atgatttgtc 1440
tggttaattc cgataacgaa cgagatctta acctgctaat tagcggcaaa tacgatatat 1500
tcttatgtag aattgaatat agtggatttg ttagattttg aagaaaatat tggaattacg 1560
ttaaatgtga ttcctttccc ttttctactt aatttacatt tccatctatt tcttttttgc 1620
gtatgaatgt atttgcttga ttgtaaagct tcttagagga acgatgtgtg tctaacacaa 1680
ggaagtttaa ggcaacaaca ggtctgtgat gtccttagat gaactaggct gcacgcgtgc 1740
tacactgata tgtataacga gttactaaaa ttacgatttt agctgcttgc agtttatttt 1800
cgtacttttc ctccactgaa aagtgtaggt aatctttatc aatacatatc gtgatgggga 1860
tagattattg caattattaa tcttgaacga ggaatgccta gtaagcatga ttcatcagat 1920
tgtgctgact acgtccctgc cctttgtaca caccgcccgt cgctcctacc gattgaaaga 1980
tatgatgaat tgtttggaca agaaaaaatt ggattatatc tttttttttg gaaaaaccgt 2040
aaatcctatc ttttaaagga aggagaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaattc 2096
<210> 194
<211> 2091
<212> DNA
<213> 卵形疟原虫（Plasmodium ovale）
<300>
<308> AB182491.1
<309> 2007-07-24
<313> (1)..(2091)
<400> 194
aacctggttg atcttgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtga 60
aagtatatgc atattttata tgtagaaact gcgaacggct cattaaaaca gttataatct 120
acttgacatt tctacttaca aggataacta cggaaaagct gtagctaata cttgctttaa 180
tacgtttgat tcatttttgt ctcttacgta tgtacttgtt aagcctttaa gagaaaagtt 240
tacaacttaa ggaattataa caaagaagta acacataata agtttacctt atttagtgtg 300
tatcaatcga gtttctgacc tatcagcttt tgatgttagg gtattggcct aacatggcta 360
tgacgggtaa cggggaatta gagttcgatt ccggagaggg agcctgagaa atagctacca 420
catctaagga aggcagcagg cgcgtaaatt acccaattct aaagaagaga ggtagtgaca 480
agaaataaca atacaaggcc atttcatggt tttgtaattg gaatgatggg aatttaaaac 540
cttcccaaaa ttcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc 600
aatagcgtat attaaaattg ttgcagttaa aacgctcgta gttgaatttc aaagaatcaa 660
tattttaagt aatgcttttg gtataagatg cttaggcaat acaacgtatc tgctctttgc 720
attccttatc caaaatgtgt tcttattata aaaaggattc tttttaaaat ctcctttact 780
ttttgtactg gagattttgt tactttgagt aaattagagt gttcaaagca aacagttaaa 840
gcattttact gcgtttgaat actacagcat ggaataacaa aattgaacaa gtcaaaactc 900
tgttcttttt tcttattttg gcttagttac gattaatagg agtagcttgg gggcatttgg 960
attcagatgt cagaggtgaa attcttagat tttctggaga caaacaactg cgaaagcatt 1020
tgcctaaaat acttccatta atcaagaacg aaagttaagg gagtgaagac gatcagatac 1080
cgtcgtaatc ttaaccataa actatgccga ctaggttttg gatgaaagat ttttaaataa 1140
gaaaattcct tttggaaatt tcttagattg cttccttcag taccttatga gaaatcaaag 1200
tctttgggtt ctggggcgag tattcgcgca agcgagaaag ttaaaagaat tgacggaagg 1260
gcaccaccag gcgtggagct tgcggcttaa tttgactcaa cacggggaaa ctcactagtt 1320
taagacaaga gtaggattga cagattaata gctctttctt gatttcttgg atggtgatgc 1380
atggccgttt ttagttcgtg aatatgattt gtctggttaa ttccgataac gaacgagatc 1440
ttaacctgct aattagcggc gaatacgtta tattcctact tgaaattgaa tatagctgaa 1500
tttgcttatt ttgaagaata tattaggata cattatagtg tccttttccc ttttctactt 1560
aattcgctat tcatgctgtt tcttttttgt gtaggaatgt attcgtttga ttgtaaagct 1620
tcttagagga acgatgtgtg tctaacacaa ggaagtttaa ggcaacaaca ggtctgtgat 1680
gtccttagat gaactaggct gcacgcgtgc tacactgata tgtataacga gttactaaaa 1740
atatactttt gtttgagtat ttatactctc tcaaatagta tacttttcct ccgccgaaag 1800
gtgtaggtaa tctttatcag tacatatcgt gatggggata gattattgca attattaatc 1860
ttgaacgagg aatgcctagt aagcatgatt catcagattg tgctgactac gtccctgccc 1920
tttgtacaca ccgcccgtcg ctcctaccga ttgaaagata tgatgaattg tttggacaag 1980
aaaagggaaa attatatttt cttttttctg gaaaaaccgt aaatcctatc ttttaaagga 2040
aggagaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt a 2091
<210> 195
<211> 2152
<212> DNA
<213> 三日疟原虫（Plasmodium malariae）
<300>
<308> AF487999.1
<309> 2002-05-06
<313> (1)..(2152)
<400> 195
aacctggttg atcttgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtga 60
aagtatatgc atattttata tgtagaaact gcgaacggct cattaaaaca gttatagtct 120
acttgacatt ttttttataa ggataactac ggaaaagctg tagctaatac ttgctttaat 180
actcttaatt ctttatgttt tttgagtatg tatttgttaa gccttataag agaaaagtat 240
attaacttaa ggaatataac aaagaagtaa cacataataa atttcgattt atttagtgtg 300
tatcaatcga gtttctgacc tatcagcttt tgatgttagg gtattggcct aacatggcta 360
tgacgggtaa cggggaatta gagttcgatt ccggagaggg agcctgagaa atagctacca 420
catctaagga aggcagcagg cgcgtaaatt acccaattct aaagaagaga ggtagtgaca 480
agaaataaca atgcaaggcc aaattttggt tttgcaattg gaatgatggg aatttaaaac 540
cttcccagaa ggcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc 600
aatagcgtat attaaaattg ttgcagttaa aacgctcgta gttgaatttc aaggaatcaa 660
tattttaagt aatgctttgt atatttataa caaagttgta cattaagaat aaacgccaag 720
cgttatattt tttctgttac attttgtttt attaatatat atatgcgttc ttattataaa 780
aatgattctt tttaaaattc ttttgtataa ttttttatgc atgggaattt tgttactttg 840
agtaaattag agtgttcaaa gcaaacagtt aaaacagttt ctgtgtttga atactacagc 900
atggaataac aaaattgaac aagtcagaat tttgttcttt tttcttattt tggcttagtt 960
acgattaata ggagtagctt gggggcattt gtattcagat gtcagaggtg aaattcttag 1020
attttctgga gacaagcaac tgcgaaagca tttgcctaaa atacttccat taatcaagaa 1080
cgaaagttaa gggagtgaag acgatcagat accgtcgtaa tcttaaccat aaactatgcc 1140
gactaggtgt tggatgatag agtaaaaaat aaaagagaca ttcatatgag tgtttctttt 1200
agatagcttc cttcagtacc ttatgagaaa tcaaagtctt tgggttctgg ggcgagtatt 1260
cgcgcaagcg agaaagttaa aagaattgac ggaagggcac caccaggcgt ggagcttgcg 1320
gcttaatttg actcaacacg gggaaactca ctagtttaag acaagagtag gattgacaga 1380
ttaatagctc tttcttgatt tcttggatgg tgatgcatgg ccgtttttag ttcgtgaata 1440
tgatttgtct ggttaattcc gataacgaac gagatcttaa cctgctaatt agcggtaaat 1500
acactatatt cttaagtgaa attagaatat agataaattg tgctaatttt gattaaaata 1560
ttagaatgtt ttttttaata aaaacgttct tttccctttt tttcttaatt atgcatattt 1620
attctttttc ttttttcgca taagaatgta tttgcttaat tgtaaagctt cttagaggaa 1680
cgatgtgtgt ctaacacaag gaagtttaag gcaacaacag gtctgtgatg tccttagatg 1740
aactaggctg cacgcgtgct acactgatat gtataacgag tatttaaaaa tatatatctt 1800
gttatgttat atgtatttct atatgtatgc atgcaaagaa tatatagttt tcctccactg 1860
aaaagtgtag gtaatctttt tcaatacata tcgtgatggg gatagattat tgcaattatt 1920
aatcttgaac gaggaatgcc tagtaagcat gattcatcag attgtgctga ctacgtccct 1980
gccctttgta cacaccgccc gtcgctccta ccgattgaaa gatatgatga attgtttgga 2040
caaggaaaaa gggttttttt cttttttctg gaaaaatcgt aaatcctatc ttttaaagga 2100
aggagaaagt cgtaacaagg tttccgtcgg tgaacctgcg gaaggatcat ta 2152
<210> 196
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> y意指t/u或c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n意指a或g或c或t/u、未知或其它。
<400> 196
guauucagau gucagaggug aaauucuuag auuyucugga gacnagca 48
<210> 197
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 197
guauucagau gucagaggug aaauucuuag auuuucugga gac 43

Claims (48)

1.一种用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的方法，所述方法包括：
(1)使样品与用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物接触，所述样品疑似含有疟原虫核酸，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物
(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包括SEQ ID NO:163的序列；或者
(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包括SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列的长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包括SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列；
(2)进行体外核酸扩增反应，其中所述样品中存在的任何疟原虫属靶核酸被用作用于生成扩增产物的模板；以及
(3)检测所述扩增产物的存在或不存在，由此指示所述样品中疟原虫靶核酸的存在或不存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(i)的所述扩增低聚物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中(a)(i)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:21、23-25、32、33、35、54和55组成的组，
或者其中(a)(i)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:164的序列中、包括SEQ ID NO:165的序列并且任选地选自由SEQ ID NO:21、23-25、32、33和35组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(ii)的所述扩增低聚物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ ID NO:167的序列并且任选地选自由SEQ ID NO:28-31、34、40、41和49-51组成的组。
6.根据权利要求4所述的方法，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ ID NO:168的序列并且任选地选自由SEQ ID NO:38、39、43、44和53组成的组。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:80-82和85-100组成的组，
或者其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中、包括SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列并且任选地选自(i)由SEQ ID NO:81、82、85、87-90、94和96-98组成的组或(ii)由SEQ ID NO:80、82、85和87-100组成的组。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物，任选地其中所述启动子序列是T7启动子序列，任选地其中(b)的所述扩增低聚物包括选自由SEQ IDNO:57-59和62-77组成的组的序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中(a)和(b)的所述靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:82；
(B)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82；
(C)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:82；
(D)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:89；
(E)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:89；
(F)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:89；
(G)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:89；
(H)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:92；
(I)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:92；
(J)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:94；
(K)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:94；
(L)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:94；
(M)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:95；
(N)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:95；或者
(O)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:95。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(ii)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物，任选地其中
如(a)(ii)中的所述第一扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列，任选地其中所述第一扩增低聚物靶杂交序列是SEQ ID NO:34；并且
如(a)(ii)中的所述第二扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:168的序列的靶杂交序列，任选地其中所述第二扩增低聚物靶杂交序列是SEQ ID NO:53。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(i)中的扩增低聚物和如(a)(ii)中的扩增低聚物，任选地其中
如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包括SEQ IDNO:165的序列的靶杂交序列，任选地其中如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:21的靶杂交序列；并且
如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:167的序列，任选地其中如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:34的靶杂交序列。
12.根据权利要求1、10和11中任一项所述的方法，其中所述至少两种扩增低聚物包括(b)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物，任选地其中(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:170的序列中并且包括SEQ IDNO:171或SEQ ID NO:172的序列的靶杂交序列，
任选地其中如(b)中的所述第一扩增低聚物包括SEQ ID NO:94的靶杂交序列，并且如(b)中的所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:95的靶杂交序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(1)之前从所述样品中的其它组分中纯化所述靶核酸，任选地其中纯化步骤包括使所述样品与至少一种捕获探针低聚物接触，所述至少一种捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列的长度为至多约30个连续核苷酸并且包括选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种检测探针低聚物接触，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成在借此确定所述扩增产物的存在或不存在由此指示所述样品中疟原虫的存在或不存在的条件下与所述扩增产物特异性杂交的靶杂交序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物，
任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括SEQ IDNO:174或SEQ ID NO:175的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体，任选地其中
(a)所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:174或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:148-155和159组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体，或者
(b)所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:175或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括选自由SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物，其中
(A)所述第一检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；并且
(B)所述第二检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述第二检测探针低聚物包括选自由SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152组成的组的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(2)处的所述扩增反应是等温扩增反应，任选地其中所述扩增反应是转录介导的扩增(TMA)反应，并且任选地其中所述扩增反应是实时扩增反应。
20.一种用于确定样品中疟原虫的存在或不存在的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物
(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包括SEQ ID NO:163的序列；或者
(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包括SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列的长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包括SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列。
21.根据权利要求20所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(i)的所述扩增低聚物。
22.根据权利要求21所述的低聚物组合，其中(a)(i)的所述靶杂交序列选自由SEQ IDNO:21、23-25、32、33、35、54和55组成的组，
或者其中(a)(i)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:164的序列中、包括SEQ ID NO:165的序列并且任选地选自由SEQ ID NO:21、23-25、32、33和35组成的组。
23.根据权利要求20所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括(a)(ii)的所述扩增低聚物。
24.根据权利要求23所述的低聚物组合，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ IDNO:167的序列并且任选地选自由SEQ ID NO:28-31、34、40、41和49-51组成的组。
25.根据权利要求23所述的低聚物组合，其中(a)(ii)的所述靶杂交序列包括SEQ IDNO:168的序列并且任选地选自由SEQ ID NO:38、39、43、44和53组成的组。
26.根据权利要求20到25中任一项所述的低聚物组合，其中(b)的所述靶杂交序列选自由SEQ ID NO:80-82和85-100组成的组，
或者其中(b)的所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:170的序列中、包括SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的序列并且任选地选自(i)由SEQ ID NO:81、82、85、87-90、94和96-98组成的组或(ii)由SEQ ID NO:80、82、85和87-100组成的组。
27.根据前述权利要求中任一项所述的低聚物组合，其中(b)的所述扩增低聚物是进一步包括位于(b)的所述靶杂交序列的5'位的启动子序列的启动子引物或启动子提供物，任选地其中所述启动子序列是T7启动子序列，任选地其中(b)的所述扩增低聚物包括选自由SEQ ID NO:57-59和62-77组成的组的序列。
28.根据权利要求20所述的低聚物组合，其中(a)和(b)的所述靶杂交序列分别是
(A)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:82；
(B)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82；
(C)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:82；
(D)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:89；
(E)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:89；
(F)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:89；
(G)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:89；
(H)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:92；
(I)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:92；
(J)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:94；
(K)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:94；
(L)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:94；
(M)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:95；
(N)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:95；或者
(O)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:95。
29.根据权利要求20所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(ii)中的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物，任选地其中
如(a)(ii)中的所述第一扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:167的序列的靶杂交序列，任选地其中所述第一扩增低聚物靶杂交序列是SEQ ID NO:34；并且
如(a)(ii)中的所述第二扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:168的序列的靶杂交序列，任选地其中所述第二扩增低聚物靶杂交序列是SEQ ID NO:53。
30.根据权利要求20所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括如(a)(i)中的扩增低聚物和如(a)(ii)中的扩增低聚物，任选地其中
如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:164的序列中并且包括SEQ IDNO:165的序列的靶杂交序列，任选地其中如(a)(i)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:21的靶杂交序列；并且
如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:167的序列，任选地其中如(a)(ii)中的所述扩增低聚物包括SEQ ID NO:34的靶杂交序列。
31.根据权利要求20、29和30中任一项所述的低聚物组合，其中所述至少两种扩增低聚物包括(b)的第一扩增低聚物和第二扩增低聚物，任选地其中(b)的所述第一扩增低聚物和所述第二扩增低聚物中的每种扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:170中并且包括SEQ IDNO:171或SEQ ID NO:172的序列的靶杂交序列，
任选地其中如(b)中的所述第一扩增低聚物包括SEQ ID NO:94的靶杂交序列，并且如(b)中的所述第二扩增低聚物包括SEQ ID NO:95的靶杂交序列。
32.根据前述权利要求中任一项所述的低聚物组合，其进一步包括至少一种捕获探针低聚物，所述至少一种捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列的长度为至多约30个连续核苷酸并且包括选自由SEQ IDNO:11-15、17、19和20组成的组的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
33.根据前述权利要求中任一项所述的低聚物组合，其进一步包括至少一种检测探针低聚物，所述至少一种检测探针低聚物包括被配置成与能够由所述至少两种扩增低聚物扩增的疟原虫扩增子特异性杂交的靶杂交序列。
34.根据权利要求33所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸，并且(i)包含在SEQ ID NO:196的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物，
任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、145、147-157和159-161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
35.根据权利要求34所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括选自由SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:175组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物，任选地其中
(a)所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:174的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ IDNO:148-155和159组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物，或者
(b)所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ IDNO:147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
36.根据权利要求34所述的低聚物组合，其中所述检测探针低聚物靶杂交序列(ii)包括选自由SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178组成的组的序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物，任选地其中所述检测探针低聚物靶杂交序列选自由SEQ ID NO:131、132、135、140、147、156、157、160和161组成的组，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
37.根据权利要求34所述的低聚物组合，其中所述至少两种检测探针低聚物包括第一检测探针低聚物和第二检测探针低聚物，其中
(A)所述第一检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括SEQ ID NO:175的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述第一检测探针低聚物包括SEQ ID NO:157的靶杂交序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体；并且
(B)所述第二检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列(i)包含在SEQ ID NO:197的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体中，并且(ii)包括SEQ ID NO:176的序列或其补体或其DNA等同物或者DNA/RNA嵌合体，任选地其中所述第二检测探针低聚物包括选自由SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152组成的组的靶杂交序列，包含其补体、DNA等同物和DNA/RNA等同物。
38.一种用于特异性检测样品中的疟原虫靶核酸的检测探针低聚物，所述检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列的长度为约13个到约40个核苷酸并且被配置成与包含在能够由包括第一疟原虫属特异性扩增低聚物和第二疟原虫属特异性扩增低聚物的低聚物组合扩增的疟原虫靶区域内的靶序列特异性杂交，其中
(a)所述第一扩增低聚物包括靶杂交序列：(i)所述靶杂交序列的长度为约14个到约20个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:162的序列中并且包括SEQ ID NO:163的序列；或者(ii)所述靶杂交序列的长度为约14个到约25个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:166的序列中并且包括SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168的序列；并且
(b)所述第二扩增低聚物包括长度为约15个到约33个连续核苷酸、包含在SEQ ID NO:169中并且包括SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173的序列的靶杂交序列。
39.一种用于检测样品中的疟原虫靶核酸的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括至少两种根据权利要求38所述的检测探针低聚物。
40.一种用于从样品中特异性分离疟原虫核酸的捕获探针低聚物，所述捕获探针低聚物包括与同固定探针结合的序列或部分共价连接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列的长度为至多约30个连续核苷酸并且包括选自由SEQ ID NO:11-15、17、19和20组成的组的序列，包含其DNA等同物和DNA/RNA嵌合体。
41.一种用于从样品中特异性分离疟原虫核酸的至少两种低聚物的组合，其中所述低聚物组合包括至少两种根据权利要求40所述的捕获探针低聚物。
42.一种试剂盒，其包括根据权利要求20到37、39和41中任一项所述的至少两种低聚物的组合。
43.一种反应混合物，其包括根据权利要求20到37、39和41中任一项所述的至少两种低聚物的组合。
44.一种用于特异性检测样品中的疟原虫核酸的方法，所述方法包括：
(1)使样品与用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物接触，所述样品疑似含有疟原虫核酸，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:187的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:188中并且包括SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列；
(2)进行体外核酸扩增反应，其中所述样品中存在的任何疟原虫属靶核酸被用作用于生成扩增产物的模板；以及
(3)检测所述扩增产物的存在或不存在，由此指示所述样品中疟原虫靶核酸的存在或不存在。
45.一种用于确定样品中疟原虫的存在或不存在的至少两种低聚物的组合，所述低聚物组合包括用于扩增疟原虫靶核酸的靶区域的至少两种低聚物，其中所述至少两种扩增低聚物包括：
(a)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:187的序列；以及
(b)包括靶杂交序列的扩增低聚物，所述靶杂交序列包含在SEQ ID NO:188中并且包括SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:182的序列。
46.一种用于特异性检测样品中的疟原虫靶核酸的检测探针低聚物，所述检测探针低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列的长度为至少约13个核苷酸并且被配置成与包含在能够由包括第一疟原虫属特异性扩增低聚物和第二疟原虫属特异性扩增低聚物的低聚物组合扩增的疟原虫靶区域内的靶序列特异性杂交，其中
(a)所述第一扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:185的序列中并且包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:187的序列的靶杂交序列；并且
(b)所述第二扩增低聚物包括包含在SEQ ID NO:188中并且包括SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:84或SEQ ID NO:182的序列的靶杂交序列。
47.一种试剂盒，其包括根据权利要求45所述的至少两种低聚物的组合。
48.一种反应混合物，其包括根据权利要求45所述的至少两种低聚物的组合。
CN201980091765.1A 2018-12-20 2019-12-20 用于检测疟原虫核酸的组合物和方法 Pending CN113412335A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862782945P 2018-12-20 2018-12-20
US62/782,945 2018-12-20
PCT/US2019/067777 WO2020132408A2 (en) 2018-12-20 2019-12-20 Compositions and methods for detecting plasmodium species nucleic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113412335A true CN113412335A (zh) 2021-09-17

Family

ID=69182738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980091765.1A Pending CN113412335A (zh) 2018-12-20 2019-12-20 用于检测疟原虫核酸的组合物和方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220243285A1 (zh)
EP (1) EP3899053B1 (zh)
JP (1) JP2022515774A (zh)
KR (1) KR20210108426A (zh)
CN (1) CN113412335A (zh)
AR (1) AR115670A1 (zh)
AU (1) AU2019405977A1 (zh)
CA (1) CA3123451A1 (zh)
PT (1) PT3899053T (zh)
TW (1) TW202030333A (zh)
UY (1) UY38519A (zh)
WO (1) WO2020132408A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117947199A (zh) * 2024-03-26 2024-04-30 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023079032A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detection of malaria

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110124723A1 (en) * 2007-12-11 2011-05-26 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Compounds for Preventing and Treating Plasmodium Infections
CN102220419A (zh) * 2011-04-26 2011-10-19 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种疟疾通用型及其分型的巢式pcr检测及荧光pcr检测试剂盒
CN104284986A (zh) * 2012-04-25 2015-01-14 中国医学科学院基础医学研究所 用于高通量检测疟原虫的方法、组合物和试剂盒
CN104561269A (zh) * 2014-11-26 2015-04-29 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 一种快速灵敏的间日疟原虫检测方法
CN104673901A (zh) * 2015-02-06 2015-06-03 中国医学科学院基础医学研究所 用于检测靶核酸的用途和试剂盒

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2422956A1 (fr) 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4786600A (en) 1984-05-25 1988-11-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autocatalytic replication of recombinant RNA
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
JP2641880B2 (ja) 1986-08-11 1997-08-20 シスカ・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド 核酸プローブアッセイ法および組成物
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5283174A (en) 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
ATE124143T1 (de) 1987-09-21 1995-07-15 Gen Probe Inc Homogener abschirmungstest.
US5639604A (en) 1987-09-21 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Homogeneous protection assay
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5185439A (en) 1987-10-05 1993-02-09 Gen-Probe Incorporated Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5118801A (en) 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
US5656207A (en) 1989-06-24 1997-08-12 Gen Probe Incorporated Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques
US5516663A (en) 1990-01-26 1996-05-14 Abbott Laboratories Ligase chain reaction with endonuclease IV correction and contamination control
US5427930A (en) 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
US5849481A (en) 1990-07-27 1998-12-15 Chiron Corporation Nucleic acid hybridization assays employing large comb-type branched polynucleotides
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
DK1695979T3 (da) 1991-12-24 2011-10-10 Isis Pharmaceuticals Inc Gappede modificerede oligonukleotider
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
KR100249110B1 (ko) 1992-05-06 2000-04-01 다니엘 엘. 캐시앙 핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트
US5614402A (en) 1992-12-07 1997-03-25 Third Wave Technologies, Inc. 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase
US5422252A (en) 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
WO1995003430A1 (en) 1993-07-23 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Methods for enhancing nucleic acid amplification
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US5547861A (en) 1994-04-18 1996-08-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acid amplification
WO1995032305A1 (en) 1994-05-19 1995-11-30 Dako A/S Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis
DE69535240T2 (de) 1994-10-28 2007-06-06 Gen-Probe Inc., San Diego Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen
US6706471B1 (en) 1996-01-24 2004-03-16 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
WO1997039008A1 (en) 1996-04-12 1997-10-23 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detection probes, kits and assays
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
EP0975807B1 (en) 1997-05-02 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6180340B1 (en) 1997-10-31 2001-01-30 Gen-Probe Incorporated Extended dynamic range assays
US6949367B1 (en) 1998-04-03 2005-09-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
AU762728B2 (en) 1998-07-02 2003-07-03 Gen-Probe Incorporated Molecular torches
DK1778867T3 (da) 2004-07-01 2010-08-02 Gen Probe Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til detektering af nucleinsyrer i en biologisk prøve
EP1970454B1 (en) 2004-08-27 2012-09-19 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
AU2006218794A1 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods of detecting an analyte by using a nucleic acid hybridization switch probe
CA2658105C (en) 2006-08-01 2016-07-05 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
US10093989B2 (en) 2014-10-20 2018-10-09 Gen-Probe Incorporated Red blood cell lysis solution
DE202017007129U1 (de) * 2016-04-27 2019-08-29 Gen-Probe Incorporated Lysereagenz für Blutzellen
WO2018226798A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110124723A1 (en) * 2007-12-11 2011-05-26 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Compounds for Preventing and Treating Plasmodium Infections
CN102220419A (zh) * 2011-04-26 2011-10-19 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种疟疾通用型及其分型的巢式pcr检测及荧光pcr检测试剂盒
CN104284986A (zh) * 2012-04-25 2015-01-14 中国医学科学院基础医学研究所 用于高通量检测疟原虫的方法、组合物和试剂盒
CN104561269A (zh) * 2014-11-26 2015-04-29 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 一种快速灵敏的间日疟原虫检测方法
CN104673901A (zh) * 2015-02-06 2015-06-03 中国医学科学院基础医学研究所 用于检测靶核酸的用途和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
鲁少平等: "运用实时荧光RT-PCR方法检测疟原虫的研究", 实用预防医学, vol. 22, no. 10, pages 1171 - 1173 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117947199A (zh) * 2024-03-26 2024-04-30 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
AR115670A1 (es) 2021-02-10
EP3899053A2 (en) 2021-10-27
EP3899053B1 (en) 2024-01-10
JP2022515774A (ja) 2022-02-22
WO2020132408A2 (en) 2020-06-25
TW202030333A (zh) 2020-08-16
CA3123451A1 (en) 2020-06-25
KR20210108426A (ko) 2021-09-02
PT3899053T (pt) 2024-04-10
UY38519A (es) 2020-06-30
WO2020132408A3 (en) 2020-07-23
US20220243285A1 (en) 2022-08-04
AU2019405977A1 (en) 2021-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021277704B2 (en) Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
US20230227922A1 (en) Detecting babesia species nucleic acid in a sample
CN113412335A (zh) 用于检测疟原虫核酸的组合物和方法
CA2972475C (en) Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
AU2017205399C1 (en) Methods and compositions for detecting Candida species
CN114096683A (zh) 用于确定样品中阴道毛滴虫的存在的寡核苷酸
OA20793A (en) Compositions and methods for detecting plasmodium species nucleic acid.
US20130065222A1 (en) Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of murine leukemia virus-related virus

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination