CN117947199A - 一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒，本发明根据恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟特异性核酸序列设计4条特异性上游环引物，采用环介导等温扩增体系，完成PCR扩增；同时为了解决免疫胶体金无法通过检测富组氨酸蛋白‑2（HRP2）或者乳酸脱氢酶（pLDH）进行分型和传统LAMP依靠是否有副产物沉淀来判断病原体的有无，亦无法进行虫种鉴别的问题，本发明结合胶体金层析和LAMP技术，将检测4种疟原虫特异性核酸序列转换成检测标记在特异性引物上的荧光素，从而实现高灵敏度的可视化疟原虫鉴别分型。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒。
背景技术
疟疾是人体感染疟原虫所致的蚊媒传播性传染病，主要流行于热带和亚热带地区，典型的临床表现为周期性寒战、发热、大汗等症状，伴有肝脾肿大和贫血等体征。在传播媒介长期存在的情况下，因输入病例造成本地再度流行的风险依然存在。因此输入性疟疾的防治依然是疾病预防控制的重点工作。
寄生于人体的疟原虫主要有4种，即恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，pf）、间日疟原虫（Plasmodium vivax，pv）、三日疟原虫（Plasmodium malariae，pm）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale，po）。不同虫种引起的疾病严重程度和临床症状不统一。其中恶性疟最为严重，若不及时治疗，将会发展成重症疟疾，造成病例死亡；间日疟和卵形疟则常有复发。对不同疟原虫的治疗也有所差异，对恶性疟的治疗，轻症采取以青蒿素类衍生物为基础的复方或联用口服药物进行治疗，重症用蒿甲醚、青蒿琥酯、磷酸咯萘啶等注射治疗；对间日疟的治疗采用磷酸氯喹和伯氨喹组合的8日疗法，其中磷酸氯喹可用青蒿素类衍生物口服制剂替代。
目前鉴别疟原虫的方法学有厚薄血膜染色显微镜检查和荧光PCR方法。传统的显微镜检测特异性高，能区分虫种且分辨疟原虫发育阶段，但密度低时易漏检，在制备血涂片和镜检时需要经验丰富的技术员，整个过程费时费力；荧光PCR虽然灵敏度高，可做多重测试区分虫种，但需要专业技术人员进行操作，同时需要配备专业的PCR实验室和昂贵的实时荧光定量PCR分析仪，且耗时较长，约需要2.5小时才能完成样本的处理和检测，不能满足基层检测、疾控筛查以及海关、边境等相关部门的需求。环介导等温扩增 (loop-mediatedisothermal amplification，LAMP) 是一种较新的核酸扩增技术，在链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)作用下，可以在60~65℃温度范围内在15-60分钟内完成扩增，产生焦磷酸镁沉淀肉眼观察或浊度仪检测即可，适用于病原体快速检测，但是该种检测方式为单管测试无法进行多重测试，不适用于疟原虫分型。
市场上常用的疟疾快速诊断采用免疫胶体金技术，虽简便易操作，适用性广，但检测靶标为疟原虫的富组氨酸蛋白-2（HRP2）或者乳酸脱氢酶（pLDH），无法实现虫种区分，采用抗原抗体免疫结合反应原理，其灵敏度和特异性要低于核酸检测方法，亦无法满足疟原虫虫种的准确快速分型检测。
因此，开发一种能区分不同疟原虫虫种、且具有较高灵敏度和特异性的核酸快速检测产品，将有助于提高基层医疗机构对输入性疟疾病例诊疗的精准性及高效性，对输入性疟疾本地再传播的防控有重大意义。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒。基于LAMP技术和免疫层析技术相结合、提供一种能快速鉴别恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟4种疟原虫的方法及试剂盒。
本发明融合LAMP技术以及胶体金免疫层析技术，将检测4种疟原虫特异性核酸序列转换成检测标记在特异性引物上的荧光素，从而实现高灵敏度的可视化疟原虫鉴别分型，使得该检测试剂具有核酸PCR灵敏度和特异性的同时，亦可解决场地和专业技术受限的问题。同时在设计LAMP引物时，采用6条引物组合，即外侧引物F3/B3、内侧引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB，其中以LoopF为特异性识别引物，增加检测灵敏度和特异性。
本发明提供的技术方案具体如下：
<第一方面>
一种用于区分疟原虫虫种的引物组合，所述疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫中的至少一种，所述引物组合包括：
疟原虫通用外侧引物：
F3: 5’-CGGAAACCTTGTTACGAC-3’，如SEQ ID No.1所示；
B3: 5’-GCAATTATTAATCTTGAACGAGGA-3’，如SEQ ID No.2所示；
疟原虫通用内侧引物：
FIP: 5’-TTGAAAGATATGATGAATTG-TTCCTTTAAAAGATAGGATTTAC-3’，如SEQ ID No.3所示；
BIP: 5’- CGGTAGGAGCGACGGGC-GCCTAGTAAGCATGATTC-3’，如SEQ ID No.4所示；
疟原虫通用下游环引物：
LB: 5’-AAGGGCAGGGACGTAGTCAGC-3’，如SEQ ID No.5所示；
恶性疟原虫特异性上游环引物：
pf-LF: 5’-GAAAAATTGAATTATATTCTTTTT-3’，如SEQ ID No.6所示；
间日疟原虫特异性上游环引物：
pv-LF: 5’-GAAGGGGGATTATATCTCCTTT-3’，如SEQ ID No.7所示；
卵形疟原虫特异性上游环引物：
po-LF: 5’-CCAGAAAAAAGAAAATATAATTTTCCCTTT-3’，如SEQ ID No.8所示；
三日疟原虫特异性上游环引物：
pm-LF: 5’-AAAAAGGGTTTTTATTCTTTTTTC-3’，如SEQ ID No.9所示。
所述LB的5’端使用生物素标记修饰。
所述pf-LF的5’端、pv-LF的5’端、po-LF的5’端、pm-LF的5’端均使用荧光素标记物修饰；
其中，pf-LF的5’端的荧光素标记物、pv-LF的5’端荧光素标记物、po-LF的5’端荧光素标记物、pm-LF的5’端荧光素标记物之间均不同；
所述荧光素标记物选自FITC、CY3、CY5、地高辛中的其中一种。
优选的、所述LB的5’端使用生物素标记修饰；pf-LF的5’端使用FITC标记修饰；pv-LF的5’端使用CY3标记修饰；po-LF的5’端使用CY5标记修饰；pm-LF的5’端使用地高辛标记修饰。
<第二方面>
一种用于区分疟原虫种的反应体系，所述反应体系包括如上所述的引物组合。
所述反应体系还包括扩增反应液、硫酸镁、Bst DNA Polymerase、dH2O、密封液。
扩增反应液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、1%Triton X-100、dNTPs。
所述引物组合中，F3的浓度为4~20µmol/L、B3的浓度为4~20µmol/L、FIP的浓度为1~5µmol/L、BIP的浓度为1~5µmol/L、LB的浓度为2~10µmol/L、pf-LF的浓度为2~10µmol/L；pv-LF的浓度为2~10µmol/L；po-LF的浓度为2~10µmol/L；pm-LF的浓度为2~10µmol/L。
<第三方面>
本发明还提供一种用于区分疟原虫虫种的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组合或反应体系。
所述试剂盒还包括试纸条。
所述试纸条包括底板；底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、NC膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间，金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于NC膜的一端，吸水纸的一端覆盖于NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线T线和质控线C线。
所述样品垫的制备方法包括如下步骤：
将基材在样本垫处理液中浸泡20-30min，干燥制得所述样品垫；其中样本垫处理液包括20~200 mM Tris、0.5~2% w/v BSA、0.1~2% v/v Tween-20，样本垫处理液pH 7.4~9.0；
金结合垫上包含标记有胶体金的链霉亲和素和标记有兔IgG的胶体金；标记有胶体金的链霉亲和素可以结合扩增产物中生物素标记的下游环引物，标记有兔IgG的胶体金用于层析质控；
所述质控线C线上喷有C线溶液；所述C线溶液包括能捕获兔IgG的羊抗兔；
所述检测线T线有四条，每条检测线T线上包被有一个抗荧光素单克隆抗体，各检测线T线上包被的抗荧光素单克隆抗体之间均不相同；
所述抗荧光素单克隆抗体选自抗FITC单克隆抗体、抗CY3单克隆抗体、抗CY5单克隆抗体、抗地高辛单克隆抗体。
当检测线T线包被有抗FITC单克隆抗体时，能够捕获5’端修饰有FITC的疟原虫特异性上游环引物；
当检测线T线包被有抗CY3单克隆抗体时，能够捕获5’端修饰有CY3的疟原虫特异性上游环引物；
当检测线T线包被有抗CY5单克隆抗体时，能够捕获5’端修饰有CY5的疟原虫特异性上游环引物；
当检测线T线包被有抗地高辛单克隆抗体时，能够捕获5’端修饰有地高辛的疟原虫特异性上游环引物。
作为本发明的一个实施方式：pf-LF的5’端使用FITC标记修饰；pv-LF的5’端使用CY3标记修饰；po-LF的5’端使用CY5标记修饰；pm-LF的5’端使用地高辛标记修饰；
检测线T线包括检测线T 1、检测线T 2、检测线T 3、检测线T4；其中，
检测线T1包被有抗FITC单克隆抗体，能够捕获恶性疟原虫特异性上游环引物（pf-LF）上的FITC；
检测线T2包被有抗CY3单克隆抗体时，能够捕获间日疟原虫特异性上游环引物（pv-LF）上的CY3；
检测线T3包被有抗CY5单克隆抗体时，能够捕获卵形疟原虫特异性上游环引物（po-LF）上的CY5；
检测线T4包被有抗地高辛单克隆抗体时，能够捕获三日疟原虫特异性上游环引物（pm-LF）上的地高辛。
检测线T1、检测线T2、检测线T3、检测线T4上的各抗荧光素单克隆抗体的荧光素标记物与恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫相对应。
<第四方面>
本发明还提供一种非疾病诊断的检测疟原虫虫种的方法，包括如下步骤：
S1、提取待测样本核酸；
S2、环介导等温基因扩增反应，反应体系包括引物混合液；
所述引物混合液包括如上所述的引物组合；
S3、加入步骤S1的待测样本核酸模板，60~65℃恒温容器中反应20-30min；
S4、扩增反应结束后，将试纸条置于扩增管中，观察结果。
作为本发明的一个实施方式，所述非疾病诊断的区分疟原虫虫种的方法，包括如下步骤：
S1、提取待测样本核酸
S2、环介导等温基因扩增反应，反应体系包括：
其中，扩增反应液包括Tris-HCl，(NH4)2SO4，KCl，MgSO4，Triton X-100，dNTP；
所述引物混合液包括如上所述的引物组合：
S3、加入步骤S1的5μL待测样本核酸模板，总反应体积50uL，60~65℃恒温容器中反应20-30min；
S4、扩增反应结束后，将试纸条置于扩增管中，5~15min后观察结果。
所述试纸条包括底板，底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、NC膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于NC膜的一端，吸水纸的一端覆盖于NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线T线和质控线C线。
所述样品垫的制备方法包括如下步骤：将基材在样本垫处理液中浸泡20-30min，干燥制得所述样品垫；其中样本垫处理液包括20~200mM Tris、0.5~2% w/v BSA、0.1~2% v/v Tween-20，样本垫处理液pH 7.4~9.0；
所述金结合垫上包含标记有胶体金的链霉亲和素和标记有兔IgG的胶体金；
所述质控线C线上喷有C线溶液；所述C线溶液包括能捕获兔IgG的羊抗兔；
所述检测线T线有四条，每条检测线T线上包被有一个抗荧光素单克隆抗体，各检测线T线上包被的抗荧光素单克隆抗体之间均不相同；
所述抗荧光素单克隆抗体包括抗FITC单克隆抗体、抗CY3单克隆抗体、抗CY5单克隆抗体、抗地高辛单克隆抗体。
当有目标疟原虫的核酸时，LAMP反应启动，形成有生物素和荧光素标记的杂交链，从而可以被胶体金检测试纸条检出；
本发明根据恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟特异性核酸序列设计4条特异性引物，利用环介导等温扩增检测体系，在60~65℃，等温扩增15~30分钟，完成PCR扩增；同时为了解决免疫胶体金无法通过检测富组氨酸蛋白-2（HRP2）或者乳酸脱氢酶（pLDH）进行分型和传统LAMP依靠是否有副产物沉淀来判断病原体的有无，亦无法进行虫种鉴别的问题，本发明结合胶体金层析和LAMP技术，将检测四种疟原虫特异性核酸序列转换成检测标记在特异性引物上的荧光素，从而实现高灵敏度的可视化疟原虫鉴别分型。
在设计LAMP引物时，针对不同虫种的特异性核酸引物上游环引物的5’端分别标记FITC、CY3、CY5、地高辛，同时下游环引物的5’端均标记biotin，基于胶体金免疫层析技术，在检测线T1、检测线T2、检测线T3、检测线T4上分别包被特异性较高的抗FITC、CY3、CY5、地高辛单克隆抗体，金结合垫含标记有胶体金的链霉亲和素和标记有兔IgG的胶体金。将试纸条放置扩增产物中，扩增产物的biotin与胶体金标记的链霉亲和素结合，随层析作用扩增产物被包被在T线的荧光素单克隆抗体捕获，根据检测线T1、检测线T2、检测线T3、检测线T4是否显示红色条带，检测扩增产物中是否含有恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟的特异性核酸片段，从而可以快速地完成虫种鉴定工作。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明关键在于，采用了LAMP恒温扩增和胶体金免疫层析相结合技术手段，可以简化荧光PCR反应过程，降低对实验场地的要求，同时将胶体金检测疟疾通用型靶蛋白转化为检测标记有不同荧光素或地高辛的四种疟原虫特异性引物，实现可视化的疟原虫分型鉴别。
2.采用LAMP恒温扩增的方法，在保证核酸PCR检测灵敏度和特异性的同时大大缩短了荧光PCR反应的时间，由原来的约2小时缩短至30min以内；核酸扩增不需高温退火循环的温度控制，在60~65℃的恒温条件下即可完成，降低对高精密度仪器的依赖。
3.LAMP恒温扩增时采用6条引物组合，即F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB，其中以LoopF为特异性识别引物，与常规LAMP恒温扩增的4条引物组合即F3、B3、FIP、BIP相比，增加检测灵敏度和特异性。
4.将检测不同疟原虫靶基因转换为检测目的基因标记的不同荧光素，利用抗原抗体特异性结合免疫原理和胶体金层析，检测靶标被包被在NC膜上的抗荧光素单克隆抗体捕获，从而实现恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的分型鉴定；本发明发现，pf-LF的5’端的荧光素标记物、pv-LF的5’端荧光素标记物、po-LF的5’端荧光素标记物、pm-LF的5’端荧光素标记物，优选的选自FITC、CY3、CY5、地高辛；相对于其他的荧光素如藻红素、藻蓝素、量子点、镧系金属离子，更容易与引物核苷酸序列标记，结构更加稳定，参与免疫反应其特异性更好。
5.采用胶体金而无需荧光PCR仪采集荧光信号分析数据，通过裸眼即可进行结果判读，操作简捷且节省资源。
本发明仅需一个扩增体系和一根试纸条在较短时间内便能鉴别四种疟原虫，对于疟原虫的快速诊断与临床用药指导具有较高的参考价值，在疟疾的临床诊断、边境防疫和急诊现场快速检测等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为免疫胶体金层析试纸条结构示意图；
图2为用免疫胶体金层析试纸条检测临床阴性样本、恶性疟原虫阳性样本、间日疟原虫阳性样本、卵形疟原虫阳性样本、三日疟原虫阳性样本以及恶性疟原虫和卵形疟原虫混合感染阳性样本检测结果图；
图3为用免疫胶体金层析试纸条检测恶性疟原虫不同虫体浓度样本检测结果图；
图4为用免疫胶体金层析试纸条检测间日疟原虫不同虫体浓度样本检测结果图；
图5为用免疫胶体金层析试纸条检测卵形疟原虫不同虫体浓度样本检测结果图；
图6为用免疫胶体金层析试纸条检测三日疟原虫不同虫体浓度样本检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下述实施例和对比例中：扩增反应液、硫酸镁、Bst DNA Polymerase均来自于苏州先达基因，货号为EM101。
实施例1
本实施例提供一种用于区分四种疟原虫种的试剂盒，所述试剂盒包括试纸条和LAMP恒温扩增反应体系。
（一）试纸条制备
1.样本垫制备
使用40mL样本垫处理液（50mM Tris pH8.1±0.1、1%（w/v）BSA、0.5%（v/v）Tween-20）将1张8964（255mm*300mm）（奥斯龙，cat:8964）玻璃纤维浸润均匀（浸泡20-30min），后置于鼓风干燥箱干燥16~24小时，避光干燥待用。
2.金结合垫制备
2.1溶液配置
0.1‰（w/v）胶体金溶液制备：取清洗干净的烧瓶加入1000g的超纯水，将烧瓶放置于磁力加热搅拌器上加热至沸腾并保持低速搅拌均匀，加入10mL 1%（w/v）柠檬酸三钠，继续煮沸5min，加入10mL 1%（w/v）氯金酸；持续加热搅拌溶液呈透明的红色，停止加热，恢复室温待用；
胶体金稀释液：50mM Tris-HCl，2%（w/v）蔗糖，2% （w/v）BSA，0.5%（v/v）吐温-20。
2.2检测用胶体金标记
将用于可以结合具有生物素标记探针的链霉亲和素5mg(赛默飞，cat：434302)，加入1000mL 0.1‰（w/v）胶体金溶液中，室温匀速搅拌；立即向其加入2mL的0.2M K2CO3溶液并继续匀速搅拌60min；加入20mL 10% （w/v）BSA溶液室温匀速搅拌封闭60min；完成后8000rpm离心30min去上清，加入1mL胶体金稀释液回收标记的胶体金，2-8℃保存待用并使用紫外分光光度计测试胶体金浓度。
2.3 质控用胶体金标记
由于检测通用型胶体金颗粒无法用于C线质控，因此采用兔IgG和羊抗兔作为独立C线系统用于检验试纸条是否成功完成检测，即羊抗兔包被在NC膜的C位置，用于捕获标记有兔IgG的胶体金颗粒。其中兔IgG的标记如下：1.将5mg兔IgG(启泰，cat:RG01)加入1000mL0.1‰（w/v）胶体金溶液中，室温匀速搅拌；2.立即向其加入2mL的0.2M K2CO3溶液并继续匀速搅拌60min；3.加入20mL 10% （w/v）BSA溶液室温匀速搅拌60min；4.完成后8000rpm离心30min去上清，加入1mL胶体金稀释液回收标记的胶体金，2-8℃保存待用。
2.4 金结合垫制备
使用胶体金稀释液将步骤2.2和2.3制备的胶体金稀释至同一容器内，使得到的混合胶体金溶液中检测用胶体金浓度为4OD，质控用胶体金浓度为2OD，取30mL混合胶体金溶液将1张8950（255mm*300mm）（奥斯龙，cat:8950）玻璃纤维浸润均匀，37℃烘箱干燥，封闭保存备用。
3.NC膜制备
质控线C：能捕获兔IgG的羊抗兔（(启泰，cat:RGI06)），0.8~1mg/mL，喷量0.8ul/cm；
检测线T1：包被有抗FITC单克隆抗体（Santa Cruz,cat：SC-69872），1.5mg/mL，喷量0.8uL/cm，能够捕获恶性疟原虫特异性上游环引物上的FITC；
检测线T2：包被有抗CY3单克隆抗体（Santa Cruz,cat：SC-166894），1.5mg/mL，喷量0.8uL/cm，能够捕获间日疟原虫特异性上游环引物上的CY3；
检测线T3：包被有抗CY5单克隆抗体（Santa Cruz,cat：SC-166896），1.5mg/mL，喷量0.8uL/cm，能够捕获卵形疟原虫特异性上游环引物上的CY5；
检测线T4：包被有抗地高辛单克隆抗体（Santa Cruz,cat：SC-57080），1.5mg/mL，喷量0.8uL/cm，能够捕获三日疟原虫特异性上游环引物上的地高辛
按照上述喷量使用喷金划膜仪均匀喷涂在NC膜（赛多利斯，cat: 1UN14）的C、T1、T2、T3、T4对应的位置，完成后放置45℃烘箱16~24小时，避光干燥待用。
4.吸水纸
吸水纸材质一般是纤维，天然有机高分子化合物，本实施例选择上海衡元高分子材料有限公司生产的CHK-17吸水纸。
5.试纸条的组装
将裁剪后的吸水纸（21.5mm×30mm），金结合垫（5mm×30mm）和包被好的NC膜（20mm×30mm）依次固定在PVC底板（600mm×300mm）（杭州瑞健）上，同时将不干胶（孚艾包装）分别包裹在吸水纸和NC膜交接处以及NC膜-金结合垫-玻璃纤维连接处。将组装的大板裁剪成3mm的试纸条，即成检测试纸条。组装示意图如图1所示。
所述试纸条包括底板：底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、NC膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于NC膜的一端，吸水纸的一端覆盖于NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线T线和质控C线。
金结合垫上含有标记有胶体金的链霉亲和素可以结合扩增产物中生物素标记的loopF引物，和标记有兔IgG的胶体金用于层析质控；NC膜上检测线T1、T2、T3和T4分别包被不同荧光素的特异性抗体，用于捕获扩增产物中标记有不同荧光素的引物，质控线C包被兔抗体用于层析质控。
（二）LAMP恒温扩增反应体系制备
1.特异性引物筛选
通过NCBI 查找下载恶性疟原虫pf的18s RNA（GenBank:M19173.1/M19172.1）、间日疟原虫pv的18s RNA（GenBank:X13926.1/U03080.1）、卵形疟po原虫的18s RNA（GenBank:L48986.1）、三日疟原虫pm（GenBank: PmUG01_10013000）的18s RNA基因序列调取相关特异性、保守基因序列比对，运用Primer Express 3.0软件设计引物，通过人工比对、试验筛选出高效高敏的引物，引物序列及靶序列；其中SEQ ID No.1- SEQ ID No.2为疟原虫通用外侧引物，SEQ ID No.3- SEQ ID No.4为疟原虫通用内侧引物，SEQ ID No.5为疟原虫通用下游环引物，SEQ ID No.6为恶性疟原虫特异性上游环引物，SEQ ID No.7为间日疟原虫特异性上游环引物，SEQ ID No.8为卵形疟原虫特异性上游环引物，SEQ ID No.9为三日疟原虫特异性上游环引物。如表1-表4所示.
用于扩增恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫的引物见表1-表4。
表1
表2
表3
表4
其中：5’端标记有生物素（biotin）的引物为通用下游环引物；5’端标记有FITC或CY3或CY5或digoxin的引物为特异性上游环引物。
当有目标疟原虫的DNA时，LAMP反应启动，形成有生物素和荧光素标记的杂交链，从而可以被胶体金检测试纸条检出。
2.反应体系及扩增条件
反应体系：1人份检测试剂反应体系含有1μL扩增反应液、1.5μL硫酸镁、1μL BstDNA Polymerase、9μL dH2O、7.5μL引物混合液和25μL密封液，其中扩增反应液包括200 mMTris-HCl，100 mM (NH4)2SO4，100mM KCl，20 mM MgSO4，1%Triton X-100，dNTPs(各dNTP浓度为100μmol/L)，扩增反应液的pH 8.8；引物混合液包括：F3的浓度为10µmol/L、B3的浓度为10µmol/L、FIP的浓度为2µmol/L、BIP的浓度为2µmol/L、LB的浓度为4µmol/L 、pf-LF的浓度为4µmol/L；pv-LF的浓度为4µmol/L；po-LF的浓度为4µmol/L；pm-LF的浓度为4µmol/L。
反应时，加入5μL待测样本核酸模板，总体积50uL，65℃恒温容器中反应20min。
所述扩增反应液、硫酸镁、Bst DNA Polymerase均来自于苏州先达基因科技有限公司，货号为EM101。
恒温扩增完成后，平衡至室温，将试纸条样品垫端置于扩增反应物中，15min后观察结果。检测时，扩增产物滴加到试剂卡的加样孔中，产物首先和金结合垫上标记链霉亲和素的胶体金结合，接着往NC膜上层析最终被包被在检测线T线上的抗荧光物质单克隆抗体捕获，随着胶体金积聚，检测卡的检测线T线显色，NC膜上检测线T1~T4分别包被有对应荧光素的抗FITC单克隆抗体、抗Cy3单克隆抗体、抗Cy5单克隆抗体、或抗地高辛单克隆抗体，分别对应着恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟特异性引物。若存在对应的疟原虫核酸，则对应的T线显色，否则不显色；同时检测试纸条设置质控线C线，作为测量是否有效的判定参照，测定时C线始终显色。图2分别显示了临床阴性样本、恶性疟原虫阳性样本、间日疟原虫阳性样本、卵形疟原虫阳性样本、三日疟原虫阳性样本以及恶性疟原虫和卵形疟原虫混合感染阳性样本检测结果。
应用效果测试例1 灵敏度测试
1.样本准备和核酸提取
将浙江省疾病预防控制中心2023年11月份提供的pf阳性全血样本、pv阳性全血样本、po阳性全血样本和pm阳性全血样本，使用阴性全血样本分别稀释至125虫/μL、25虫/μL、5虫/μL、2虫/μL，使用Ex-DNA/RNA病毒提取试剂盒（TIANGEN，cat:T392）进行核酸提取，完成后放置-70℃以下保存备用。
2.疟原虫分型试剂检测
按照试剂检测要求，分别加入步骤1提取的待测样本核酸模板5µL、以及1µL扩增反应液（见实施例1步骤（二））、7.5µL引物混合液（见实施例1步骤（二））、1µL Bst DNAPolymerase、1.5µL硫酸镁、9µL dH2O和25µL密封液混匀后，置于65℃恒温容器中反应20min进行扩增。
完成扩增恢复至室温后，将试纸条置于扩增管中，5~15min后观察结果，每组检测重复3次。结果如图3~6所示，其中图3为检测恶性疟原虫不同虫体浓度样本的检测结果；图4为检测间日疟原虫不同虫体浓度样本的检测结果；图5为检测卵形疟原虫不同虫体浓度样本的检测结果；图6为检测三日疟原虫不同虫体浓度样本的检测结果。该检测试剂在虫密度2虫/μL仍能全部检出，灵敏度较高。同时对2虫/μL的样本进行检出限验证，每个样本制备3支，每支重复20次测试，结果如表5所示。
表5
根据结果可知，各型别疟原虫在2虫/μL的浓度下，均能满足95%以上的检出，其检出限满足WHO有关疟原虫检测检出限在2μL/虫的要求。
应用效果测试例2 试剂盒性能测试-交叉样本测试
1.样本准备和核酸提取
选择可以引发与疟疾临床表现症状相似的其他病原体，包括甲型流感病毒培养液、乙型流感病毒培养液、HIV病毒阳性样本、HCV病毒阳性样本、HBV病毒阳性样本、急性HAV病毒阳性样本、登革病毒阳性样本、黄热病毒阳性样本、麻疹病毒培养液、蜱传脑热阳性样本、利士曼原虫阳性样本、钩端螺旋体阳性样本、梅毒阳性样本、结核分枝杆菌阳性样本、裂体吸虫阳性样本、弓形虫阳性样本、布鲁氏杆菌培养液样本。每个样本各3例作为交叉样本，使用Ex-DNA/RNA病毒提取试剂盒（TIANGEN，cat:T392）进行核酸提取，完成后放置-70℃以下保存备用。
2.疟原虫分型试剂检测
按照试剂检测要求，分别加入步骤1提取的待检交叉病原体的待测样本核酸模板5µL、1µL扩增反应液（同实施例1步骤（二））、7.5µL引物混合液（同实施例1步骤（二））、1µLBst DNA Polymerase、1.5µL硫酸镁、9µL dH2O和25µL密封液混匀后，置于65℃恒温容器中反应20min进行扩增。完成扩增恢复至室温后，将试纸条置于扩增管中，5~15min后观察结果，每个样本重复3次。结果如表6所示：
表6
以上交叉23种病原体73例样本的检测结果均为阴性，说明本试剂在检测与感染疟疾临床症状相似的其他病原体不会产生交叉反应，本检测试剂具有较好的特异性。
应用效果测试例3临床样本符合率
1.样本核酸提取
检测浙江省疾病预防控制中心采集留存疟原虫相关临床样本，其中阴性样本174例，pf阳性样本103例，pv阳性样本47例，po阳性样本20例，pm阳性样本13例，pf/po共感染2例。以上样本使用Ex-DNA/RNA病毒提取试剂盒（TIANGEN，cat:T392）进行核酸提取，完成后放置-70℃以下保存备用。
2.疟原虫分型试剂检测
按照试剂检测要求，在200µlPCR管加入5µL待测样本核酸模板、1µL扩增反应液（同实施例1步骤（二））、7.5µL引物混合液（同实施例1步骤（二））、1µL Bst DNA Polymerase、1.5µL硫酸镁、9µL dH2O和25µL密封液混匀后，置于65℃恒温容器中反应20min进行扩增。完成扩增恢复至室温，将试纸条置于扩增管中，5~15min后观察结果并记录结果。
3.参比核酸检测试剂
按照参比试剂盒疟原虫核酸分型检测试剂盒（硕世生物，cat:YJW20601N）的要求，提取的核酸样本进行扩增和检测并记录数据。
4.疟原虫胶体金快速检测试剂
使用市场上应用比较广的SD bioline生产的胶体金快速检测试剂盒进行比对实验，该试剂盒单个试剂仅能用于pf和pv的分型（cat：05FK80），或者pf和其他疟原虫（cat:05FK60）的区分检测，因此临床血液样本分别使用这两种试剂盒进行检测，记录结果。
对以上结果统计分析，分别计算检测试剂与核酸分型检测试剂的阳性符合率和阴性符合率，以及胶体金快速检测试剂盒的阳性符合率和阴性符合率，结果如表7-10所示。
表7
表8
表9
表10
根据以上结果可知，本发明试剂与核酸PCR分型试剂盒的pf、pv、po的阳性符合率均在95%以上，pm阳性符合率在90%以上，阴性符合率均在99%，本试剂在临床应用具有较高的灵敏度和特异性，能够满足实际应用场景的检测需求；而胶体金快速检测试剂盒在阴性符合率与检测试剂一致，均有较好的特异性，但其阳性符合率仅pv在90%以上，其他型别检出率未能达到90%以上，其中pm的检出最弱仅58.33%，本试剂盒与传统的胶体金快速检测试剂盒相比，具有较高的灵敏度。
综上所述，本发明检测试剂，可用于pf、pv、po、pm四种疟原虫的分型检测，且与核酸分型检测试剂一致性较高，且操作简便，更适用于现场快速检测，满足疾控部门、海关等部门的筛查工作。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
1.一种用于区分疟原虫虫种的引物组合，所述疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫中的至少一种，其特征在于，所述引物组合包括
疟原虫通用外侧引物：
F3: 5’-CGGAAACCTTGTTACGAC-3’，如SEQ ID No.1所示；
B3: 5’-GCAATTATTAATCTTGAACGAGGA-3’，如SEQ ID No.2所示；
疟原虫通用内侧引物：
FIP: 5’-TTGAAAGATATGATGAATTG-TTCCTTTAAAAGATAGGATTTAC-3’，如SEQ ID No.3所示；
BIP: 5’- CGGTAGGAGCGACGGGC-GCCTAGTAAGCATGATTC-3’，如SEQ ID No.4所示；
疟原虫通用下游环引物：
LB: 5’-AAGGGCAGGGACGTAGTCAGC-3’，如SEQ ID No.5所示；
恶性疟原虫特异性上游环引物：
pf-LF: 5’-GAAAAATTGAATTATATTCTTTTT-3’，如SEQ ID No.6所示；
间日疟原虫特异性上游环引物：
pv-LF: 5’-GAAGGGGGATTATATCTCCTTT-3’，如SEQ ID No.7所示；
卵形疟原虫特异性上游环引物：
po-LF: 5’-CCAGAAAAAAGAAAATATAATTTTCCCTTT-3’，如SEQ ID No.8所示；
三日疟原虫特异性上游环引物：
pm-LF: 5’-AAAAAGGGTTTTTATTCTTTTTTC-3’，如SEQ ID No.9所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述LB的5’端使用生物素标记修饰；所述pf-LF的5’端、pv-LF的5’端、po-LF的5’端、pm-LF的5’端均使用荧光素标记物修饰；
其中，pf-LF的5’端的荧光素标记物、pv-LF的5’端荧光素标记物、po-LF的5’端荧光素标记物、pm-LF的5’端荧光素标记物之间均不同；
所述荧光素标记物包括FITC、CY3、CY5、地高辛中的其中一种。
3.一种用于区分疟原虫种的反应体系，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合。
4.一种用于区分疟原虫种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合，或权利要求3所述的反应体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试纸条；所述试纸条包括底板；底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、NC膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间，金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于NC膜的一端，吸水纸的一端覆盖于NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线T线和质控线C线。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫的制备方法包括如下步骤：将基材在样本垫处理液中浸泡20-30min，干燥制得所述样品垫；其中样本垫处理液包括20~200 mM Tris、0.5~2% w/v BSA、0.1~2% v/v Tween-20，样本垫处理液pH 7.4~9.0；
所述金结合垫上包含标记有胶体金的链霉亲和素和标记有兔IgG的胶体金；
所述质控线C线上喷有C线溶液；所述C线溶液包括能捕获兔IgG的羊抗兔；
所述检测线T线有四条，每条检测线T线上包被有一个抗荧光素单克隆抗体，各检测线T线上包被的抗荧光素单克隆抗体均不相同；
所述抗荧光素单克隆抗体包括抗FITC单克隆抗体、抗CY3单克隆抗体、抗CY5单克隆抗体、抗地高辛单克隆抗体。
7.一种非疾病诊断的区分疟原虫虫种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取待测样本核酸；
S2、环介导等温基因扩增反应，反应体系包括引物混合液；
所述引物混合液包括如权利要求1或2所述的引物组合；
S3、加入步骤S1的待测样本核酸模板，60~65℃恒温容器中反应20-30min；
S4、扩增反应结束后，将试纸条置于扩增管中，观察结果。
8.根据权利要求7所述的非疾病诊断的区分疟原虫虫种的方法，其特征在于，所述试纸条包括底板；底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、NC膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间，金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于NC膜的一端，吸水纸的一端覆盖于NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线T线和质控线C线。
9.根据权利要求8所述的非疾病诊断的区分疟原虫虫种的方法，其特征在于，所述样品垫的制备方法包括如下步骤：将基材在样本垫处理液中浸泡20-30min，干燥制得所述样品垫；
所述金结合垫上包含标记有胶体金的链霉亲和素和标记有兔IgG的胶体金；
所述质控线C线上喷有C线溶液；所述C线溶液包括能捕获兔IgG的羊抗兔；
所述检测线T线有四条，每条检测线T线上包被有一个抗荧光素单克隆抗体，各检测线T线上包被的抗荧光素单克隆抗体之间均不相同；
所述抗荧光素单克隆抗体包括抗FITC单克隆抗体、抗CY3单克隆抗体、抗CY5单克隆抗体、抗地高辛单克隆抗体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |