JP2022515774A - Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための、増幅オリゴマー、検出プローブ、および捕捉プローブを含む核酸オリゴマーが開示される。開示されたオリゴマーを使用した標的核酸のリアルタイムでの増幅および検出を含む、特異的な核酸増幅および検出の方法、ならびに対応する反応混合物およびキットも開示される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮出願第６２／７８２，９４５号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮出願第６２／７８２，９４５号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１０月２８日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、「ＧＤＳ＿０１１０ＰＣ＿２０１９１０２８＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名称で、サイズは５６，０８７バイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１０月２８日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、「ＧＤＳ＿０１１０ＰＣ＿２０１９１０２８＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名称で、サイズは５６，０８７バイトである。
マラリアは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の赤血球内寄生虫によって引き起こされる深刻な疾患である。寄生虫は、感染したメスのＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊に刺されることによってうつる。ヒトにおいてマラリアを引き起こす寄生虫には、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、およびＰ．ｖｉｖａｘの５種がある。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、２０１６年には世界中で２億１６００万件のマラリア症例があり、そのうち４４万５０００件が死亡例であった。
アメリカ食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．ＦＤＡ）は、マラリア流行地域に旅行した供血者を受け入れるか延期するための厳格な血液スクリーニングガイドラインを施行した。旅行者は、流行地域に旅行後１年間、または供血者が流行地域の元居住者である場合は３年間延期される。マラリアと診断された人は、治療が完了し、症状がなくなってから３年間延期される。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについて献血をスクリーニングするために米国で利用可能な承認済みの検査は存在しない。これは、問診票による将来の供血者の注意深いスクリーニングを必要とする。
流行国では、ＷＨＯは、厚層塗抹標本による検査または高感度酵素免疫測定法の使用を推奨する。非流行国では、ＷＨＯは、高感度酵素免疫測定法を使用したマラリア抗体検査と組み合わせて、最後の潜在的曝露から６か月間、供血者が延期されることを推奨する。マラリア抗体の証拠がない場合、供血者は復帰し得る。これらの方法は、伝播が発生する可能性がある低レベルの寄生虫血症を検出するのに有効ではないというリスクがある。
輸血伝播マラリア（ＴＴＭ）は、米国で文書化されている。１９１１年から２０１５年の間に４６件のＴＴＭ症例が報告され、最新の症例は２０１８年に報告されている。ＴＴＭおよび延期された供血者の数を低減するために、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を検出するための特定の高感度核酸検査（ＮＡＴ）が必要である。
一態様では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための方法を提供する。方法は一般に、（１）試料であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を含有する疑いがある試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることと、（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前述の試料中に存在する任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施することと、（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それによって前述の試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７または配列番号１６８を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーとを含む。他の実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ'）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、（ｂ'）配列番号１８８の配列に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーとを含む。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）（ｉ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記の方法のいくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、３５、５４、および５５から選択される。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む。いくつかのそのような変化形では、（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、および３５から選択される。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記の方法のいくつかの実施形態では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６７の配列を含む。いくつかのそのような変化形では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２８～３１、３４、４０、４１、および４９～５１から選択される。他の実施形態では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６８の配列を含む。いくつかのそのような変化形では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３８、３９、４３、４４、および５３から選択される。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記の方法のいくつかの実施形態では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８０～８２および８５～１００から選択される。他の実施形態では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む。（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７１の配列を含むいくつかの変化形では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８１、８２、８５、８７～９０、９４、および９６～９８から選択される。（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７２の配列を含むいくつかの変化形では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８０、８２、８５、および８７～１００から選択される。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む上記の方法のいくつかの実施形態では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３７、４６、１８３、および１８４から選択される。他の実施形態では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８６の配列に含有される。いくつかのそのような変化形では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８３または配列番号１８４である。少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む特定の実施形態では、（ｂ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８３、８４、および１８２から選択される。より具体的な変化形では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８３または配列番号１８４であり、（ｂ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８２である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、（ｂ）または（ｂ'）の増幅オリゴマーは、それぞれ、（ｂ）または（ｂ'）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に好適なプロモーター配列は、例えば、配列番号１７９などのＴ７プロモーター配列である。（ｂ）の増幅オリゴマーがプロモーター配列を含む特定の変化形では、（ｂ）の増幅オリゴマーは、配列番号５７～５９および６２～７７から選択される配列を含む。（ｂ'）の増幅オリゴマーがプロモーター配列を含む特定の変化形では、（ｂ'）の増幅オリゴマーは、配列番号６０、６１、および１８１から選択される配列を含む。
（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列の特に好適な対は、それぞれ、（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、ならびに（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５である。いくつかのそのような実施形態では、（ｂ）の増幅オリゴマーは、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列（例えば、配列番号１７９などのＴ７プロモーター配列）をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む。いくつかのそのような変化形では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）（ｉｉ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む。（ａ）（ｉｉ）の特に好適な第１および第２の増幅オリゴマーは、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列）を含む、第１の増幅オリゴマーと、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号５３の標的ハイブリダイズ配列）を含む、第２の増幅オリゴマーとを含む。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記の方法の他の実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーと、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーとを含む。いくつかのそのような実施形態では、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーは、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、標的配列番号２１のハイブリダイズ配列）を含み、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーは、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列）を含む。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーを含む。いくつかのそのような実施形態では、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々は、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む（例えば、配列番号９４の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマー、および配列番号９５の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー）。いくつかの変化形では、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々は、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に好適なプロモーター配列は、例えば、配列番号１７９などのＴ７プロモーター配列である。（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々がプロモーター配列を含む特定の変化形では、（ｂ）の第１の増幅オリゴマーは、配列番号７１の配列を含み、（ｂ）の第２の増幅オリゴマーは、配列番号７２の配列を含む。
上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法の特定の実施形態では、方法は、ステップ（１）の前に試料中の他の構成成分から標的核酸を精製することをさらに含む。いくつかのそのような変化形では、精製ステップは、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含み、標的ハイブリダイズ配列は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成されている。特に好適な捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。より具体的な変化形では、捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。いくつかの実施形態では、精製ステップは、試料を少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマー（例えば、上記のような少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマー）と接触させることを含む。いくつかのそのような変化形では、少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の捕捉プローブオリゴマーと、配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の捕捉プローブオリゴマーとを含む。
上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法のいくつかの実施形態では、検出するステップ（３）は、インビトロ核酸増幅反応を、増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと、増幅産物の存在または非存在が判定される条件下で接触させ、それによって試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を示すことを含む。少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含むいくつかのそのような実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む。好適な検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。特定の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４または配列番号１７５の配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。配列番号１７４の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含むいくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。配列番号１７５もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む他のそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。特定の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。いくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。
検出するステップ（３）が、インビトロ核酸増幅反応を少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む上記の方法の他の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１８９の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１９０および配列番号１９１から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む。いくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２５～１３０および１４３（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。
検出するステップ（３）が、インビトロ核酸増幅反応を少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む、上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法の特定の変化形では、（ａ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、（Ａ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５１もしくはその相補体、または配列番号１５１もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｂ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｃ）配列番号３３、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｄ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｅ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｆ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｇ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｈ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｉ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｉ）配列番号３３、配列番号８９、および配列番号１５８もしくはその相補体、または配列番号１５８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｋ）配列番号４９、配列番号８９、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｌ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｍ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｎ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｏ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｐ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｑ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｒ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｓ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｔ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｕ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｖ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｗ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｘ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｙ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｚ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＡ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＢ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＣ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＤ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは（ＡＥ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラである。
検出するステップ（３）が、インビトロ核酸増幅反応を少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む、上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法の特定の変化形では、（ａ'）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ'）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ、（Ａ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｂ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２７もしくはその相補体、または配列番号１２７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｃ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２８もしくはその相補体、または配列番号１２８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｄ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１４３もしくはその相補体、または配列番号１４３もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｅ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２９もしくはその相補体、または配列番号１２９もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは（Ｆ）配列番号１８４、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラである。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを利用する上記の方法のいくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、検出プローブオリゴマーヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つの２'メトキシ修飾を含む。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを利用する上記の方法のいくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、例えば、蛍光または化学発光標識などの検出可能な標識をさらに含む。特に好適な化学発光標識は、検出プローブオリゴマーの２つの核酸塩基の間で連結された化学発光アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である。検出可能に標識されたプローブオリゴマーを含むいくつかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識であり、検出プローブオリゴマーは、非蛍光クエンチャーをさらに含む。
上記の方法のいくつかの実施形態では、検出するステップ（３）は、増幅ステップ（２）の間に発生する。いくつかのそのような実施形態では、方法は、蛍光標識およびクエンチャー（例えば、分子トーチ、分子ビーコン、またはＴａｑＭａｎ検出プローブ）を含む、検出プローブオリゴマーを利用する。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを利用する上記の方法のいくつかの実施形態では、検出プローブは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む。特定の変化形では、非標的ハイブリダイズ配列を含む検出プローブオリゴマーは、例えば、分子ビーコンまたは分子トーチなどのヘアピン検出プローブである。
特定の実施形態では、上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法は、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを利用する。いくつかのそのような実施形態では、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーは、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含み、（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーは、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーは、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む。より具体的な変化形では、第１の検出プローブオリゴマーは、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、第２の検出プローブオリゴマーは、配列番号１４８および配列番号１５２から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびそれらのＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。
上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法の特定の変化形では、ステップ（２）でのインビトロ核酸増幅反応は、等温増幅反応（例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応）である。
上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法の特定の変化形では、増幅反応は、リアルタイム増幅反応である。
上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するための方法のいくつかの実施形態では、試料は、臨床試料である。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、赤血球試料などの血液試料（例えば、溶解血球試料または溶解赤血球試料）である。
別の態様では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを提供する。オリゴマーの組み合わせは一般に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７または配列番号１６８を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーとを含む。他の実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ'）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、（ｂ'）配列番号１８８の配列に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーとを含む。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）（ｉ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、３５、５４、および５５から選択される。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む。いくつかのそのような変化形では、（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、および３５から選択される。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６７の配列を含む。いくつかのそのような変化形では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２８～３１、３４、４０、４１、および４９～５１から選択される。他の実施形態では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６８の配列を含む。いくつかのそのような変化形では、（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３８、３９、４３、４４、および５３から選択される。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８０～８２および８５～１００から選択される。他の実施形態では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む。（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７１の配列を含むいくつかの変化形では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８１、８２、８５、８７～９０、９４、および９６～９８から選択される。（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７２の配列を含むいくつかの変化形では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８０、８２、８５、および８７～１００から選択される。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３７、４６、１８３、および１８４から選択される。他の実施形態では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８６の配列に含有される。いくつかのそのような変化形では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８３または配列番号１８４である。少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む特定の実施形態では、（ｂ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８３、８４、および１８２から選択される。より具体的な変化形では、（ａ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８３または配列番号１８４であり、（ｂ'）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８２である。
上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、（ｂ）または（ｂ'）の増幅オリゴマーは、それぞれ、（ｂ）または（ｂ'）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に好適なプロモーター配列は、例えば、配列番号１７９などのＴ７プロモーター配列である。（ｂ）の増幅オリゴマーがプロモーター配列を含む特定の変化形では、（ｂ）の増幅オリゴマーは、配列番号５７～５９および６２～７７から選択される配列を含む。（ｂ'）の増幅オリゴマーがプロモーター配列を含む特定の変化形では、（ｂ'）の増幅オリゴマーは、配列番号６０、６１、および１８１から選択される配列を含む。
（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列の特に好適な対は、それぞれ、（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、ならびに（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５である。いくつかのそのような実施形態では、（ｂ）の増幅オリゴマーは、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列（例えば、配列番号１７９などのＴ７プロモーター配列）をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む。いくつかのそのような変化形では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）（ｉｉ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む。（ａ）（ｉｉ）の特に好適な第１および第２の増幅オリゴマーは、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列）を含む、第１の増幅オリゴマーと、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号５３の標的ハイブリダイズ配列）を含む、第２の増幅オリゴマーとを含む。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせの他の実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーと、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーとを含む。いくつかのそのような実施形態では、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーは、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、標的配列番号２１のハイブリダイズ配列）を含み、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーは、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列）を含む。
少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーを含む。いくつかのそのような実施形態では、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々は、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む（例えば、配列番号９４の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマー、および配列番号９５の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー）。いくつかの変化形では、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々は、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に好適なプロモーター配列は、例えば、配列番号１７９などのＴ７プロモーター配列である。（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々がプロモーター配列を含む特定の変化形では、（ｂ）の第１の増幅オリゴマーは、配列番号７１の配列を含み、（ｂ）の第２の増幅オリゴマーは、配列番号７２の配列を含む。
上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するためのオリゴマーの組み合わせの特定の実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、標的ハイブリダイズ配列は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成されている。特に好適な捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。より具体的な変化形では、捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマー（例えば、上記のような少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマー）を含む。いくつかのそのような変化形では、少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の捕捉プローブオリゴマーと、配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の捕捉プローブオリゴマーとを含む。
上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するためのオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、少なくとも２つの増幅オリゴマーによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種アンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む。少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含むいくつかのそのような実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む。好適な検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。特定の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４または配列番号１７５の配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。配列番号１７４の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含むいくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。配列番号１７５もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む他のそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。特定の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。いくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む、上記のオリゴマーの組み合わせの他の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１８９の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１９０および配列番号１９１から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む。いくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２５～１３０および１４３（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ）および（ｂ）の増幅オリゴマーを含む、上記のオリゴマーの組み合わせの特定の変化形では、（ａ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、（Ａ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５１もしくはその相補体、または配列番号の１５１もしくはその相補体ＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｂ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号の１５７もしくはその相補体ＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｃ）配列番号３３、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号の１５５もしくはその相補体ＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｄ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｅ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｆ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号の１４８もしくはその相補体ＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｇ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｈ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｉ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｉ）配列番号３３、配列番号８９、および配列番号１５８もしくはその相補体、または配列番号１５８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｋ）配列番号４９、配列番号８９、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｌ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｍ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｎ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｏ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｐ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｑ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｒ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｓ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｔ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｕ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｖ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｗ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｘ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｙ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｚ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＡ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＢ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＣ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（ＡＤ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは（ＡＥ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラである。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが（ａ'）および（ｂ'）の増幅オリゴマーを含む、上記のオリゴマーの組み合わせの特定の変化形では、（ａ'）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ'）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、（Ａ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｂ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２７もしくはその相補体、または配列番号１２７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｃ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２８もしくはその相補体、または配列番号１２８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｄ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１４３もしくはその相補体、または配列番号１４３もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、（Ｅ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２９もしくはその相補体、または配列番号１２９もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは（Ｆ）配列番号１８４、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラである。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、検出プローブオリゴマーヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つの２'メトキシ修飾を含む。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、例えば、蛍光または化学発光標識などの検出可能な標識をさらに含む。特に好適な化学発光標識は、検出プローブオリゴマーの２つの核酸塩基の間で結合された化学発光アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である。検出可能に標識されたプローブオリゴマーを含むいくつかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識であり、検出プローブオリゴマーは、非蛍光クエンチャーをさらに含み、特に好適な検出プローブオリゴマーは、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブを含む蛍光標識およびクエンチャーを含む。
少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、検出プローブは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む。特定の変化形では、非標的ハイブリダイズ配列を含む検出プローブオリゴマーは、例えば、分子ビーコンまたは分子トーチなどのヘアピン検出プローブである。
特定の実施形態では、上記のような試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を検出するためのオリゴマーの組み合わせは、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを含む。いくつかのそのような実施形態では、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーは、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含み、（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーは、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーは、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む。より具体的な変化形では、第１の検出プローブオリゴマーは、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、第２の検出プローブオリゴマーは、配列番号１４８および配列番号１５２から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびそれらのＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。
別の態様では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に増幅するための、上記の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせの使用を提供する。
別の態様では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を特異的に検出するための検出プローブオリゴマーを提供する。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、第１および第２のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的増幅オリゴマーを含むオリゴマーの組み合わせによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された、標的ハイブリダイズ配列を含み、（ａ）第１の増幅オリゴマーは、（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｂ）第２の増幅オリゴマーは、長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む、標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかのそのような実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む。好適な検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。特定の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４または配列番号１７５の配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。配列番号１７４の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含むいくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。配列番号１７５もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む他のそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。特定の実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。いくつかのそのような変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。
試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を特異的に検出するための検出プローブオリゴマーの他の実施形態では、検出プローブオリゴマーは、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、第１および第２のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的増幅オリゴマーを含むオリゴマーの組み合わせによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された、標的ハイブリダイズ配列を含み、（ａ）第１の増幅オリゴマーは、配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｂ）第２の増幅オリゴマーは、配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む、標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかのそのような実施形態では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１８９の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１９０および配列番号１９１から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む。より具体的な変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２５～１３０および１４３（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。
上記の検出プローブオリゴマーのいくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、検出プローブオリゴマーヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つの２'メトキシ修飾を含む。
上記の検出プローブオリゴマーのいくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、例えば、蛍光または化学発光標識などの検出可能な標識をさらに含む。特に好適な化学発光標識は、検出プローブオリゴマーの２つの核酸塩基の間で結合された化学発光アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である。検出可能な標識を含むいくつかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識であり、検出プローブオリゴマーは、非蛍光クエンチャーをさらに含み、特に好適な検出プローブオリゴマーは、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブを含む蛍光標識およびクエンチャーを含む。
上記の検出プローブオリゴマーのいくつかの実施形態では、検出プローブは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む。特定の変化形では、非標的ハイブリダイズ配列を含む検出プローブオリゴマーは、例えば、分子ビーコンまたは分子トーチなどのヘアピン検出プローブである。
別の態様では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を検出するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを提供し、オリゴマーの組み合わせは、上記の少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーは、（Ａ）（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の検出プローブオリゴマーと、（Ｂ）（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、第２の検出プローブオリゴマーとを含む。より具体的な変化形では、第１の検出プローブオリゴマーは、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、第２の検出プローブオリゴマーは、配列番号１４８および配列番号１５２から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびそれらのＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。
別の態様では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための、上記の検出プローブオリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせの使用を提供する。
別の態様では、本発明は、試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に単離するための捕捉プローブオリゴマーを提供する。いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含み、標的ハイブリダイズ配列は、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む。より多くの具体的な変化形では、捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）から選択される。
別の態様では、本発明は、試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に単離するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを提供し、オリゴマーの組み合わせは、上記少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列またはそのＤＮＡ等価物またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第１の捕捉プローブオリゴマーと、配列番号２０のハイブリダイズ配列またはそのＤＮＡ等価物またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第２の捕捉プローブオリゴマーとを含む。
別の態様では、本発明は、試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に捕捉するための、上記の捕捉プローブオリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせの使用を提供する。
別の態様では、本発明は、上記の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、上記の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む反応混合物を提供する。
本発明のこれらおよび他の態様は、本発明の以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかになるであろう。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および句は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および句は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、文脈が特に明記しない限り、複数の指示対象を含む。
「試料」には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種またはその構成成分（核酸またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ核酸の断片など）を含有し得る、または含有する疑いがある任意の標本が含まれる。試料は、単離された試料であり得る。試料には、「生物学的試料」が含まれ、これには、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫またはその構成成分（例えば、それに由来する標的核酸）を含有し得る、生きているまたは死んでいるヒトに由来する任意の組織または物質が含まれ、例えば、血液、末梢血、および赤血球の細胞を含む。血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、精液、または他の体液もしくは物質など、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫またはその構成成分（例えば、それに由来する標的核酸）を含有し得る、他の試料タイプの使用も企図されている。生物学的試料は、組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊し、したがって、標準的な方法を使用して分析用の生物学的試料を調製するために使用される、酵素、緩衝液、塩、洗剤などをさらに含有し得る溶液中に細胞内構成成分を放出するように処理され得る。例えば、試料は、細胞溶解試薬、例えば、米国特許第１０，０９３，９８９号またはＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１８９７４６号（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される溶解試薬などで処理され得る。また、試料は、試料を濾過デバイスの上もしくは中に通すことから、または遠心分離後に、または媒体、マトリックス、もしくは支持体への付着によって得られるものなどの処理された試料を含み得る。
「核酸」は、ヌクレオシドがホスホジエステル結合または他の連結によって一緒に連結されて、ポリヌクレオチドを形成する、窒素含有複素環式塩基を有する２つ以上の共有結合ヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体、または塩基類似体を含む、多量体化合物を指す。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはキメラＤＮＡ－ＲＮＡポリマー、またはオリゴヌクレオチド、およびそれらの類似体が含まれる。核酸「主鎖」は、糖－ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」もしくはＰＮＡにおける、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／３２３０５号を参照）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボースのいずれか、または既知の置換、例えば、２'メトキシ置換および２'ハロゲン化物置換（例えば、２'－Ｆ）を有する同様の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシン、５－メチルイソシトシン、イソグアニン、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００７）４３：６１７－２４）であり得、これらは、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－またはアザ－プリン、デアザ－またはアザ－ピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位、６位、および／または８位に改変または置き換え置換基を有するプリン塩基、例えば、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、０６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、および０４－アルキル－ピリミジン、ならびにピラゾロ化合物、例えば、非置換または３置換ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ ９３／１３１２１号）を含む。核酸は、主鎖が１つ以上の残基の窒素含有塩基を含まない、「非塩基性」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られる従来の糖、塩基、および連結のみを含み得るか、または従来の構成成分および置換（例えば、２'メトキシ主鎖によって連結された従来の塩基、もしくは従来の塩基と１つ以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）を含み得る。核酸には、１つ以上のヌクレオチドモノマーがＲＮＡ模倣糖立体構造にロックされた二環式フラノースユニットを有し、これが一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の相補配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）が含まれ得る（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）４３：１３２３３－４１）。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させる修飾塩基、例えば、追加のヌクレオチドが核酸に付加されるのをブロックする３'末端ジデオキシリボヌクレオチドの付加を含み得る。インビトロで核酸を作製するための合成方法は、当該技術分野で周知である。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸鎖を意味する。本出願全体を通して、核酸は、５'末端から３'末端によって示される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは典型的には、「５'から３'」、すなわち、成長する核酸の３'末端へのヌクレオチドの付加によって合成される。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭素糖、および窒素含有塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は、２'－デオキシリボースである。この用語はまた、リボースの２'位にあるメトキシ基（２'－０－Ｍｅ）などのそのようなサブユニットの類似体も含む。
本明細書で使用される場合、「核酸ベースの検出アッセイ」は、標的核酸内の標的配列を検出し、標的配列に特異的にハイブリダイズするもう１つのオリゴヌクレオチドを利用するためのアッセイである。
特定の実施形態では、核酸ベースの検出アッセイは、「増幅ベースのアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するための１つ以上のステップを利用するアッセイである。検出アッセイで使用するための様々な増幅方法が当該技術分野で知られており、それらのいくつかは、本明細書でさらに要約されている。明確にするために、増幅ベースのアッセイは、例えば、非増幅ベースのアッセイ方法（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは切断ベースのアッセイ）で使用されるステップなど、標的配列を増幅しない１つ以上のステップを含み得る。
他の実施形態では、核酸ベースの検出アッセイは、「非増幅ベースのアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するためのいずれのステップにも依存しないアッセイである。明確にするために、対応する下流の増幅オリゴマーの非存在下でのプライマーの伸長のための反応（例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を生成するための逆転写酵素によるプライマーの伸長、続くＲＮＡのＲＮａｓｅ消化により、ＲＮＡ標的に相補的な一本鎖ｃＤＮＡが得られるが、ｃＤＮＡのコピーは生成されない）を含む核酸ベースの検出アッセイは、非増幅ベースのアッセイであると理解される。
例示的な非増幅ベースのアッセイは、「切断ベースのアッセイ」であり、これは、重複するオリゴヌクレオチドの標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションによって形成される線状二重鎖切断構造の、フラップエンドヌクレアーゼによる特定の切断に依存するアッセイである。これらのアッセイでは、非標的ハイブリダイズフラップ領域を含有するプローブオリゴヌクレオチドが、フラップエンドヌクレアーゼによって重複依存的に切断されて、切断産物が放出され、それが次いで検出される。切断ベースのアッセイの原理は当該技術分野でよく知られており、例示的なアッセイは、例えば、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１７：２９２－２９６、Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．（１９９９）４：１３５－１４４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６）４４：３４４３－３４４７、ならびに米国特許第５，８４６，７１７号、同第６，７０６，４７１号、および同第５，６１４，４０２号に記載されている。切断ベースのアッセイには、例えば、市販のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、検出される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、標的配列以外の他の配列を含んでもよい。
「単離される」とは、標的核酸を含有する試料がその天然の環境から採取されることを意味するが、この用語は、いかなる程度の精製も含意しない。
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、検出される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、検出プロセス（例えば、ＴＭＡまたはＰＣＲなどの増幅ベースの検出アッセイ、または例えば、切断ベースのアッセイなどの非増幅ベースの検出アッセイ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プローブオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、および／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体を形成する複合体形成配列を含む。標的核酸が元々一本鎖である場合、「標的配列」という用語はまた、標的核酸中に存在するような「標的配列」に相補的な配列も指す。標的核酸が元々二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（－）鎖の両方を指す。標的配列を選択する際に、当業者は、無関係の標的核酸または密接に関連している標的核酸を区別するために、「固有の」配列が選択されるべきであることを理解するであろう。
「標的ハイブリダイズ配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの部分を指すために本明細書において使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成されている。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成されている標的配列の部分に１００％相補的であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。標的ハイブリダイズ配列はまた、標的配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたヌクレオチド残基を含んでもよい。標的配列に対する標的ハイブリダイズ配列の１００％未満の相補性は、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの様々な株にハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合のように、標的核酸が種内の複数の株である場合に生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的ハイブリダイズ配列を構成する他の理由が存在することが理解される。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸の領域に関して本明細書で使用される「配列を標的とする」という用語は、オリゴヌクレオチドが本明細書に記載される検出を可能にする様式で標的配列にハイブリダイズするプロセスを指す。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含有しない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、相補的であるが、標的Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸配列との１、２、３、４、または５つのミスマッチを含有する。好ましくは、標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的な少なくとも１０個から５０個ものヌクレオチドを含む。少なくとも１０個から５０個ものとは、１０、５０、およびそれらの間の各整数が含まれるような包括的範囲であることが理解される。好ましくは、オリゴマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズする。
「～するように構成された」という用語は、参照されたオリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を示す。例えば、標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照された配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。
本明細書で使用される場合、「～に特異的にハイブリダイズするように構成された」という用語は、オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域が、参照されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域の配列を標的とし得るポリヌクレオチド配列を有するように設計されていることを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドは、その配列のみを標的とすることに限定されないが、むしろ組成物として、キットにおいて、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を標的とするための方法において有用である。オリゴヌクレオチドは、試料からのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の検出のためのアッセイの構成成分として機能するように設計され、したがって試験試料中に一般的に見られる他の核酸の存在下でＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を標的とするように設計されている。「～に特異的にハイブリダイズする」とは、当該技術分野において理解されるように、非標的核酸へのある程度の小さいレベルのハイブリダイゼーションが起こり得るため、排他的にハイブリダイズすることを意味しない。むしろ、「～に特異的にハイブリダイズする」とは、試料中の標的核酸の正確な検出が決定され得るように、オリゴヌクレオチドが標的を主にハイブリダイズするようにアッセイにおいて機能するように構成されていることを意味する。「～するように構成された」という用語は、オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を示す。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸に関連して本明細書で使用される「断片」という用語は、連続する核酸の一部を指す。
本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、核酸の一部分を指し、その部分は、全核酸よりも小さい。例えば、参照における核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープライマーである場合、「領域」という用語は、全オリゴヌクレオチドのより小さいプロモーター部分を指すために使用され得る。非限定的な例として、参照における核酸がアンプリコンである場合、領域という用語は、プローブの標的ハイブリダイズ配列によるハイブリダイゼーションについて特定されたより小さいヌクレオチド配列を指すために使用され得る。
交換可能な用語「オリゴマー」、「オリゴ」、および「オリゴヌクレオチド」は、一般に１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の残基を有する核酸（約５ｎｔ残基の下限および約５００～９００ｎｔ残基の上限を有する範囲のポリマーを含む）を指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２～１５ｎｔの下限および約５０～６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲内にあり、他の実施形態は、約１５～２０ｎｔの下限および約２２～１００ｎｔの上限を有する範囲内にある。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製されてもよく、または様々な周知の酵素的もしくは化学的方法のいずれかを使用して合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する任意の特定の機能を示さず、むしろ、本明細書に記載される全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、それは、相補鎖に特異的であり、これにハイブリダイズすることができ、核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、プライマーとして機能し得、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写を可能にする場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得（例えば、Ｔ７プライマー）、標的核酸、またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、検出可能な部分（例えば、アクリジニウム－エステル化合物）をさらに提供する場合、標的核酸を検出するように機能し得る。
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、指定された参照核酸配列に「実質的に対応する」ことができ、これは、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と十分に類似し、これにより、オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするという点で、参照核酸配列と類似のハイブリダイゼーション特性を有することを意味する。当業者は、「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」が、参照配列とは異なり、それでもなお同じ標的核酸配列にハイブリダイズし得ることを理解するであろう。また、第２の核酸に対応する第１の核酸は、文脈上別段に明確な指示がない限り、そのＲＮＡまたはＤＮＡを含み、その相補体を含むことが理解される。核酸からのこの変化は、配列内の同一の塩基のパーセンテージ、またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基のパーセンテージの観点から記述され得る。したがって、特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、塩基同一性または相補性のこれらのパーセンテージが１００％～約８０％である場合、参照核酸配列に「実質的に対応する」。好ましい実施形態では、パーセンテージは、１００％～約８５％である。より好ましい実施形態では、このパーセンテージは、１００％～約９０％である。他の好ましい実施形態では、このパーセンテージは、１００％～約９５％である。同様に、核酸または増幅核酸の領域は、参照核酸配列に対応するものとして本明細書において参照され得る。当業者は、許容されないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こすことなく、特異的標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、様々なパーセンテージの相補性で必要とされ得るハイブリダイゼーション条件への様々な修正を理解するであろう。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の例示的な配列を以下の表１９に示す。具体的には、配列番号１８０および１９２～１９５は、それぞれ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅのリボソームＲＮＡ配列に対応する参照配列である。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の標的領域が配列番号１８０の定義された領域に「対応する」と本明細書に記載される場合、そのような参照は、配列番号１９２～１９５のうちのいずれか１つ以上の相同領域を含むことが理解される。また、配列番号１８０の定義された領域に「対応する」領域へのそのような参照は、試料中に存在し得る配列番号１８０および１９２～１９５のうちのいずれか１つ以上の天然に存在するバリアントの相同領域を含むことも理解される。
「増幅オリゴマー」は、その少なくとも３'末端が標的核酸に相補的であり、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの一例は、標的核酸にハイブリダイズし、増幅プロセスにおいてポリメラーゼによって伸長される３'ＯＨ末端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されないが（例えば、それが３'ブロック末端を有するため）、増幅に関与するかまたは増幅を促進するオリゴマーである。例えば、増幅オリゴヌクレオチドの５'領域は、標的核酸に対して非相補的であるプロモーター配列（「プロモータープライマー」または「プロモータープロバイダー」と呼ばれ得る）を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５'プロモーター配列を含むように修飾され得、したがってプロモータープライマーとして機能し得ることを理解するであろう。３'ブロック末端を組み込むことで、プロモータープライマーをさらに修飾し、これは、標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始するように作用する上流プロモーター配列を提供することができるが、オリゴ伸長のためのプライマーは提供しない。そのような修飾オリゴは、本明細書では「プロモータープロバイダー」オリゴマーと呼ばれる。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲には、約１０～約７０ｎｔ長であり（いかなるプロモーター配列またはポリＡテールも含まない）、少なくとも約１０個の連続する塩基、または標的核酸配列（もしくはその相補鎖）の領域に相補的である少なくとも１２個もの連続する塩基を含有するものが含まれる。連続する塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または完全に相補的である。増幅オリゴマーは任意に、修飾ヌクレオチドまたは類似体、あるいは増幅反応に関与するが、標的核酸またはテンプレート配列に相補的ではないか、またはこれに含有されていない追加のヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さについての範囲に言及する場合、その範囲はすべての整数を含む（例えば、長さが１９～２５個の連続するヌクレオチドには、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５個が含まれる）ことが理解される。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸に結合し、特定の部位でＲＮＡの転写を開始するシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識される特定の核酸配列である。
本明細書で使用される場合、「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」は、第１および第２の領域を含み、その３'末端からのＤＮＡ合成の開始を防ぐように修飾されるオリゴヌクレオチドを指す。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズする塩基配列を含み、ハイブリダイズ配列は、プロモーター領域の３'に位置するが、必ずしもこれに隣接する必要はない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分は、典型的には、長さが少なくとも１０個のヌクレオチドであり、長さが最大５０個以上のヌクレオチドまで伸長し得る。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む。プロモーターオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長することができないように操作され、好ましくは、上記のようにその３'末端にブロッキング部分を含む。本明細書で言及されるように、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供するブロックされたプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである。
「増幅」は、標的核酸配列もしくはその相補体またはその断片の複数のコピーを取得するための任意の既知の手順を指す。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と呼ばれ得る。既知の増幅方法には、熱サイクル法および等温増幅方法の両方が含まれる。いくつかの実施形態では、等温増幅方法が好ましい。レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅は、核酸増幅方法の非限定的な例である。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、および熱サイクルを使用して、ｄｓＤＮＡの、またはｃＤＮＡからの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号および米国特許第５，５１６，６６３号）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマー、および標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼを使用し、それによって一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅が起こる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号、米国特許第５，５４７，８６１号、および米国特許第５，６４８，２１１号）。好ましい実施形態は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）またはＮＡＳＢＡなどのＲＮＡ標的核酸の増幅に適した増幅方法を使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅方法におけるプライマーとして容易に使用され得ることは当業者に明らかである。
本明細書で「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）とも呼ばれる「転写関連増幅」は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅を指す。これらの方法は一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター配列を含み、任意に１つ以上の他のオリゴヌクレオチドを含み得るテンプレート相補的オリゴヌクレオチドを用いる。ＴＭＡ法は、本明細書に記載されるように、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的配列を増幅および検出するために使用される増幅方法の実施形態である。転写関連増幅の変化形は、以前に詳細に開示されたように当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、同第５，１２４，２４６号、同第５，１３０，２３８号、同第５，４３７，９９０号、同第５，５５４，５１６号、および同第７，３７４，８８５号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ８８／０１３０２号、同第ＷＯ ８８／１０３１５号、および同第ＷＯ ９５／０３４３０号）。当業者は、開示された組成物が、ポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づく増幅方法で使用され得ることを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「リアルタイムＴＭＡ」という用語は、リアルタイム検出手段によってモニターされる標的核酸の転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）を指す。
「増幅産物」と交換可能に使用される「アンプリコン」という用語は、標的配列内に含有される配列に相補的または相同である、増幅手順中に生成される核酸分子を指す。これらの用語は、一本鎖増幅産物、二本鎖増幅産物、または二本鎖増幅産物の鎖のうちの１つを指すために使用され得る。
「プローブ」、「検出プローブ」、「検出オリゴヌクレオチド」、および「検出プローブオリゴマー」は、標的配列または増幅核酸の検出を可能にするためにハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸または増幅核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを指すために、本明細書で交換可能に使用される。検出は、直接的（例えば、その標的配列に直接ハイブリダイズされたプローブ）または間接的（例えば、中間分子構造を介してその標的に連結されたプローブ）のいずれかであり得る。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせであってもよく、それらは、標識または非標識であってもよい。プローブの「標的配列」は一般に、標準的な塩基対合によってプローブオリゴマーの少なくとも一部分に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列内のより小さい核酸配列を指す。プローブは、プローブの三次元立体構造に寄与する標的特異的配列および他の配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国公開第２００６／００６８４１７号）。好ましい実施形態では、検出プローブは、２'メトキシ主鎖を含み、これは、より高いシグナルが得られる結果となり得る。
「ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ」という用語は、典型的には５'塩基上に蛍光色素、および典型的には３'塩基上に非蛍光消光色素（クエンチャー）を含有する、検出オリゴヌクレオチドを指す。照射されると、励起された蛍光色素は、蛍光を発するのではなく、すぐ近くの消光色素分子にエネルギーを伝達し、非蛍光基質をもたらす。増幅中、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がＴａｑＭａｎプローブを切断して、フルオロフォアをクエンチャーから分離し、それによって増幅の指標として、フルオロフォアから非消光シグナルが発せられることを可能にする。
本明細書で使用される場合、「標識」は、検出されるプローブまたは検出可能なシグナルを生じさせるプローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物を指す。直接標識は、共有結合または非共有相互作用、例えば、水素結合、疎水性およびイオン性相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通して起こり得る。間接標識は、直接的または間接的のいずれかで標識され、検出可能なシグナルを増幅し得る、結合対メンバー、抗体または追加のオリゴマーなどの架橋部分または「リンカー」の使用を通して起こり得る。標識には、放射性核種、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応性基、または発色団（例えば、検出可能な色を与える色素、粒子、もしくはビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光標識）、またはフルオロフォアなどの任意の検出可能な部分が含まれる。混合物中の結合した標識プローブが、非結合標識プローブとは異なる検出可能な変化、例えば、不安定性または異なる分解特性を示す均一アッセイにおいて、標識は検出可能であり得る。「均一で検出可能な標識」は、標識または標識されたプローブの結合形態から非結合形態を物理的に除去することなく検出され得る（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。標識には、化学発光化合物、例えば、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物（標準ＡＥおよび誘導体を含む）が含まれる（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）。標識を核酸に付着させ、標識を検出する合成および方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）第１０章、米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号）。２つ以上の標識、および２つ以上のタイプの標識が特定のプローブ上に存在してもよく、または検出は、各プローブが検出可能なシグナルを発生させる化合物で標識される、プローブの混合物を使用してもよい（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号）。
本明細書で使用される場合、「分子トーチ」と呼ばれる構造は、結合領域（「標的結合ドメイン」）によって接続され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の別個の領域（「閉鎖ドメイン」）を含むように設計されている。閉鎖ドメインを含むヌクレオチド配列の全部または一部はまた、標的結合ドメインとして機能し得る。したがって、閉鎖ドメインは、標的結合配列、非標的結合配列、およびそれらの組み合わせを含み得る。
本明細書で使用される場合、「分子ビーコン」と呼ばれる構造は、互いに相補的であり、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする配列が、その５'末端および３'末端の両方に隣接する標的結合配列を含むように設計されている。隣接する相補領域は、「スイッチ配列」と呼ばれ得る。
「捕捉プローブ」、「捕捉オリゴヌクレオチド」、「標的捕捉オリゴヌクレオチド」、および「捕捉プローブオリゴマー」は、標準的な塩基対合によって標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、固定化プローブ上の結合パートナーに結合して標的核酸を支持体に捕捉する核酸オリゴマーを指すために、本明細書において互換的に使用される。捕捉オリゴマーの一例は、２つの結合領域：標的ハイブリダイズ配列および固定化プローブ結合領域を含むオリゴヌクレオチドを含む。この例の変化形として、２つの領域は、１つ以上のリンカーによって一緒に結合された２つの異なるオリゴマー上に存在し得る。捕捉オリゴマーの別の実施形態では、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸に非特異的に結合し、標的核酸を支持体上の固定化プローブに連結するためのランダムまたは非ランダムのポリＧＵ、ポリＧＴ、またはポリＵ配列を含む配列である（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００８／０１６９８８号を参照）。固定化プローブ結合領域は、テールと呼ばれる核酸配列であり得る。テールは、支持粒子または支持マトリックスに付着した相補的な固定化配列に結合する、約１０～４０ヌクレオチド（例えば、Ａ１０～Ａ４０）または約１７～３３ｎｔ（例えば、Ｔ３Ａ１４～Ｔ３Ａ３０）の実質的にホモポリマーのテールを含む。したがって、好ましい核酸テールの非限定的な例は、いくつかの実施形態では、Ｔ０～４Ａ１０～４０配列を含み得る。捕捉オリゴマーの別の例は、２つの領域、標的ハイブリダイズ配列、および核酸配列ではない結合対メンバーを含む。
本明細書で使用される場合、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」、または「固定化核酸」は、捕捉オリゴマーを支持体に直接的または間接的に結合する核酸結合パートナーを指す。支持体に結合された固定化プローブは、試料中の非結合物質からの捕捉プローブ結合標的の分離を促進する。固定化プローブの一実施形態は、試料中の非結合物質からの結合標的配列の分離を促進する支持体に結合されたオリゴマーである。支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属、または他の組成物で作られてもよく、その一実施形態が磁気的に誘引可能な粒子である、溶液中で遊離のマトリックスおよび粒子などの既知の物質を含み得る。支持体は、固定化プローブが直接的に（共有結合、キレート化、もしくはイオン製相互作用を介して）、または間接的に（１つ以上のリンカーを介して）結合される、単分散磁性球（例えば、均一サイズ＋５％）であってもよく、プローブと支持体との間の結合もしくは相互作用は、ハイブリダイゼーション条件の間安定している。
説明
本発明は一般に、例えば、血液試料などの試料中の寄生原虫であるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための方法および組成物に関する。好適には、本明細書に記載される方法および組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘの存在または非存在を検出することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の検出のための方法を提供し、方法は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種からの標的核酸の増幅ベースの検出を実施することを含む。本発明はさらに、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘを含む）を検出するためのオリゴマーの組み合わせを含む、組成物（反応混合物を含む）およびキットを提供する。オリゴマーの組み合わせは一般に、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘを含む）を検出するための少なくとも２つの増幅オリゴマーを含み、例えば、捕捉プローブおよび／または検出プローブなど、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘを含む）の増幅ベースの検出を実施するための、本明細書に記載される１つ以上の追加のオリゴマーをさらに含んでもよい。
本発明は一般に、例えば、血液試料などの試料中の寄生原虫であるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための方法および組成物に関する。好適には、本明細書に記載される方法および組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘの存在または非存在を検出することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の検出のための方法を提供し、方法は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種からの標的核酸の増幅ベースの検出を実施することを含む。本発明はさらに、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘを含む）を検出するためのオリゴマーの組み合わせを含む、組成物（反応混合物を含む）およびキットを提供する。オリゴマーの組み合わせは一般に、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘを含む）を検出するための少なくとも２つの増幅オリゴマーを含み、例えば、捕捉プローブおよび／または検出プローブなど、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘを含む）の増幅ベースの検出を実施するための、本明細書に記載される１つ以上の追加のオリゴマーをさらに含んでもよい。
対象からの試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を検出するための方法は一般に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸の試料中の特異的検出のための核酸ベースの検出アッセイを実施することを含む。核酸ベースの検出アッセイは一般に、試料中にある疑いがある他の核酸との交差反応性は最小限で、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを利用する。いくつかの変化形では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の核酸ベースの検出のためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせは、最小限のＢａｂｅｓｉａ種（例えば、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）核酸との交差反応性を有する。
本発明の特定の態様では、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための、少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせが提供される。典型的には、オリゴマーの組み合わせは、配列番号１８０の領域に対応するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域を増幅するための、少なくとも第１および第２の増幅オリゴマーを含む。そのような実施形態では、少なくとも１つの増幅オリゴマーは、センス配向の標的ハイブリダイズ配列（「センスＴＨＳ」）を含み、少なくとも１つの増幅オリゴマーは、アンチセンス配向の標的ハイブリダイズ配列（「アンチセンスＴＨＳ」）を含み、増幅オリゴマーのセンスＴＨＳおよびアンチセンスＴＨＳは各々、配列番号１８０内に含有される配列に対応するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されており、標的ハイブリダイズ配列は、アンチセンスＴＨＳによって標的化されるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ配列が、センスＴＨＳによって標的化されるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ配列の下流に位置するように選択される（すなわち、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、それらが増幅される標的領域に隣接するように位置している）。
いくつかの実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域は、ヌクレオチド位置約８４４またはヌクレオチド位置約９１０から、ヌクレオチド位置約１０３８、ヌクレオチド位置約１０５１、ヌクレオチド位置約１０６０、またはヌクレオチド位置約１０７７までの配列番号１８０の領域に対応する。他の実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域は、ヌクレオチド位置約１１５３、ヌクレオチド位置約１１６９、またはヌクレオチド位置約１１８２から、ヌクレオチド位置約１３２７、ヌクレオチド位置約１３５４、またはヌクレオチド位置約１３８２までの配列番号１８０の領域に対応する。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２１～５６、８０～１０２、および１８２～１８４のうちのいずれか１つに示される配列に実質的に対応するか、またはそれと同一である、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む増幅オリゴマーを含む。そのような変化形では、オリゴマーの組み合わせは、上記のオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列とは反対の極性（センス対アンチセンスまたはその逆）のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも１つの増幅オリゴマーを含み、これにより、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、増幅される標的領域に隣接する。
いくつかの実施形態では、組成物は、（１）以下の表１に示される少なくとも１つのセンスオリゴマー配列に実質的に対応するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの増幅オリゴマーと、（２）表１に示される少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー配列に実質的に対応するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの増幅オリゴマーとを含む。特定の変化形では、増幅オリゴマーの組み合わせのセンスおよび／またはアンチセンス標的ハイブリダイズ配列（複数可）は、表１から選択されるセンスおよび／またはアンチセンス配列（複数可）を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７または配列番号１６８を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーとを含む。いくつかのそのような実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）（ｉ）の増幅オリゴマーを含み、ここで、標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、３５、５４、および５５から選択されるか、または標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列（例えば、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、および３５から選択される標的ハイブリダイズ配列）を含む。さらに他の実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）（ｉｉ）の増幅オリゴマーを含み、ここで、標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６７の配列（例えば、配列番号２８～３１、３４、４０、４１、および４９～５１から選択される標的ハイブリダイズ配列）を含むか、または標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６８の配列（例えば、配列番号３８、３９、４３、４４、および５３から選択される標的ハイブリダイズ配列）を含む。上記のオリゴマーの組み合わせの特定の実施形態では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号８０～８２および８５～１００から選択される。他の実施形態では、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７１の配列（例えば、配列番号８１、８２、８５、８７～９０、９４、および９６～９８から選択される標的ハイブリダイズ配列）を含むか、または配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７２の配列（例えば、配列番号８０、８２、８５、および８７～１００から選択される標的ハイブリダイズ配列）を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ'）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、（ｂ'）配列番号１８８の配列に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーとを含む。いくつかの実施形態では、（ａ'）の増幅オリゴマーは、配列番号３７、４６、１８３、および１８４から選択される標的ハイブリダイズ配列、または配列番号１８６の配列（例えば、配列番号１８３もしくは配列番号１８４の標的ハイブリダイズ配列）に含有される標的ハイブリダイズ配列を含む。特定の実施形態では、（ｂ'）の増幅オリゴマーは、配列番号８３、８４、および１８２から選択される標的ハイブリダイズ配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載される増幅オリゴマーは、標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含み、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸に対して非相補的である、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。例えば、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、上記の（ｂ）または（ｂ'）の増幅オリゴマーは、５'プロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーである。特定の実施形態では、プロモーター配列は、例えば、配列番号１７９に示される配列を有するＴ７プロモーター配列などの、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である。特定の変化形では、増幅オリゴマーは、配列番号５７～７７および１８１から選択される、示される配列を有するプロモータープライマーである。
表２は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の検出のための、増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列（「Ａｍｐ １」および「Ａｍｐ ２」）の特に好適な組み合わせを示す。
いくつかの実施形態では、上記のオリゴマーの組み合わせは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域に隣接する、少なくとも２つのセンス増幅オリゴマーおよび／または少なくとも２つのアンチセンス増幅オリゴマーを含む。例えば、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）各々が、長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも２つの増幅オリゴマー（例えば、２つもしくは３つの増幅オリゴマー）、および／または（ｂ）各々が、長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、もしくは配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも２つの増幅オリゴマー（例えば、２つもしくは３つの増幅オリゴマー）を含み得る。いくつかのそのような変化形では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列）を含む、第１の増幅オリゴマーと、（ｂ）配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号５３の標的ハイブリダイズ配列）を含む、第２の増幅オリゴマーとを含む。少なくとも２つのセンス増幅オリゴマーおよび／または少なくとも２つのアンチセンス増幅オリゴマーを含む他の実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、および（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、ならびに／または（ｂ）各々が、長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、もしくは配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも２つの増幅オリゴマー（例えば、２つもしくは３つの増幅オリゴマー）を含む。いくつかのそのような変化形では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）（ｉ）配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号２１の標的ハイブリダイズ配列）を含む、増幅オリゴマーと、（ａ）（ｉｉ）配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列）を含む増幅とを含む。（ｂ）の少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーを含み、各々は、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む（例えば、配列番号９４の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマー、および配列番号９５の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１８０の相補体に含有される配列に実質的に対応する配列である、標的ハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している。好適な捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドである配列を含み、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０から選択される配列に実質的に対応する配列を含む（例えば、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０から選択される配列を含むか、またはそれからなる標的ハイブリダイズ配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む））。いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１～５、７、９、および１０から選択される配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマー（例えば、上記の少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマー）を含む。配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の捕捉プローブオリゴマー（例えば、配列番号９の配列を含む捕捉プローブオリゴマー）、および配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の捕捉プローブオリゴマー（例えば、配列番号１０の配列を含む捕捉プローブオリゴマー）は、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせで一緒に使用するのに特に適している。
特定の変化形では、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域を標的とする少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用して増幅可能である、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域が、ヌクレオチド位置約８４４またはヌクレオチド位置約９１０から、ヌクレオチド位置約１０３８、ヌクレオチド位置約１０５１、ヌクレオチド位置約１０６０、またはヌクレオチド位置約１０７７までの配列番号１８０の領域に対応するいくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、ヌクレオチド位置約９５１からヌクレオチド位置約９９８までの配列番号１８０の領域またはその完全な相補体に対応する標的領域に特異的にハイブリダイズする検出プローブオリゴマーを含む。例えば、検出プローブオリゴマーは、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１９６またはその相補体の配列に含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８から選択される配列（その相補体を含む）を含む、標的ハイブリダイズ配列を含み得る。より具体的な変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９７の配列またはその相補体に含有され、（ｉｉ）配列番号１７４または配列番号１７５の配列（その相補体を含む）を含む。他の変化形では、検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１９６の配列またはその相補体に含有され、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８から選択される配列（その相補体を含む）を含む。特に好適な検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体を含む）を含む。好適な検出プローブは、上記のいずれかのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラをさらに含む。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域が、ヌクレオチド位置約１１５３、ヌクレオチド位置約１１６９、またはヌクレオチド位置約１１８２から、ヌクレオチド位置約１３２７、ヌクレオチド位置約１３５４、またはヌクレオチド位置約１３８２までの配列番号１８０の領域に対応するいくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、ヌクレオチド位置約１２１０からヌクレオチド位置約１２３３までの配列番号１８０の領域またはその完全な相補体に対応する標的領域に特異的にハイブリダイズする検出プローブオリゴマーを含む。例えば、検出プローブオリゴマーは、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１８９の配列またはその相補体に含有され、（ｉｉ）配列番号１９０および配列番号１９１から選択される配列（その相補体を含む）を含む、標的ハイブリダイズ配列を含み得る。特に好適な検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２５～１３０および１４３（その相補体を含む）を含む。好適な検出プローブは、上記のいずれかのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラをさらに含む。
表３は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の検出のための、検出プローブ標的ハイブリダイズ配列と、第１および第２の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列（「Ａｍｐ １」および「Ａｍｐ ２」）との例示的な組み合わせを示す。
いくつかの変化形では、オリゴマーの組み合わせは、少なくとも２つの検出プローブオリゴマー（例えば、本明細書に記載される少なくとも２つの特定の検出プローブ）を含む。例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域は、ヌクレオチド位置約８４４またはヌクレオチド位置約９１０から、ヌクレオチド位置約１０３８、ヌクレオチド位置約１０５１、ヌクレオチド位置約１０６０、またはヌクレオチド位置約１０７７までの配列番号１８０の領域に対応し、オリゴマーの組み合わせは、（Ａ）（ｉ）配列番号１９７の配列またはその相補体に含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列またはその相補体を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の検出プローブオリゴマーと、（Ｂ）（ｉ）配列番号１９７の配列またはその相補体に含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列またはその相補体（上記のＤＮＡ等価物またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、第２の検出プローブオリゴマーとを含み得る。第１および第２の検出プローブオリゴマーの特に好適な組み合わせは、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第１の検出プローブオリゴマーと、配列番号１４８および配列番号１５２から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、第２の検出プローブオリゴマーとを含む。
検出プローブオリゴマーは、核酸主鎖の１つ以上の連結で２'－メトキシ主鎖を含有し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーは、アンプリコン検出反応混合物中に提供される。
典型的には、本発明による検出プローブオリゴマーは、標識をさらに含む。特に好適な標識には、検出可能な光シグナルを発する化合物、例えば、均一な混合物中で検出され得るフルオロフォアまたは発光（例えば、化学発光）化合物が含まれる。２つ以上の標識、および２つ以上のタイプの標識が特定のプローブ上に存在してもよく、または検出は、各プローブが、検出可能なシグナルを発生させる化合物で標識される、プローブの混合物を使用することに依存し得る（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号（各々が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに付着し得るが、好ましくは、標識は、共有結合する。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物（例えば、米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４（各々が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）などの付着した化学発光標識を有し、これは、典型的な変化形では、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに付着している（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号、同第５，６５６，７４４号、および同第５，６３９，６０４号、特に１０列目の６行目から１１列目の３行目、および実施例８（各々が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。他の実施形態では、検出プローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイにおいて特に有用である組み合わせである、蛍光標識およびクエンチャーの両方を含む。そのような検出プローブの特定の変化形には、例えば、ＴａｑＭａｎ検出プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ならびに「分子ビーコン」（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９－５３，１９９８、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号（各々が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）が含まれる。
本発明による検出プローブオリゴマーは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含み得る。そのような検出プローブの特定の実施形態は、例えば、一般にヘアピンと呼ばれる立体構造などの、分子内ハイブリダイゼーションによって保持される立体構造を形成するプローブを含む。特に好適なヘアピンプローブには、「分子トーチ」（例えば、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号（各々が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）、ならびに「分子ビーコン」（例えばＴｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．、上記、ＵＳ５，１１８，８０１およびＵＳ５，３１２，７２８、上記を参照）が含まれる。そのようなヘアピンプローブを使用するための方法は、当該技術分野でよく知られている。
さらに他の実施形態では、検出プローブは、分子内結合によって保持される立体構造を実質的に形成しない線状オリゴマーである。特定の変化形では、線状検出プローブオリゴマーは、標識として化学発光化合物、好ましくは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物）を含む。
また、本明細書に記載される検出プローブオリゴマー、捕捉プローブオリゴマー、およびそれらの組み合わせが、本発明によって提供される。
他の態様では、本発明は、対象からの試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を検出するための方法を提供する。そのような方法は一般に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸の試料中の特異的検出のための核酸ベースの検出アッセイを実施することを含む。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の特異的検出のための核酸ベースの検出アッセイは、本明細書に記載される任意の１つ以上のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種特異的オリゴマー（例えば、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせ、または本明細書に記載される検出プローブもしくは検出プローブの組み合わせ）を使用し得る。本発明による核酸ベースの検出アッセイからの陽性シグナルは、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、および／またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘうちの１つ以上の存在を示す。
核酸ベースの検出アッセイの使用を含む方法のいくつかの実施形態では、増幅ベースのアッセイは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を検出するために使用される。そのような増幅ベースのアッセイ法は一般に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域の核酸増幅を実施することと、増幅産物を検出すること（例えば、増幅産物を、試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在を示すシグナルを提供する核酸検出プローブと特異的にハイブリダイズさせることによって）とを含む。増幅ステップは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸が試料中に存在する場合に、試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸中の標的配列に特異的な１つ以上の増幅オリゴマーと接触させて、増幅産物を産生することを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも２つの増幅オリゴマーの組み合わせは、増幅ステップで使用される。増幅は、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼおよび増幅オリゴマーを使用して、テンプレート鎖からコピーを産生することによって（例えば、テンプレート鎖を使用してプライマーから配列を伸長することによって）、標的配列またはその相補体の追加のコピーを合成する。好適な増幅方法としては、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。そのような増幅方法は、当該技術分野でよく知られており（例えば、上記の定義セクションの増幅方法の考察を参照）、本開示の方法に従って容易に使用される。
増幅産物の検出は、増幅標的配列に特異的に関連するシグナルを検出するための様々な方法によって達成され得る。核酸は、検出可能な電気的変化などの物理的変化をもたらす表面と会合し得る。増幅核酸は、それらをマトリックスの中または上で濃縮し、核酸もしくはそれらに関連する色素（例えば、臭化エチジウムもしくはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出するか、または溶液相中の核酸に関連する色素の増加を検出することによって検出され得る。他の検出法は、増幅産物を、増幅産物中の配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブと接触させることと、プローブ：産物複合体の存在を検出することとを含むか、または増幅産物と会合した検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を使用することによる、ハイブリダイズステップを使用し得る（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、および同第５，８４９，４８１号）。増幅産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。いくつかの実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の検出のための増幅ベースのアッセイを利用する方法は、増幅産物の検出のために本明細書に記載される１つ以上の検出プローブオリゴマーを利用する。
相補的増幅配列にハイブリダイズする検出プローブは、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴマー、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドの組み合わせを含有するオリゴマー、または修飾された主鎖で合成されたオリゴマー、例えば、１つ以上の２'－メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマーであり得る。増幅配列の検出に使用されるプローブは、非標識であり、間接的に（例えば、プローブ上の部分への別の結合パートナーの結合によって）検出され得るか、または様々な検出可能な標識で標識され得る。転写媒介増幅（ＴＭＡ）を使用する特定の実施形態などの、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を検出するための方法のいくつかの実施形態では、検出プローブは、例えば、線状アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブなどの線状化学発光標識プローブである。検出するステップは、例えば、その核酸塩基配列の全部または一部分など、増幅配列に関する追加の情報も提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施されてもよく、または例えば、リアルタイムでの標的領域の増幅と同時に実施されてもよい。一実施形態では、検出するステップは、均一な検出、例えば、混合物からハイブリダイズされていないプローブを除去することなくハイブリダイズされたプローブを検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号を参照）。
増幅ステップの終わり間近または終わりに増幅産物を検出する実施形態では、増幅産物へのプローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルを提供するために、線状検出プローブが使用され得る。そのような検出の一例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識プローブを使用する。次いで、発光標識は、ハイブリダイズされていないプローブから加水分解される。検出は、ルミノメーターを使用する化学発光によって実施される（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ８９／００２４７６号を参照）。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出プローブは、例えば、プローブが増幅産物に結合するときに検出されるレポーター部分で標識される分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブなどのヘアピンプローブであってもよい。そのようなプローブは、標的ハイブリダイズ配列および非標的ハイブリダイズ配列を含み得る。そのようなプローブの様々な形態は、以前に記載されている（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６００６８４１７Ａ１号および同第２００６０１９４２４０Ａ１号を参照）。
ＴＭＡ増幅を使用するいくつかの増幅方法は、以下のステップを含む。簡潔に、増幅される配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。当業者は、二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の従来の融解が、一本鎖標的核酸を提供するために使用され得ることを理解するであろう。プロモータープライマーは、その標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖をテンプレートとして使用してプロモータープライマーの３'末端を伸長して、標的配列鎖のｃＤＮＡコピーを作製し、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖をもたらす。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を消化し、第２のプライマーは、プロモータープライマー末端の下流のｃＤＮＡ鎖上に位置するその標的配列に特異的に結合する。次いで、ＲＴは、第１のｃＤＮＡをテンプレートとして使用して第２のプライマーの３'末端を伸長することによって、新たなＤＮＡ鎖を合成して、機能的プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを作製する。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼが転写を開始して、反応の最初の標的鎖の約１００～１０００増幅コピー（「アンプリコン」）であるＲＮＡ転写物を産生する。第２のプライマーがアンプリコンの各々におけるその標的配列に特異的に結合するときに増幅は継続し、ＲＴは、アンプリコンＲＮＡテンプレートからＤＮＡコピーを作製して、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を産生する。反応混合物中のＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からアンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーは、新たに合成されたＤＮＡにおけるその相補配列に特異的に結合する。ＲＴは、プロモータープライマーの３'末端を伸長して、ＲＮＡポリメラーゼが結合して標的鎖に相補的である追加のアンプリコンを転写する機能的プロモーターを含有するｄｓＤＮＡを作製する。より多くのアンプリコンコピーを作製する自己触媒サイクルは、反応の過程において繰り返され、試料に存在する標的核酸の約１０億倍の増幅をもたらす。増幅産物は、増幅産物に含有される標的配列に特異的に結合するプローブを使用することによって、増幅中または増幅反応の終わりにリアルタイムで検出され得る。結合したプローブから生じるシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。
いくつかの実施形態では、方法は、「逆方向」ＴＭＡ反応を利用する。そのような変化形では、最初のまたは「順方向」増幅オリゴマーは、標的領域の３'末端の近くで標的核酸にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。逆転写酵素（ＲＴ）は、標的核酸をテンプレートとして使用してプライマーの３'末端を伸長することによって、ｃＤＮＡ鎖を合成する。第２のまたは「逆方向」増幅オリゴマーは、合成されたｃＤＮＡ鎖内に含有される標的配列にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を有する、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第２の増幅オリゴマーがプロモータープライマーである場合、ＲＴは、ｃＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用してプロモータープライマーの３'末端を伸長して、標的配列鎖の第２のｃＤＮＡコピーを作製し、それによって機能的プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡを作製する。次いで、増幅は、ＲＮＡポリメラーゼを利用するプロモーター配列からの転写の開始について、本質的に上記のように継続する。あるいは、第２の増幅オリゴマーがプロモータープロバイダーである場合、標的領域の５'末端の近くにある標的配列にハイブリダイズする終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、終結オリゴヌクレオチドの３'末端でプライミングオリゴマーの伸長を終結させ、それによってプライミングオリゴマーからの伸長によって合成された最初のｃＤＮＡ鎖に定義された３'末端を提供するために利用される。次いで、プロモータープロバイダーの標的ハイブリダイズ配列は、最初のｃＤＮＡ鎖の定義された３'末端にハイブリダイズし、ｃＤＮＡ鎖の３'末端は、伸長されて、プロモータープロバイダーのプロモーター配列に相補的な配列が追加され、二本鎖プロモーター配列の形成をもたらす。次いで、最初のｃＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用して、二本鎖プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して、プロモーター部分を含まない最初のｃＤＮＡ鎖に相補的な複数のＲＮＡ転写物を転写する。これらのＲＮＡ転写物の各々は、最初のプライミング増幅オリゴマーからのさらなる増幅のためのテンプレートとして機能するために利用可能である。
核酸ベースの検出アッセイの使用を含む方法のいくつかの実施形態では、非増幅ベースのアッセイは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を検出するために使用される。いくつかのそのような実施形態では、非増幅ベースのアッセイは、特定の検出プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを含むハイブリダイゼーションアッセイである。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施するための方法は、当該技術分野で十分に開発されてきた。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、用途に応じて異なり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００２）、およびＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）で言及されているものを含む、既知の一般的な結合方法に従って選択される。一般に、プローブおよび試料は、特定の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合され、次いで、プローブのそのそれぞれの標的への特定のハイブリダイゼーションが検出される。核酸ハイブリダイゼーションは、様々なアッセイ形式に適応できる。１つの好適な形式はサンドイッチアッセイ形式であり、これは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応できる。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は、固体支持体であり、これは、非標識であり、かつＤＮＡ配列の一部分に相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着または共有結合させている。標的核酸は、固定化プローブにハイブリダイズされ、固定化された非標識核酸プローブがハイブリダイズされる同じＤＮＡ鎖の第２の異なる領域に相補的である第２の標識検出プローブが、［標的核酸］：［固定化プローブ］二重鎖にハイブリダイズされて、標的核酸を検出する。別の例示的な形式は、シグナル伝達物質として好適な電極表面上に固定化された非標識検出プローブにハイブリダイズした、標的核酸の電気化学的検出を利用する。例えば、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１１９２，２００３、Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １４：１１４９，２００２、Ｗａｎｇ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４６９：６３，２００２、Ｃａｇｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｓ ９：３１２２，２００９、Ｋａｔｚ ａｎｄ Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １５：９１３，２００３、Ｄａｎｉｅｌｓ ａｎｄ Ｐｏｕｒｍａｎｄ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １９：１２３９，２００７を参照されたい。
ハイブリダイゼーションアッセイを含むＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を検出するための方法の特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイは、本明細書に記載される１つ以上の検出プローブオリゴマーを利用する。
いくつかの実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を検出するための非増幅ベースのアッセイは、切断ベースのアッセイであり、ここで、非標的ハイブリダイズフラップ領域を含有するプローブオリゴヌクレオチドが、フラップエンドヌクレアーゼによって重複依存的に切断されて、切断産物が放出され、それが次いで検出される。例示的な切断ベースのアッセイ試薬は、例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２９２－２９６，１９９９）、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：１３５－１４４，１９９９）、およびＡｌｌａｗｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３４４３－３４４７，２００６）に記載されている。
フラップエンドヌクレアーゼ反応の適切な条件は、既知であるか、または当該技術分野で既知の方法を使用して容易に決定され得る（例えば、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８－７２１３９４，１９９９を参照）。方法で使用され得る例示的なフラップエンドヌクレアーゼには、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、哺乳動物ＦＥＮ－１、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＦＥＮ－１、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＦＥＮ－１、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｉｉｒｉｏｓｕｓ ＦＥＮ－１、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＦＥＮ－１、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＦＥＮ－１、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＴＨ１、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＡＤ２７、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ｒａｄ２、バクテリオファージＴ５ ５'－３'エキソヌクレアーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ＦＥＮ－１、ヒトエンドヌクレアーゼ１、仔ウシ胸腺５'－３'エキソヌクレアーゼ（真正細菌、真核生物、および古細菌中のその相同体を含む）、例えば、構造特異的酵素のクラスＩＩファミリーのメンバー、ならびに酵素的に活性なその変異体またはバリアントが含まれる。フラップエンドヌクレアーゼの説明は、例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７７８－７８３，１９９３、Ｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６７３－６７６，２００１、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．２３：１７１－１７３，１９９８、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８７－２１３９４，１９９９、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２４６９３－２４７００，２０００、Ａｌｌａｗｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：５３７－５５４，２００３、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３４８７－２３４９６，２００３、およびＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４５０－４５６，２００４に見られる。
特定の変化形では、切断ベースのアッセイは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のＲＮＡ標的核酸を検出し、切断ベースのアッセイは、切断が可能であるフラップエンドヌクレアーゼおよびＲＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を利用する。いくつかの代替の実施形態では、切断ベースのアッセイは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のＤＮＡ標的核酸を検出し、切断ベースのアッセイは、切断が可能であるフラップエンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を利用する。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を切断することができる例示的なフラップエンドヌクレアーゼには、Ｔｈｅｒｍｕｓ属のポリメラーゼ欠損５'ヌクレアーゼ、ならびに特定のＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）酵素（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、例えば、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＢＮ（ＴａｑポリメラーゼのＢｓｔＸ－Ｎｏｔｌ欠失、米国特許第５，６１４，４０２号を参照）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＩＩ（完全長Ｔａｑポリメラーゼの「ＡＧ」変異体、米国特許第５，６１４，４０２号を参照）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＶＩＩ（（完全長Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼの合成欠損変異）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＩＸ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ欠損変異体）、およびＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＸＩＩ（ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの断片から構築されたポリメラーゼ欠損キメラポリメラーゼ）が含まれる。ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を切断することができる例示的なフラップエンドヌクレアーゼには、上記のフラップエンドヌクレアーゼ、ならびにＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）２．０（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＦＥＮ－１）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）２．１（Ｃ末端上に６つのヒスチジンを有するＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＦＥＮ－１）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）３．０（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ ＦＥＮ－１）、およびＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）３．１（Ｃ末端上に６つのヒスチジンを有するＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ ＦＥＮ－１）が含まれる。
いくつかの実施形態では、切断ベースのアッセイは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のＲＮＡ標的核酸を検出し、アッセイは、ＲＮＡ標的領域のＤＮＡ相補体を合成するためのステップを含み、次いで、そのｃＤＮＡ鎖は、重複する第１および第２のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断のための線状二重鎖切断構造を形成する。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用して、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを合成するための反応条件は、当該技術分野でよく知られている。
核酸ベースの検出アッセイを利用する特定の実施形態では、方法は、試料中の他の構成成分からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を精製することをさらに含む。そのような精製は、試料中に含有される生物を他の試料構成成分から分離および／または濃縮する方法を含み得る。特定の実施形態では、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕捉して、他の試料構成成分から標的核酸を特異的または非特異的に分離することを含む。非特異的標的捕捉方法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、他の試料構成成分を除去するために洗浄される支持体への核酸の付着、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸と他の試料構成成分とを含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を伴ってもよい。いくつかの実施形態では、精製は、例えば、血球（例えば、赤血球）などの細胞の試料を溶解することと、溶解細胞試料からいかなるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸も精製することとを含む。本発明に従って使用される例示的な溶解試薬および方法は、米国特許第１０，０９３，９８９号およびＰＣＴ公開第ＷＯ ２０１７／１８９７４６号に記載されており、各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の標的核酸は、標的核酸を捕捉プローブオリゴマーにハイブリダイズすることによって、他の試料構成成分から分離される。捕捉プローブオリゴマーは、他の試料構成成分から分離された［標的核酸］：［捕捉プローブ］複合体を形成するように、標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズするように構成された、標的ハイブリダイズ配列を含む。標的核酸の非特異的捕捉に適した標的ハイブリダイズ配列を含む捕捉プローブは、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００８／０１６９８８号に記載されている。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列（複数可）を含むいくつかの特定の変化形では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種特異的捕捉プローブは、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０から選択される配列に実質的に対応する配列を含む、標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０から選択される配列を含むか、またはそれからなる標的ハイブリダイズ配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む））を含む。好ましい変化形では、捕捉プローブは、［標的核酸］：［捕捉プローブ］複合体を固定化プローブに結合して、試料から分離され、必要に応じて、非標的試料構成成分を除去するために洗浄された［標的核酸］：［捕捉プローブ］：［固定化プローブ］複合体を形成する（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号、同第６，２８０，９５２号、および同第６，５３４，２７３号を参照）。そのような変化形では、捕捉プローブオリゴマーは、捕捉プローブを、その結合された標的配列と共に、固体支持体に付着した固定化プローブに結合し、それによってハイブリダイズされた標的核酸が他の試料構成成分から分離されることを可能にする、配列または部分をさらに含む。
より具体的な実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、米国特許第６，１１０，６７８号にすでに記載されているように、標的核酸に相補的ではないが、固定化プローブ上の配列に特異的にハイブリダイズし、それによって標的核酸が他の試料構成成分から分離されることを可能にする部分として機能する、テール部分（例えば、３'テール）を含む。任意の配列は、一般に約５～５０ｎｔ長であるテール領域で使用され得、好ましい実施形態は、約１０～４０ｎｔ（例えば、Ａ１０～Ａ４０）、より好ましくは約１４～３３ｎｔ（例えば、Ａ１４～Ａ３０またはＴ３Ａ１４～Ｔ３Ａ３０）の実質的にホモポリマーのテールを含み、これは、固体支持体、例えば、マトリックスまたは粒子に付着した相補的な固定化配列（例えば、ポリＴ）に結合する。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列（複数可）を含むいくつかのそのような実施形態では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種特異的捕捉プローブは、配列番号１～５、７、９、および１０から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
標的捕捉は、典型的には、ハイブリダイズ条件下、通常は［テール配列］：［固定化プローブ配列］二重鎖のＴｍよりも高い温度で、標的核酸にハイブリダイズする１つ以上の捕捉プローブオリゴマーを含有する液相混合物中で生じる。捕捉プローブテールを含む実施形態に関して、［標的核酸］：［捕捉プローブ］複合体は、捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調整することによって捕捉され、次いで、固体支持体上の複合体全体が他の試料構成成分から分離される。付着した［固定化プローブ］：［捕捉プローブ］：［標的核酸］を有する支持体は、１回以上洗浄されて、他の試料構成成分をさらに除去することができる。好ましい実施形態は、常磁性ビーズなどの粒子状固体支持体を使用し、これにより、付着した［標的核酸］：［捕捉プローブ］：［固定化プローブ］複合体を有する粒子が洗浄液中で懸濁され、好ましくは磁気引力を使用して、洗浄液から回収され得る。増幅ベースの検出アッセイの使用を含む方法の実施形態では、取り扱いステップの数を制限するために、標的核酸は、支持体上の複合体中の標的核酸を増幅オリゴマーと単純に混合し、増幅ステップを進めることによって、増幅され得る。
本開示によると、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を検出することは、別々に（例えば、別々の反応槽内で）実施され得るか、または多重反応システムとして別のアッセイと一緒に実施され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、多重反応を利用し、反応混合物は、複数の（例えば、少なくとも２、３、４、またはそれ以上の）異なる標的配列を並行してアッセイするための試薬を含有する。これらの場合、反応混合物は、検出アッセイを実施するための複数の異なる標的特異的オリゴヌクレオチドを含有し得る。例えば、増幅ベースの検出アッセイを利用する方法では、多重反応は、増幅オリゴマーの複数のセット（例えば、複数の対）（例えば、ＰＣＲプライマーの複数の対またはＴＭＡ増幅オリゴマーの複数の対（例えば、ＴＭＡについて、プロモータープライマーと非プロモータープライマーの複数の対、またはプロモータープロバイダーと非プロモータープライマーの複数の対））を含有し得る。切断ベースの検出アッセイを利用する他の実施形態では、多重反応は、異なるフラップを有する複数のプローブオリゴヌクレオチド、複数の異なる重複プローブオリゴヌクレオチド、およびいったん切断されると異なるフラップを検出するための複数の異なるＦＲＥＴカセットを含み得る。
本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせは、オリゴマーを含む反応混合物またはキットの形態であり得る。反応混合物またはキットは、例えば、捕捉プローブ核酸または捕捉プローブ核酸のアレイなどの多数の任意の構成成分をさらに含み得る。増幅反応混合物について、反応混合物は、典型的には、インビトロ増幅を実施するのに適した他の試薬、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、逆転写酵素および／もしくはＲＮＡポリメラーゼ）を含み、典型的には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸が存在しても存在しなくてもよい試験試料構成成分を含む。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の増幅のためのオリゴマーの組み合わせを含むキットはまた、インビトロ増幅を実施するのに適した他の試薬、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、逆転写酵素および／もしくはＲＮＡポリメラーゼ）を含む。共通の標的核酸を標的とする増幅オリゴマーの組み合わせと共に、検出プローブを含むオリゴマーの組み合わせ（例えば、反応混合物またはキット）について、増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって連結される（すなわち、組み合わせは、増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含む）。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ核酸の検出のための組成物、方法、反応混合物、システム、キットなどは、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
「寄生虫輸送溶液」は、一般に、試料を保存するために製剤化され、場合によっては、試料中の１つ以上の細胞型を少なくとも部分的に溶解するように製剤化された溶液を指す。１つの例示的な寄生虫輸送溶液は、１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、および１１０ｍＭのラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ｐＨ６．７を含む。別の例示的な寄生虫輸送溶液は、１００ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの塩化マグネシウム、および６％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、ｐＨ７．５の水溶液を含む。さらなる例示的な寄生虫輸送溶液は、１４ｍＭの重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化アンモニウム、５％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、７．４のｐＨ７．４の水溶液を含む。寄生虫輸送溶液の他の製剤も同様に十分に作用し得る。
「標的捕捉試薬」は、一般に、溶液からの核酸の捕捉を促進する多数の構成成分を含有する溶液を指す。１つの例示的な標的捕捉試薬は、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３１０ｍＭの水酸化リチウム、１．８８Ｍの塩化リチウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．４、およびｄＴ１４オリゴマーが共有結合した２５０μｇ／ｍＬの磁性粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ－ＭＡＧ＾ＴＭ ＭＧ－ＣＭ粒子、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。別の例示的な標的捕捉試薬は、７９０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４５３ｍＭの水酸化リチウム、１０％ｗ／ｖのＬＬＳ、２３０ｍＭのコハク酸、０．０３％ｗ／ｖのＦｏａｍ Ｂａｎ ＭＳ－５７５、およびｄＴ１４オリゴマーが共有結合した０．０１２５％ｗ／ｖの磁性粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ－ＭＡＧ＾ＴＭ ＭＧ－ＣＭ粒子、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。標的捕捉試薬の他の製剤も同様に十分に作用し得る。
「洗浄液」とは、一般に、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、６．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、および０．１％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含有する溶液を指す。
「プローブ試薬」は、一般に、１つ以上の標識された検出プローブを含有する溶液を指す。１つの例示的なプローブ試薬は、約７５～約１００ｍＭのコハク酸リチウム、２％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、１５ｍＭのメルカプトエタンスルホネート、１．２Ｍの塩化リチウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ、および３％（ｖ／ｖ）のエタノール、ｐＨ４．７で構成される溶液である。別の例示的なプローブ試薬は、約７５～約１００ｍＭのコハク酸、３．５％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、７５ｍＭの水酸化リチウム、１５ｍＭのアルドリチオール－２、１．０Ｍの塩化リチウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、および３．０％（ｖ／ｖ）のエタノール、ｐＨ４．１～４．３で構成される溶液である。他の製剤も同様に十分に作用し得る。
「増幅試薬」は、一般に、増幅反応を促進するための反応構成成分の濃縮混合物を指す。増幅試薬は、例えば、増幅タイプ（ＰＣＲ、ＴＭＡなど）、標的核酸（ＧＣ含有量）などの要因に応じて、様々な濃度の多数の異なる試薬を含む。１つの例示的な増幅試薬は、４７．６ｍＭのＮａ－ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、２．５％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ－１００、５４．８ｍＭのＫＣｌ、２３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＮａＯＨ、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭのｒＡＴＰ、１．３５ｍＭのｒＣＴＰ、１．３５ｍＭのＵＴＰ、８．８５ｍＭのｒＧＴＰ、０．２６ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５％ｖ／ｖのグリセロール、２．９％のトレハロース、０．２２５％のエタノール、０．０７５％のメチルパラベン、０．０１５％のプロピルパラベン、および０．００２％のフェノールレッド、ｐＨ７．５～７．６を含む。別の例示的な増幅試薬は、１９．１ｍＭのトリズマ塩基、７．５ｍＭのトリズマ塩酸塩、２３．３ｍＭのＫＣｌ、２１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、６．５ｍＭのｒＡＴＰ、４．０ｍＭのｒＣＴＰ、４．０ｍＭのＵＴＰ、６．５ｍＭのｒＧＴＰ、３．３３％ｖ／ｖのグリセロール、０．０５ｍＭの酢酸亜鉛、６ｐｐｍのＰｒｏ Ｃｌｉｎ ３００保存剤、ｐＨ８．２５～８．４５を含む。増幅試薬の他の製剤も同様に十分に作用し得る。プライマーは、増幅試薬に添加され得るか、または増幅試薬とは別の増幅反応に添加され得る。増幅試薬中の酵素には、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）およびバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが含まれ、その単位は機能的に次のように定義される：１ＵのＭＭＬＶ－ＲＴは、テンプレートとして２００～４００マイクロモルのオリゴｄＴプライムポリ（Ａ）を使用して、３７℃において１０分で１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを組み込み、１ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを含有するＤＮＡテンプレートを使用して、３７℃において１時間で１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡに組み込む。
「ハイブリダイゼーション試薬」は、一般に、約７５～１００ｍＭのコハク酸、２％～３．５％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、７５～１００ｍＭの水酸化リチウム、１４～１６ｍＭのアルドリチオール－２、１．０～１．２Ｍの塩化リチウム、２０～１０００ｍＭのＥＤＴＡ、および２．０～４．０％（ｖ／ｖ）のエタノール、ｐＨ４～５の範囲の濃度を有する試薬で構成される溶液を指す。ハイブリダイゼーション試薬の他の製剤も同様にうまく作用し得る。
「選択試薬」は、一般に、６００ｍＭのホウ酸、１８２．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）のオクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）、ｐＨ８．５を含有する溶液を指す。
「検出試薬」には、１ｍＭの硝酸と３２ｍＭの過酸化水素とを含有する溶液を一般に指す「検出試薬Ｉ」、および１．５Ｍの水酸化ナトリウムの溶液を一般に指す「検出試薬ＩＩ」が含まれる。
実施例１
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍインビトロ転写物（ＩＶＴ）を使用して、手動Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ｅＳＡＳ）上での転写媒介増幅（ＴＭＡ）を使用して、プライマースクリーニングを実施した。アッセイラックは、１０列の１０チューブユニット（ＴＴＵ）からなった。７５マイクロリットル（７５μＬ）の増幅試薬、ならびに５ピコモルの各Ｔ７プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドおよび非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを、ラック上の適切なチューブに加え、これにより、増幅オリゴマーの各組み合わせを、該当する場合、１反応当たり３０および１０コピーのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴの３つの複製、および１反応当たり１，０００，０００コピーのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴの２つの複製で試験した。Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉを、ＢａｂｅｓｉａとＰｌａｓｍｏｄｉｕｍとの間の保存された領域のため、交差反応性標本として最初のスクリーニングに含んだ。増幅および検出システムがＰｌａｓｍｏｄｉｕｍに特異的であることを決定する必要がある。１反応当たりの目標コピー数を達成するために、緩衝液中で希釈した３ｃ／μＬまたは１ｃ／μＬにおける１０μＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴを、適切なチューブにスパイクし、緩衝液中で希釈した１００，０００ｃ／μＬにおける１０μＬのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴを、適切なチューブにスパイクした。プライマーの様々な組み合わせを試験した。この設定により、ラック毎に１０個のプライマーの組み合わせが試験されることが可能になる。いったんプライマーの組み合わせおよびＩＶＴをスパイクすると、２００μＬの油を各チューブに加え、ラックをシーリングカードで覆い、最低２０秒間ボルテックスした。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍインビトロ転写物（ＩＶＴ）を使用して、手動Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ｅＳＡＳ）上での転写媒介増幅（ＴＭＡ）を使用して、プライマースクリーニングを実施した。アッセイラックは、１０列の１０チューブユニット（ＴＴＵ）からなった。７５マイクロリットル（７５μＬ）の増幅試薬、ならびに５ピコモルの各Ｔ７プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドおよび非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを、ラック上の適切なチューブに加え、これにより、増幅オリゴマーの各組み合わせを、該当する場合、１反応当たり３０および１０コピーのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴの３つの複製、および１反応当たり１，０００，０００コピーのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴの２つの複製で試験した。Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉを、ＢａｂｅｓｉａとＰｌａｓｍｏｄｉｕｍとの間の保存された領域のため、交差反応性標本として最初のスクリーニングに含んだ。増幅および検出システムがＰｌａｓｍｏｄｉｕｍに特異的であることを決定する必要がある。１反応当たりの目標コピー数を達成するために、緩衝液中で希釈した３ｃ／μＬまたは１ｃ／μＬにおける１０μＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴを、適切なチューブにスパイクし、緩衝液中で希釈した１００，０００ｃ／μＬにおける１０μＬのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴを、適切なチューブにスパイクした。プライマーの様々な組み合わせを試験した。この設定により、ラック毎に１０個のプライマーの組み合わせが試験されることが可能になる。いったんプライマーの組み合わせおよびＩＶＴをスパイクすると、２００μＬの油を各チューブに加え、ラックをシーリングカードで覆い、最低２０秒間ボルテックスした。
次いで、ラックを６０±１℃の水浴で１０±１分間インキュベートし、続いて、４１．５±１℃の水浴で９～２０分間インキュベートした。ラックを水浴中に保ったまま、シーリングカードを取り外し、２５μＬの市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）を各反応チューブに加え、次いで、シーリングカードで再び覆った。ラックを穏やかに振盪させて混合し、次いで、シーリングカードで再び覆い、４１．５±１℃の水浴でさらに６０±５分間インキュベートした。
インキュベーションが完了した後、ラックをハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）領域に移し、そこでシーリングカードを取り外した。アクリジニウム－エステル（ＡＥ）標識プローブからなる１００μＬのプローブ試薬を、１反応当たり少なくとも２．５ｅ６相対発光量（ＲＬＵ）の所望の総濃度で、ハイブリダイゼーション試薬に添加した。次いで、プローブ試薬を適切な反応チューブに加えた。チューブをシーリングカードで覆い、ラックを最低２０秒間ボルテックスし、その後、ラックを６１±２℃の水浴で１５±１分間インキュベートした。
ラックを水浴から取り外し、シーリングカードを取り外し、２５０μＬの市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ選択試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）を各チューブに追加した。チューブをシーリングカードで覆い、最低２０秒間ボルテックスし、次いで、６１±２℃の水浴に戻し、１０±１分間インキュベートした。インキュベーション後、ラックを２３±４℃の水浴で最低１０分間冷却させた。
検出のために、ＴＴＵをラックから取り外し、市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ Ａｕｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ １および２試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）を使用した後続のライトオフのために、自動リーダー機器に装填し、結果を相対発光量（ＲＬＵ）のシグナルの分析のためにエクスポートした。
本実施例でスクリーニングされたＡＥ標識プローブを以下の表４に示す。４つの実験群：群１、群２ａおよび２ｂ、ならびに群３における増幅オリゴマー対で、プローブをスクリーニングした。
群１。プローブ１、３、４～６、１２、および１４～１６を各々、配列番号５９（Ｔ７プロモータープロバイダーオリゴマー）および配列番号３０（非Ｔ７オリゴマー）で試験した。このプローブスクリーンの結果を以下の表５に示す。候補は、１反応当たり１ｅ６コピーでＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴとの交差反応性を示さなかった。加えて、同じヌクレオチド配列を有するが、異なる２ＭｅＡＥリンカー部位を有するプローブ（例えば、プローブ１および３を参照、またプローブ４、５、および６も参照）は、それらの異なる標識に関係なく良好に機能した。
群２ａおよび２ｂ。群２ａでは、以下のプライマー／プローブの組み合わせを試験した：配列番号５９および配列番号３３（Ｔ７／ＮＴ７）と対になったプローブ８および２０～２２の各々、配列番号５９および配列番号５２（Ｔ７／ＮＴ７）と対になったプローブ７および２０～２２の各々、ならびに配列番号５９および配列番号４９（Ｔ７／ＮＴ７）と対になったプローブ７および８の各々。群２ｂでは、以下のプライマー／プローブの組み合わせを試験した：配列番号６６および配列番号３３（Ｔ７／ＮＴ７）と対になったプローブ２０～２２の各々、配列番号６６および配列番号５２（Ｔ７／ＮＴ７）と対になったプローブ７および２０～２２の各々、ならびに配列番号６６および配列番号４９（Ｔ７／ＮＴ７）と対になったプローブ７。
このプローブスクリーンの結果を以下の表６および７に示す。配列番号５２の非Ｔ７オリゴマーを含む系は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍを増幅しなかった。プローブ２０～２２のいずれかと対になった配列番号５９／配列番号３３のＴ７／ＮＴ７オリゴマー対を有する系は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍを検出しなかったが、これらのプローブは、配列番号６６／配列番号３３のＴ７／ＮＴ７オリゴマー対と共に使用されたときにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを検出する。
群３。配列番号３３の非Ｔ７プライマーの再設計を試験した。プローブ７および８の各々を、配列番号６６／配列番号２５および配列番号６６／配列番号３５（Ｔ７／ＮＴ７）の各々と対にした。さらに、プローブ２０を、配列番号６６／配列番号３３（Ｔ７／ＮＴ７）と対にした。
このプローブスクリーンの結果を以下の表８に示す。配列番号６６／配列番号３３のＴ７／ＮＴ７オリゴマー対は、プローブ２０で良好に機能した。配列番号３３の非Ｔ７オリゴマー（配列番号２５および配列番号３５）の再設計は、プローブ７および８で偽陽性を誘発した。
実施例２
本実施例では、完全自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）上でＴＭＡを使用して、候補増幅系をスクリーニングするための材料および方法について説明する。
本実施例では、完全自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）上でＴＭＡを使用して、候補増幅系をスクリーニングするための材料および方法について説明する。
標本は、緩衝液中で希釈したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、および／またはＰ．ｖｉｖａｘ ＩＶＴを含んだ。標本はまた、交差反応性標本としてＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴを含み得る。増幅および検出システムがＰｌａｓｍｏｄｉｕｍに特異的であることを決定する必要がある。５００ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴパネルを含むアッセイキャリブレータを含んで、ランのための分析物カットオフを決定した。アッセイソフトウェアは、分析物カットオフを使用して、試料が反応性であるか非反応性であるかを判定する。シグナル対カットオフ比が１以上の試料が反応性であると見なされる一方で、１未満の試料は、非反応性である。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：少なくとも１つの標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）で構成される標的捕捉試薬（ＴＣＲ）、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーと少なくとも１つの非Ｔ７プライマーとを含む増幅試薬、少なくとも１つのＡＥ標識プローブからなるプローブ試薬、Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬、ならびに選択試薬。
実施例３：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的捕捉プローブのスクリーニング
候補標的捕捉プローブ（ＴＣＯ）を、１ｍＬの全血を有する３ｍＬの寄生虫輸送培地（ＰＴＭ、１００ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの塩化マグネシウム、および６％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、ｐＨ７．５）で調製した、５００ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴを含有する試料を用いてスクリーニングした。ＴＭＡ反応を、実質的に実施例２に記載されるように、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施した。配列番号１～５、７、９、および１０のＴＣＯを、配列番号６６および配列番号６９（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号２１および配列番号３０（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、ならびに配列番号１４８および配列番号１５２（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）の検出プローブを使用して試験した。
候補標的捕捉プローブ（ＴＣＯ）を、１ｍＬの全血を有する３ｍＬの寄生虫輸送培地（ＰＴＭ、１００ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの塩化マグネシウム、および６％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、ｐＨ７．５）で調製した、５００ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴを含有する試料を用いてスクリーニングした。ＴＭＡ反応を、実質的に実施例２に記載されるように、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施した。配列番号１～５、７、９、および１０のＴＣＯを、配列番号６６および配列番号６９（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号２１および配列番号３０（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、ならびに配列番号１４８および配列番号１５２（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）の検出プローブを使用して試験した。
結果を以下の表９および１０に示す。アッセイ性能は、ＴＣＯの配列番号９および配列番号１０で最高であった。配列番号３は、このアッセイでは最適ではなかった。
実施例４：分析感度－ＲＮＡコピー／ｍＬのＬｏＤ
候補増幅系の検出限界（ＬｏＤ）を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、およびＰ．ｖｉｖａｘのインビトロ合成転写物を使用したプロビット分析によって評価した。ＴＭＡ反応を、実質的に実施例２に記載されているように、完全に自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施した。各種のＩＶＴを、緩衝液で１００、３０、１０、３、１、および０コピー／ｍＬに段階希釈し、種毎に各レベルで３２個の複製で試験した。標本を、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）上でＴＭＡを使用して試験した。５００ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴパネルを含むアッセイキャリブレータを含んで、ランのための分析物カットオフを決定した。アッセイソフトウェアは、分析物カットオフを使用して、試料が反応性であるか非反応性であるかを判定する。シグナル対カットオフ比が１以上の試料が反応性であると見なされる一方で、１未満の試料は、非反応性である。このアッセイのために、次のオリゴマーを使用した：配列番号６６および配列番号６９（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号２１および配列番号３０（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、配列番号１４８および配列番号１５２（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）の検出プローブ、ならびに配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
候補増幅系の検出限界（ＬｏＤ）を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、およびＰ．ｖｉｖａｘのインビトロ合成転写物を使用したプロビット分析によって評価した。ＴＭＡ反応を、実質的に実施例２に記載されているように、完全に自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施した。各種のＩＶＴを、緩衝液で１００、３０、１０、３、１、および０コピー／ｍＬに段階希釈し、種毎に各レベルで３２個の複製で試験した。標本を、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）上でＴＭＡを使用して試験した。５００ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴパネルを含むアッセイキャリブレータを含んで、ランのための分析物カットオフを決定した。アッセイソフトウェアは、分析物カットオフを使用して、試料が反応性であるか非反応性であるかを判定する。シグナル対カットオフ比が１以上の試料が反応性であると見なされる一方で、１未満の試料は、非反応性である。このアッセイのために、次のオリゴマーを使用した：配列番号６６および配列番号６９（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号２１および配列番号３０（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、配列番号１４８および配列番号１５２（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）の検出プローブ、ならびに配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
結果を表１１に示す。試験した５つの種について、同様のＬｏＤ値が観察された。９５％ＬｏＤは、９．４～１４．８コピー／ｍＬの範囲であった。
実施例５：分析感度－ＲＮＡ寄生虫／ｍＬのＬｏＤ
候補増幅系の検出限界（ＬｏＤ）を、培養した寄生虫感染細胞を使用したプロビット分析によって評価した。具体的には、溶解した陰性全血標本および希釈した培養Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球を使用して、条件を試験した。濃度（１ｍＬ値当たりの寄生虫）を推定するために蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって決定された既知のパーセントの寄生虫血症およびＲＢＣカウントを有する培養試料を受け取った。１ｍＬ当たりの推定寄生虫に基づいて、試料を正常な陰性ヒト全血で、１ｍＬ当たり推定６、４、２、１、および０．５の寄生虫に希釈した。希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染全血を、２．７ｍＬの寄生虫輸送培地（ＰＴＭ、１００ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの塩化マグネシウム、および６％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、ｐＨ７．５）中、０．９ｍＬの全血の比率で溶解した。検体を、完全に自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）上でＴＭＡを使用して試験した。５００ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴパネルを含むアッセイキャリブレータを含んで、ランのための分析物カットオフを決定した。アッセイソフトウェアは、分析物カットオフを使用して、試料が反応性であるか非反応性であるかを判定する。シグナル対カットオフ比が１以上の試料が反応性であると見なされる一方で、１未満の試料は、非反応性である。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：配列番号９および配列番号１０のＴＣＯを含む標的捕捉試薬（ＴＣＲ）、配列番号６６および配列番号６９（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号２１および配列番号３０（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマーを含む増幅試薬、配列番号１４８および配列番号１５２（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブを含むプローブ試薬、Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬、ならびに選択試薬。
候補増幅系の検出限界（ＬｏＤ）を、培養した寄生虫感染細胞を使用したプロビット分析によって評価した。具体的には、溶解した陰性全血標本および希釈した培養Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球を使用して、条件を試験した。濃度（１ｍＬ値当たりの寄生虫）を推定するために蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって決定された既知のパーセントの寄生虫血症およびＲＢＣカウントを有する培養試料を受け取った。１ｍＬ当たりの推定寄生虫に基づいて、試料を正常な陰性ヒト全血で、１ｍＬ当たり推定６、４、２、１、および０．５の寄生虫に希釈した。希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染全血を、２．７ｍＬの寄生虫輸送培地（ＰＴＭ、１００ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの塩化マグネシウム、および６％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、ｐＨ７．５）中、０．９ｍＬの全血の比率で溶解した。検体を、完全に自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）上でＴＭＡを使用して試験した。５００ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴパネルを含むアッセイキャリブレータを含んで、ランのための分析物カットオフを決定した。アッセイソフトウェアは、分析物カットオフを使用して、試料が反応性であるか非反応性であるかを判定する。シグナル対カットオフ比が１以上の試料が反応性であると見なされる一方で、１未満の試料は、非反応性である。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：配列番号９および配列番号１０のＴＣＯを含む標的捕捉試薬（ＴＣＲ）、配列番号６６および配列番号６９（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号２１および配列番号３０（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマーを含む増幅試薬、配列番号１４８および配列番号１５２（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブを含むプローブ試薬、Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬、ならびに選択試薬。
結果を表１２に示す。９５％ＬｏＤは、２．１４寄生虫／ｍＬであった。内部対照緩衝液、ＰＴＭ、および陰性溶解物の４８０個の複製の各々を、偽陽性なしで評価した（０／１，４４０）。
実施例６：Ｂａｂｅｓｉａとの干渉および交差反応性
Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ（相同原生動物）との干渉および交差反応性を、インビトロで合成した転写物を使用して評価した。１ｅ６ｃ／ｍＬのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴの付加を伴う、および伴わない、１００～１ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴ希釈を用いて、実質的に実施例２に記載されるように、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施したＴＭＡ反応において、試験を実施した。次のオリゴマーを使用した：配列番号７１および配列番号７２（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号３４および配列番号５３（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、配列番号１４８および配列番号１５７（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブ、ならびに配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ（相同原生動物）との干渉および交差反応性を、インビトロで合成した転写物を使用して評価した。１ｅ６ｃ／ｍＬのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴの付加を伴う、および伴わない、１００～１ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴ希釈を用いて、実質的に実施例２に記載されるように、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施したＴＭＡ反応において、試験を実施した。次のオリゴマーを使用した：配列番号７１および配列番号７２（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、配列番号３４および配列番号５３（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、配列番号１４８および配列番号１５７（各々１．９ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブ、ならびに配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
結果を以下の表１３および１４に示す。Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴの存在を伴う、および伴わない、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴについて、同等の反応性および分析物ＲＬＵが観察された。
実施例７：余剰プローブの評価
余剰プローブの組み合わせを、インビトロで合成した転写物を使用して評価した。実質的に実施例２に記載されるように、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施したＴＭＡ反応において、試験を実施した。次のオリゴマーを使用した：（ｉ）配列番号７１および配列番号７２（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、（ｉｉ）配列番号３４および配列番号５３（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、（ｉｉｉ）配列番号１４８（５，６ ２ＭｅＡＥリンカー）または配列番号１４８（６，７ ２ＭｅＡＥリンカー）を伴う、配列番号１４８（（４，５ ２ＭｅＡＥリンカー）および配列番号１５７（各々１．２７ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブ、ならびに（ｉｖ）配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
余剰プローブの組み合わせを、インビトロで合成した転写物を使用して評価した。実質的に実施例２に記載されるように、完全自動化Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施したＴＭＡ反応において、試験を実施した。次のオリゴマーを使用した：（ｉ）配列番号７１および配列番号７２（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、（ｉｉ）配列番号３４および配列番号５３（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、（ｉｉｉ）配列番号１４８（５，６ ２ＭｅＡＥリンカー）または配列番号１４８（６，７ ２ＭｅＡＥリンカー）を伴う、配列番号１４８（（４，５ ２ＭｅＡＥリンカー）および配列番号１５７（各々１．２７ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブ、ならびに（ｉｖ）配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
結果を表１５に示す。「Ｃ１」は、配列番号１４８（５，６ ２ＭｅＡＥリンカー）を含有するプローブの組み合わせを指す。「Ｃ２」は、配列番号１４８（６，７ ２ＭｅＡＥリンカー）を含有するプローブの組み合わせを指す。余剰プローブの組み合わせを用いて、３０および１０ｃ／ｍＬの全てのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種について、同等の反応性が観察された。実施例１の結果と一致して、同じヌクレオチド配列（配列番号１４８）を有するが、異なる２ＭｅＡＥリンカー部位を有するプローブは、それらの異なる標識に関係なく良好に機能した。
実施例８：分析感度－ＲＮＡ寄生虫／ｍＬのＬｏＤ
候補増幅系の検出限界（ＬｏＤ）を、培養したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球を使用したプロビット分析によって評価した。実質的に実施例５に記載されるように、完全に自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施したＴＭＡ反応において、試験を実施した。次のオリゴマーを使用した：（ｉ）配列番号７１および配列番号７２（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、（ｉｉ）配列番号３４および配列番号５３（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、（ｉｉｉ）配列番号１４８（４，５ ２ＭｅＡＥリンカー）、配列番号１５７、および配列番号１４８（５，６ ２ＭｅＡＥリンカー）（それぞれ１．１７ｅ６、７．９２ｅ５、および２．０３ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブ、ならびに（ｉｖ）配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
候補増幅系の検出限界（ＬｏＤ）を、培養したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球を使用したプロビット分析によって評価した。実質的に実施例５に記載されるように、完全に自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で実施したＴＭＡ反応において、試験を実施した。次のオリゴマーを使用した：（ｉ）配列番号７１および配列番号７２（各々５ｐｍｏｌ／反応）のＴ７オリゴマー、（ｉｉ）配列番号３４および配列番号５３（各々５ｐｍｏｌ／反応）の非Ｔ７オリゴマー、（ｉｉｉ）配列番号１４８（４，５ ２ＭｅＡＥリンカー）、配列番号１５７、および配列番号１４８（５，６ ２ＭｅＡＥリンカー）（それぞれ１．１７ｅ６、７．９２ｅ５、および２．０３ｅ６ ＲＬＵ／反応）のＡＥ標識検出プローブ、ならびに（ｉｖ）配列番号９および配列番号１０のＴＣＯ。
結果を表１６に示す。９５％ＬｏＤは、２．３１寄生虫／ｍＬであった。試験した陰性標本において偽陽性はなかった。これらの結果は、９５％ＬｏＤが２．１４寄生虫／ｍＬであった実施例５で評価したシステムに匹敵する。
実施例９
プライマースクリーニングを、手動の二相リアルタイムＴＭＡアッセイの手順を使用して実施した。標的捕捉ステップでは、少なくとも１つの標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）と１つのＴ７プロモータープロバイダーとを含む４００μＬの標的捕捉試薬（ＴＣＲ）を、２ｍＬディープウェル９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９５０４０４５０）に追加し、続いて５００μＬの標本を追加した。標本は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ検出用の緩衝液中で希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種インビトロ転写物（ＩＶＴ）、およびＢａｂｅｓｉａ検出用の緩衝液中で希釈したＢａｂｅｓｉａ種ＩＶＴからなった。標本はまた、ＢａｂｅｓｉａとＰｌａｓｍｏｄｉｕｍとの間の保存された領域のため、反対の検出システムの交差反応性標本としてＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴも含み得る。増幅および検出システムが分析物系に特異的であることを決定する必要がある。プレートをシーリングカードで覆い、Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓプレートインキュベーター上に装填し、蓋で覆った。Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓインキュベーターのインキュベーションステップには、８０℃で７分、続いて６２℃で１７分および２５℃で１５～２５分のそれぞれが含まれた。
プライマースクリーニングを、手動の二相リアルタイムＴＭＡアッセイの手順を使用して実施した。標的捕捉ステップでは、少なくとも１つの標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）と１つのＴ７プロモータープロバイダーとを含む４００μＬの標的捕捉試薬（ＴＣＲ）を、２ｍＬディープウェル９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９５０４０４５０）に追加し、続いて５００μＬの標本を追加した。標本は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ検出用の緩衝液中で希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種インビトロ転写物（ＩＶＴ）、およびＢａｂｅｓｉａ検出用の緩衝液中で希釈したＢａｂｅｓｉａ種ＩＶＴからなった。標本はまた、ＢａｂｅｓｉａとＰｌａｓｍｏｄｉｕｍとの間の保存された領域のため、反対の検出システムの交差反応性標本としてＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴも含み得る。増幅および検出システムが分析物系に特異的であることを決定する必要がある。プレートをシーリングカードで覆い、Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓプレートインキュベーター上に装填し、蓋で覆った。Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓインキュベーターのインキュベーションステップには、８０℃で７分、続いて６２℃で１７分および２５℃で１５～２５分のそれぞれが含まれた。
標的捕捉インキュベーションステップの後、プレートにディープウェルコームチップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９７００２５３４）を装填し、ディープウェルマグネットを取り付けたＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｙｐｅ ７１０ ＲＥＦ ５４００５００）上に配置した。加えて、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ機器に、５００μＬの市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ洗浄緩衝液試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）で調製した２ｍＬ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃディープウェルプレートカタログ番号２７８７５２）からなる洗浄プレート、および２００μＬの洗浄緩衝液を含む２００μＬ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９７００２５４０）からなる第２の洗浄プレートを装填した。ディープウェル洗浄ステップでは、ハイブリダイズしたＴＣＲ－試料混合物を含むプレートを５分間混合した後、磁気ビーズを２０カウント収集し、５００μＬの洗浄緩衝液を含むプレートに２０秒間溶出した。５００μＬの洗浄プレートを１分間混合した後、磁気ビーズを１０カウント収集し、２００μＬの洗浄緩衝液を含む洗浄プレートに２０秒間溶出した。
ハイブリダイズした磁気ビーズと洗浄緩衝液の混合物を含む第２の洗浄プレートを、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ機器から取り外し、小さいＰＣＲチップコーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ９７００２５１４）を装填し、 ＰＣＲマグネットを取り付けた第２のＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｙｐｅ ７１０ ＲＥＦ ５４００５００）に移した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ機器には、少なくとも１つの非Ｔ７プライマー（増幅プレート）を含有する３０μＬの増幅試薬（フェノールレッドなし）を含む、９６ウェルＰＣＲプレート（Ａｘｙｇｅｎカタログ番号ＰＣＲ－９６－ＨＳ－Ｃ）を装填した。ハイブリダイズした磁気ビーズを増幅プレートに移すために、洗浄プレートを５分間混合した後、磁気ビーズを３０カウント収集し、増幅プレートに３０秒間溶出した。洗浄プレートを再び１分間混合した後、磁気ビーズを３０カウント収集し、増幅プレートに３０秒間溶出して、移動を完了した。
増幅プレートをシーリングカードで覆い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ機器（Ｍｘ３００５Ｐ多重定量ＰＣＲシステム）上に装填して、４３℃で５分間インキュベートした。プレートを４２℃に設定したヒートブロックに移し、カバーを外して、１０μＬの市販のＵｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）を追加し、シーリングカードで再び覆った。プレートをヒートブロック上で１４００ＲＭＰにおいて１分間混合し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ機器に再び装填して、４３℃で５分間インキュベートした。プレートをヒートブロックに再び移し、カバーを外して、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーと少なくとも１つの蛍光標識分子トーチまたはビーコン（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについては、５'－ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、またはＢａｂｅｓｉａについては５'－フルオレセイン（ＦＡＭ））の混合物を含有する、１５μＬのプロモーター試薬（フェノールレッドを含まない増幅試薬）を加え、透明な接着プレートカバーで密封した。プレートをヒートブロック上で１４００ＲＭＰにおいて１分間混合し、読み取りプロトコルのためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ上に再び装填した。読み取りプロトコルは、４３℃でのインキュベーション、および１２０または１５０のサイクルの３０秒毎の読み取りからなった。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ機器からエクスポートした生データを、社内のソフトウェアツールを使用して分析した。蛍光曲線を、１，０００相対蛍光単位（ＲＦＵ）の閾値を使用して分析した。標本が閾値を満たすまたは超える時間（ＴＴｉｍｅ）を、ソフトウェアによって決定した。ＴＴｉｍｅのある標本は、ＨＥＸチャネルのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍまたはＦＡＭチャネルのＢａｂｅｓｉａに対して反応性があると見なされた。より低いＴＴｉｍｅは、試験した系のより良好な性能を示した。ＴＴｉｍｅがない、または閾値を下回る標本は、非反応性であると見なされた。
本実施例では、分子トーチまたはビーコンプローブと増幅オリゴマー対の組み合わせを、３つの群（群１、２、および３）で試験した。試験したオリゴマーの組み合わせを以下の表１７に示す。
群１の結果。配列番号１０４～１０７および１２１のプローブは、１０ｃ／ｍＬにおいて３０．６９分以下の平均ＴＴｉｍｅを生成する蛍光曲線で、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍをうまく検出した。配列番号１０８のプローブについては、ＴＴｉｍｅを有する蛍光曲線は生成されず、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍを検出することはできなかったと結論付けられた。
群２の結果。配列番号１０４のトーチプローブと組み合わせた配列番号１８１および１８４の増幅オリゴマーは、１０ｃ／ｍＬにおいて２０．８９分以下のＴＴｉｍｅを生成する蛍光曲線によって実証されるように、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍをうまく検出し、ＴＴｉｍｅを有する蛍光曲線の非存在によって実証されるＢａｂｅｓｉａ ＩＶＴとの交差反応性を示さなかった。
群２の結果。配列番号５９のＴ７増幅オリゴマーおよび配列番号１２３のトーチプローブと組み合わせた配列番号５１、３１、および５０の非Ｔ７増幅オリゴマーは各々、２２．８２分以下のＴＴｉｍｅを生成する蛍光曲線によって実証されるように、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍをうまく検出した。
実施例１０
候補増幅系を、リアルタイムフルオロメーター（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を取り付けた完全自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム上でリアルタイムＴＭＡを使用して試験した。標本は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ検出用の緩衝液中で希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＩＶＴ、およびＢａｂｅｓｉａ検出用の緩衝液中で希釈したＢａｂｅｓｉａ種ＩＶＴからなった。標本はまた、交差反応性標本として、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴを含み得る。増幅および検出システムが分析物系に特異的であることを決定する必要がある。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：少なくとも１つのＴＣＯおよび１つのＴ７プロモータープロバイダーで構成されるＴＣＲ、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーで構成される増幅試薬、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーおよび少なくとも１つの蛍光標識分子トーチまたはビーコン（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについては、５'－ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、またはＢａｂｅｓｉａについては５'－フルオレセイン（ＦＡＭ））で構成されるプロモーター試薬（フェノールレッドを含まない増幅試薬）、ならびにＵｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬。
候補増幅系を、リアルタイムフルオロメーター（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を取り付けた完全自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム上でリアルタイムＴＭＡを使用して試験した。標本は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ検出用の緩衝液中で希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＩＶＴ、およびＢａｂｅｓｉａ検出用の緩衝液中で希釈したＢａｂｅｓｉａ種ＩＶＴからなった。標本はまた、交差反応性標本として、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴを含み得る。増幅および検出システムが分析物系に特異的であることを決定する必要がある。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：少なくとも１つのＴＣＯおよび１つのＴ７プロモータープロバイダーで構成されるＴＣＲ、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーで構成される増幅試薬、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーおよび少なくとも１つの蛍光標識分子トーチまたはビーコン（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについては、５'－ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、またはＢａｂｅｓｉａについては５'－フルオレセイン（ＦＡＭ））で構成されるプロモーター試薬（フェノールレッドを含まない増幅試薬）、ならびにＵｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬。
Ｐａｎｔｈｅｒシステムからエクスポートした生データの分析のために、Ｐａｎｔｈｅｒ ＲＴ－Ｄｅｖ Ｔｏｏｌ（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を使用した。蛍光曲線を、１，０００相対蛍光単位（ＲＦＵ）の閾値を使用して分析した。標本が閾値を満たすまたは超える時間（ＴＴｉｍｅ）を、ソフトウェアによって決定した。ＴＴｉｍｅのある標本は、ＨＥＸチャネルのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍまたはＦＡＭチャネルのＢａｂｅｓｉａに対して反応性があると見なされた。より低いＴＴｉｍｅは、試験した系のより良好な性能を示した。ＴＴｉｍｅがない、または閾値を下回る標本は、非反応性であると見なされた。
本実施例で試験したオリゴマーは、配列番号５９のＴ７オリゴマー、配列番号３０の非Ｔ７オリゴマー、および配列番号１２３のトーチプローブであった。結果は、３０ｃ／ｍＬのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ＩＶＴで試験した８つの複製のうち８つ、および１０ｃ／ｍＬで試験した８つの複製のうち３つの検出を実証した。蛍光曲線は、１０ｃ／ｍＬで検出された複製について、３３．１８分以下のＴＴｉｍｅを生成した。
実施例１１：臨床標本中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの検出
候補増幅系を、リアルタイムフルオロメーター（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を取り付けた完全自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム上でリアルタイムＴＭＡを使用して試験した。標本は、緩衝液中で３００ｃ／ｍＬに希釈したＢ．ｍｉｃｒｏｔｉおよびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴの陽性対照、ならびに陰性の緩衝液からなる陰性対照からなった。臨床標本は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰ．ｏｖａｌｅの全血および血漿標本からなった。全血標本を、１００μＬ～３ｍＬの溶解緩衝液（１４ｍＭの重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化アンモニウム、５％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を手動で添加することによって調製した。血漿標本を、１００μＬ～３ｍＬの処理済みのヒト血漿を手動で添加することによって調製した。標本を、Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で試験した。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：少なくとも１つのＴＣＯおよび１つのＴ７プロモータープロバイダーで構成されるＴＣＲ、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーで構成される増幅試薬、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーおよび少なくとも１つの蛍光標識分子トーチまたはビーコン（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについては、５'－ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、またはＢａｂｅｓｉａについては５'－フルオレセイン（ＦＡＭ））で構成されるプロモーター試薬（フェノールレッドを含まない増幅試薬）、ならびに酵素試薬。
候補増幅系を、リアルタイムフルオロメーター（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を取り付けた完全自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム上でリアルタイムＴＭＡを使用して試験した。標本は、緩衝液中で３００ｃ／ｍＬに希釈したＢ．ｍｉｃｒｏｔｉおよびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴの陽性対照、ならびに陰性の緩衝液からなる陰性対照からなった。臨床標本は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰ．ｏｖａｌｅの全血および血漿標本からなった。全血標本を、１００μＬ～３ｍＬの溶解緩衝液（１４ｍＭの重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化アンモニウム、５％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を手動で添加することによって調製した。血漿標本を、１００μＬ～３ｍＬの処理済みのヒト血漿を手動で添加することによって調製した。標本を、Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で試験した。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：少なくとも１つのＴＣＯおよび１つのＴ７プロモータープロバイダーで構成されるＴＣＲ、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーで構成される増幅試薬、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーおよび少なくとも１つの蛍光標識分子トーチまたはビーコン（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについては、５'－ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、またはＢａｂｅｓｉａについては５'－フルオレセイン（ＦＡＭ））で構成されるプロモーター試薬（フェノールレッドを含まない増幅試薬）、ならびに酵素試薬。
Ｐａｎｔｈｅｒシステムからエクスポートした生データの分析のために、Ｐａｎｔｈｅｒ ＲＴ－Ｄｅｖ Ｔｏｏｌ（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を使用した。蛍光曲線を、１，０００相対蛍光単位（ＲＦＵ）の閾値を使用して分析した。標本が閾値を満たすまたは超える時間（ＴＴｉｍｅ）を、ソフトウェアによって決定した。ＴＴｉｍｅのある標本は、ＨＥＸチャネルのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍまたはＦＡＭチャネルのＢａｂｅｓｉａに対して反応性があると見なされた。より低いＴＴｉｍｅは、試験した系のより良好な性能を示した。ＴＴｉｍｅがない、または閾値を下回る標本は、非反応性であると見なされた。
本実施例で試験したオリゴマーは、配列番号５９のＴ７オリゴマー、配列番号３０の非Ｔ７オリゴマー、および配列番号１２３のトーチプローブであった。結果を表１８に示す。試験したオリゴマーを用いたリアルタイムＴＭＡの結果は、ＰＣＲ結果との１００％の一致を示した。インビトロＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染赤血球を使用して生成した検量線に基づいて、試験した試料は、全血中に７．１４Ｅ６～２．１４Ｅ８の寄生虫／ｍＬを有する。Ｂａｂｅｓｉａでは交差反応性は観察されなかった。
実施例１２
候補増幅系を、リアルタイムフルオロメーター（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を取り付けた完全自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム上でリアルタイムＴＭＡを使用して試験した。標本は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染赤血球の５つの株：Ｓ ０５ Ｆ Ｂｅｎｉｎ Ｉ、ＵＳ ０５ Ｆ Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ、ＵＳ ０８ Ｆ Ｎｉｇｅｒｉａ ＸＩＩ、ＵＳ０５ Ｆ ＦＣ２７／Ａ３、およびＵＳ０５ Ｆ ＰＨ１からなった。感染赤血球には、推定寄生虫／ｍＬ値を提供した。各株を、正常な陰性のヒト全血中で段階的に希釈して、１０寄生虫／ｍＬの推定値にした。希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染全血を、３ｍＬの溶解緩衝液（１４ｍＭの重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化アンモニウム、５％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中１ｍＬの全血の比率において、手動で溶解した。標本を、Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で試験した。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：少なくとも１つのＴＣＯおよび１つのＴ７プロモータープロバイダーで構成されるＴＣＲ、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーで構成される増幅試薬、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーおよび少なくとも１つの蛍光標識分子トーチまたはビーコン（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについては、５'－ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、またはＢａｂｅｓｉａについては５'－フルオレセイン（ＦＡＭ））で構成されるプロモーター試薬（フェノールレッドを含まない増幅試薬）、ならびに酵素試薬。
候補増幅系を、リアルタイムフルオロメーター（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を取り付けた完全自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム上でリアルタイムＴＭＡを使用して試験した。標本は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染赤血球の５つの株：Ｓ ０５ Ｆ Ｂｅｎｉｎ Ｉ、ＵＳ ０５ Ｆ Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ、ＵＳ ０８ Ｆ Ｎｉｇｅｒｉａ ＸＩＩ、ＵＳ０５ Ｆ ＦＣ２７／Ａ３、およびＵＳ０５ Ｆ ＰＨ１からなった。感染赤血球には、推定寄生虫／ｍＬ値を提供した。各株を、正常な陰性のヒト全血中で段階的に希釈して、１０寄生虫／ｍＬの推定値にした。希釈したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染全血を、３ｍＬの溶解緩衝液（１４ｍＭの重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化アンモニウム、５％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中１ｍＬの全血の比率において、手動で溶解した。標本を、Ｐａｎｔｈｅｒシステム上で試験した。使用したアッセイ試薬は、次を含んだ：少なくとも１つのＴＣＯおよび１つのＴ７プロモータープロバイダーで構成されるＴＣＲ、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーで構成される増幅試薬、少なくとも１つのＴ７プロモータープロバイダーおよび少なくとも１つの蛍光標識分子トーチまたはビーコン（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍについては、５'－ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、またはＢａｂｅｓｉａについては５'－フルオレセイン（ＦＡＭ））で構成されるプロモーター試薬（フェノールレッドを含まない増幅試薬）、ならびに酵素試薬。
Ｐａｎｔｈｅｒシステムからエクスポートした生データの分析のために、Ｐａｎｔｈｅｒ ＲＴ－Ｄｅｖ Ｔｏｏｌ（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）を使用した。蛍光曲線を、１，０００相対蛍光単位（ＲＦＵ）の閾値を使用して分析した。標本が閾値を満たすまたは超える時間（ＴＴｉｍｅ）を、ソフトウェアによって決定した。ＴＴｉｍｅのある標本は、ＨＥＸチャネルのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍまたはＦＡＭチャネルのＢａｂｅｓｉａに対して反応性があると見なされた。より低いＴＴｉｍｅは、試験した系のより良好な性能を示した。ＴＴｉｍｅがない、または閾値を下回る標本は、非反応性であると見なされた。
本実施例で試験したオリゴマーは、配列番号５９のＴ７オリゴマー、配列番号３０の非Ｔ７オリゴマー、および配列番号１２３のトーチプローブであった。結果は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染赤血球の５つの全ての株が、１４．２９～１７．１７分の範囲のＴＴｉｍｅを生成する蛍光曲線で、１０寄生虫／ｍＬにおいて試験した６つの複製のうち６つで検出されたことを示した。
実施形態
実施形態１．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための方法であって、
（１）試料であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を含有する疑いがある試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）
（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または
（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、および
（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、を含む、接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前述の試料中に存在する任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施することと、
（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それによって前述の試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。
実施形態１．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための方法であって、
（１）試料であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を含有する疑いがある試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）
（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または
（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、および
（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、を含む、接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前述の試料中に存在する任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施することと、
（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それによって前述の試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。
実施形態２．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）の増幅オリゴマーを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、３５、５４、および５５からなる群から選択される、実施形態２に記載の方法。
実施形態４．（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態５．（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、および３５からなる群から選択される、実施形態４に記載の方法。
実施形態６．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）の増幅オリゴマーを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態７．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６７の配列を含む、実施形態６に記載の方法。
実施形態８．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８～３１、３４、４０、４１、および４９～５１からなる群から選択される、実施形態７に記載の方法。
実施形態９．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６８の配列を含む、実施形態６に記載の方法。
実施形態１０．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３８、３９、４３、４４、および５３からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８０～８２および８５～１００からなる群から選択される、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７１の配列を含む、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８１、８２、８５、８７～９０、９４、および９６～９８からなる群から選択される、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７２の配列を含む、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１６．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８０、８２、８５、および８７～１００からなる群から選択される、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７．（ｂ）の増幅オリゴマーが、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９．Ｔ７プロモーター配列が、配列番号１７９である、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０．（ｂ）の増幅オリゴマーが、配列番号５７～５９および６２～７７からなる群から選択される配列を含む、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１．（ａ）および（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、
（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、
（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、
（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、
（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、
（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、
（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、
（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、
（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、
（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、
（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、
（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、
（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、
（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、または
（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５、である、実施形態１に記載の方法。
（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、
（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、
（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、
（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、
（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、
（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、
（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、
（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、
（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、
（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、
（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、
（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、
（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、
（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、または
（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５、である、実施形態１に記載の方法。
実施形態２２．（ｂ）の増幅オリゴマーが、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４．Ｔ７プロモーター配列が、配列番号１７９である、実施形態２３の方法。
実施形態２５．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態２６．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７．
（ａ）（ｉｉ）にあるような第１の増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような第２の増幅オリゴマーが、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態２６に記載の方法。
（ａ）（ｉｉ）にあるような第１の増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような第２の増幅オリゴマーが、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８．第１の増幅オリゴマーが、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列を含み、第２の増幅オリゴマーが、配列番号５３の標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーと、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーとを含む、実施形態２５に記載の方法。
実施形態３０．
（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む、実施形態２９に記載の方法。
（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１．（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号２１の標的ハイブリダイズ配列を含み、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーを含む、実施形態１および２５～３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３．（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々が、配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４．（ｂ）にあるような第１の増幅オリゴマーが、配列番号９４の標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｂ）にあるような第２の増幅オリゴマーが、配列番号９５の標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５．（ｂ）の増幅オリゴマーの各々が、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７．Ｔ７プロモーター配列が、配列番号１７９である、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．ステップ（１）の前に、試料中の他の構成成分から標的核酸を精製することをさらに含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９．精製ステップが、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含み、前述の標的ハイブリダイズ配列が、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０からなる群から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０．捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１．精製ステップが、試料を少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含む、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４２．少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーが、
配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の捕捉プローブオリゴマーと、
配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の捕捉プローブオリゴマーと、を含む、実施形態４１に記載の方法。
配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の捕捉プローブオリゴマーと、
配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の捕捉プローブオリゴマーと、を含む、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．検出するステップ（３）が、インビトロ核酸増幅反応を、増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと、増幅産物の存在または非存在が判定される条件下で接触させ、それによって前述の試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を示すことを含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４または配列番号１７５の配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４７．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７４もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７５もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態５０．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態４９に記載の方法。
実施形態５１．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態５２．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３．検出プローブオリゴマーが、検出プローブオリゴマーヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つの２'メトキシ修飾を含む、実施形態４３～５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４．（ａ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５１もしくはその相補体、または配列番号１５１もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号３３、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｆ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｇ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｈ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３３、配列番号８９、および配列番号１５８もしくはその相補体、または配列番号１５８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｋ）配列番号４９、配列番号８９、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｌ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｍ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｎ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｏ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｐ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｑ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｒ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｓ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｔ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｕ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｖ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｗ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｘ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｙ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｚ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＡ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＢ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＣ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＤ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（ＡＥ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態４３～５３に記載の方法。
（Ａ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５１もしくはその相補体、または配列番号１５１もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号３３、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｆ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｇ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｈ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３３、配列番号８９、および配列番号１５８もしくはその相補体、または配列番号１５８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｋ）配列番号４９、配列番号８９、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｌ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｍ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｎ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｏ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｐ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｑ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｒ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｓ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｔ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｕ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｖ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｗ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｘ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｙ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｚ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＡ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＢ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＣ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＤ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（ＡＥ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態４３～５３に記載の方法。
実施形態５５．検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識を含む、実施形態４３～５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．検出可能な標識が、化学発光標識または蛍光標識である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．検出可能な標識が、検出プローブオリゴマーの２つの核酸塩基間で連結された化学発光アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８．検出するステップ（３）が、増幅ステップ（２）の間に発生する、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９．検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、実施形態５６または５８に記載の方法。
実施形態６０．検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブからなる群から選択される、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６１．検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む、実施形態４３～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３．少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを含む、実施形態４３に記載の方法。
実施形態６４．少なくとも２つの検出プローブオリゴマーが、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含み、
（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態４４に記載の方法。
（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態６５．
第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態６４に記載の方法。
第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．ステップ（２）での増幅反応が、等温増幅反応である、実施形態１～６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７．増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８．増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、実施形態１～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９．試料が、臨床試料である、実施形態１～６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０．試料が、血液試料である、実施形態１～６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１．試料が、溶解血球試料であり、任意に試料が、溶解赤血球試料である、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７２．試料が、赤血球試料である、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７３．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、前述のオリゴマーの組み合わせが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーを含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）
（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または
（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、
（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーの組み合わせ。
（ａ）
（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または
（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、
（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーの組み合わせ。
実施形態７４．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）の増幅オリゴマーを含む、実施形態７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態７５．（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、３５、５４、および５５からなる群から選択される、実施形態７４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態７６．（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む、実施形態７４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態７７．（ａ）（ｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、および３５からなる群から選択される、実施形態７６に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態７８．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）の増幅オリゴマーを含む、実施形態７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態７９．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６７の配列を含む、実施形態７８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８０．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８～３１、３４、４０、４１、および４９～５１からなる群から選択される、実施形態７９に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８１．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６８の配列を含む、実施形態７８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８２．（ａ）（ｉｉ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３８、３９、４３、４４、および５３からなる群から選択される、実施形態８１に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８３．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８０～８２および８５～１００からなる群から選択される、実施形態７３～８２のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８４．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む、実施形態７３～８２のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８５．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７１の配列を含む、実施形態８４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８６．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８１、８２、８５、８７～９０、９４、および９６～９８からなる群から選択される、実施形態８５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８７．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７２の配列を含む、実施形態８４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８８．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８０、８２、８５、および８７～１００からなる群から選択される、実施形態８７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態８９．（ｂ）の増幅オリゴマーが、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、実施形態１～８８のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９０．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態８９に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９１．Ｔ７プロモーター配列が、配列番号１７９である、実施形態９０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９２．（ｂ）の増幅オリゴマーが、配列番号５７～５９および６２～７７からなる群から選択される配列を含む、実施形態９１に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９３．（ａ）および（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、
（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、
（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、
（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、
（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、
（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、
（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、
（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、
（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、
（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、
（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、
（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、
（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、
（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、または
（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５、である、実施形態７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、
（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、
（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、
（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、
（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、
（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、
（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、
（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、
（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、
（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、
（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、
（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、
（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、
（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、または
（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５、である、実施形態７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９４．（ｂ）の増幅オリゴマーが、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、実施形態９３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９５．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態９４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９６．Ｔ７プロモーター配列が、配列番号１７９である、実施形態９５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９７．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む、実施形態７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９８．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含む、実施形態９７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態９９．
（ａ）（ｉｉ）にあるような第１の増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような第２の増幅オリゴマーが、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態９８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
（ａ）（ｉｉ）にあるような第１の増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような第２の増幅オリゴマーが、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態９８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１００．第１の増幅オリゴマーが、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列を含み、第２の増幅オリゴマーが、配列番号５３の標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態９９に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０１．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーと、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーとを含む、実施形態９７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０２．
（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む、実施形態１０１に記載のオリゴマーの組み合わせ。
（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む、実施形態１０１に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０３．（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号２１の標的ハイブリダイズ配列を含み、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーが、配列番号３４の標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態１０２に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０４．少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーを含む、実施形態７３および９７～１０３のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０５．（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーの各々が、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態１０４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０６．（ｂ）にあるような第１の増幅オリゴマーが、配列番号９４の標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｂ）にあるような第２の増幅オリゴマーが、配列番号９５の標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態１０５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０７．（ｂ）の増幅オリゴマーの各々が、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、実施形態９３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０８．プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態１０７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１０９．Ｔ７プロモーター配列が、配列番号１７９である、実施形態１０８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１０．固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、前述の標的ハイブリダイズ配列が、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０からなる群から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態１～１０９のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１１．捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１１０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１２．オリゴマーの組み合わせが、少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーを含む、実施形態１１０のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１３．少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーが、
配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第１の捕捉プローブオリゴマーと、
配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第２の捕捉プローブオリゴマーと、を含む、実施形態１１２に記載のオリゴマーの組み合わせ。
配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第１の捕捉プローブオリゴマーと、
配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第２の捕捉プローブオリゴマーと、を含む、実施形態１１２に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１４．少なくとも２つの増幅オリゴマーによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種アンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、実施形態１～１１３のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１５．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１１４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１６．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択される、実施形態１１５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１７．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４および配列番号１７５からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１１５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１８．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７４の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、実施形態１１７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１１９．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択される、実施形態１１８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２０．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、実施形態１１７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２１．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択される、実施形態１２０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２２．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１１５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２３．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択される、実施形態１２２に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２４．検出プローブオリゴマーが、検出プローブオリゴマーヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つの２'メトキシ修飾を含む、実施形態１１４～１２３のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２５．（ａ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５１もしくはその相補体、または配列番号１５１もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号３３、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｆ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｇ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｈ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３３、配列番号８９、および配列番号１５８もしくはその相補体、または配列番号１５８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｋ）配列番号４９、配列番号８９、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｌ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｍ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｎ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｏ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｐ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｑ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｒ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｓ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｔ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｕ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｖ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｗ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｘ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｙ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｚ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＡ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＢ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＣ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＤ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（ＡＥ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態１１４～１２４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
（Ａ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５１もしくはその相補体、または配列番号１５１もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号３０、配列番号８２、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号３３、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号４９、配列番号８２、および配列番号１５５もしくはその相補体、または配列番号１５５もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｆ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｇ）配列番号２１、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｈ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３０、配列番号８９、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｉ）配列番号３３、配列番号８９、および配列番号１５８もしくはその相補体、または配列番号１５８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｋ）配列番号４９、配列番号８９、および配列番号１５０もしくはその相補体、または配列番号１５０もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｌ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｍ）配列番号２１、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｎ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｏ）配列番号３０、配列番号９２、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｐ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｑ）配列番号２１、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｒ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｓ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｔ）配列番号３４、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｕ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｖ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｗ）配列番号５３、配列番号９４、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｘ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｙ）配列番号２１、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｚ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＡ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＢ）配列番号３４、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＣ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１４８もしくはその相補体、または配列番号１４８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（ＡＤ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５２もしくはその相補体、または配列番号１５２もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（ＡＥ）配列番号５３、配列番号９５、および配列番号１５７もしくはその相補体、または配列番号１５７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態１１４～１２４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２６．検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識を含む、実施形態１１４～１２５のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２７．検出可能な標識が、化学発光標識または蛍光標識である、実施形態１２６に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２８．検出可能な標識が、検出プローブオリゴマーの２つの核酸塩基間で連結された化学発光アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である、実施形態１２７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１２９．検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、実施形態１２７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１３０．検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブからなる群から選択される、実施形態１２９に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１３１．検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む、実施形態１１４～１３０のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１３２．検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、実施形態１３１に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１３３．少なくとも２つの検出プローブオリゴマーが、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含む、実施形態１１４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１３４．少なくとも２つの検出プローブオリゴマーが、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含み、
（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態１１５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態１１５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１３５．
第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１３４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１３４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１３６．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を特異的に検出するための検出プローブオリゴマーであって、前述の検出プローブオリゴマーが、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、第１および第２のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的増幅オリゴマーを含むオリゴマーの組み合わせによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されており、
（ａ）第１の増幅オリゴマーが、（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｂ）第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、検出プローブオリゴマー。
（ａ）第１の増幅オリゴマーが、（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｂ）第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、検出プローブオリゴマー。
実施形態１３７．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１３６に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１３８．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１３７に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１３９．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４または配列番号１７５の配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態１３７に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４０．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７４の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、実施形態１３９に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４１．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１４０に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４２．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、実施形態１３９に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４３．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１４２に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４４．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態１３７に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４５．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１４４に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４６．検出プローブオリゴマーが、検出プローブオリゴマーヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つの２'メトキシ修飾を含む、実施形態１３６～１４５のいずれか１つに記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４７．検出プローブオリゴマーが、標識を含む、実施形態１３６～１４６のいずれか１つに記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４８．標識が、化学発光標識または蛍光標識である、実施形態１４７に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１４９．標識が、検出プローブオリゴマーの２つの核酸塩基間で連結された化学発光アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である、実施形態１４８に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１５０．検出プローブが、蛍光標識およびクエンチャーを含む、実施形態１４８に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１５２．検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブからなる群から選択される、実施形態１５０に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１５３．検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む、実施形態１３６～１５２のいずれか１つに記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１５４．検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、実施形態１５３に記載の検出プローブオリゴマー。
実施形態１５５．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を検出するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、実施形態１３６に記載の少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを含む、オリゴマーの組み合わせ。
実施形態１５６．少なくとも２つの検出プローブオリゴマーが、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含み、
（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態１５５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
（Ａ）第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（Ｂ）第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む、実施形態１５５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１５７．
第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態１５６に記載のオリゴマーの組み合わせ。
第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、実施形態１５６に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１５８．試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に単離するための捕捉プローブオリゴマーであって、前述の捕捉プローブオリゴマーが、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含み、前述の標的ハイブリダイズ配列が、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０からなる群から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、捕捉プローブオリゴマー。
実施形態１５９．捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１５８に記載の捕捉プローブオリゴマー。
実施形態１６０．試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に単離するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、実施形態１５８に記載の少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーを含む、オリゴマーの組み合わせ。
実施形態１６１．少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーが、
配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第１の捕捉プローブオリゴマーと、
配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第２の捕捉プローブオリゴマーと、を含む、実施形態１６０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
配列番号１９の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第１の捕捉プローブオリゴマーと、
配列番号２０の標的ハイブリダイズ配列、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、第２の捕捉プローブオリゴマーと、を含む、実施形態１６０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１６２．実施形態７３～１３５、１５５～１５７、１６０、および１６１のいずれか１つに記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、キット。
実施形態１６３．実施形態７３～１３５、１５５～１５７、１６０、および１６１のいずれか１つに記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、反応混合物。
実施形態１６４．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に増幅するための、実施形態７３～１３５のいずれか１つに記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせの使用。
実施形態１６５．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための、実施形態１３６～１５７のいずれか１つに記載の検出プローブオリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせの使用。
実施形態１６６．試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に捕捉するための、実施形態１５８～１６１のいずれか１つに記載の捕捉プローブオリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせの使用。
実施形態１６７．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための方法であって、
（１）試料であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を含有する疑いがある試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、および
（ｂ）配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーを含む、接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前述の試料中に存在する任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施することと、
（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それによって前述の試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。
（１）試料であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を含有する疑いがある試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、および
（ｂ）配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーを含む、接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前述の試料中に存在する任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施することと、
（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それによって前述の試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。
実施形態１６８．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３７、４６、１８３、および１８４からなる群から選択される、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１６９．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８６の配列に含有される、実施形態１６８に記載の方法。
実施形態１７０．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８３または配列番号１８４である、実施形態１６９に記載の方法。
実施形態１７１．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３、８４、および１８２からなる群から選択される、実施形態１６７～１７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７２．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８３または配列番号１８４であり、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８２である、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７３．検出するステップ（３）が、インビトロ核酸増幅反応を、増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと、増幅産物の存在または非存在が判定される条件下で接触させ、それによって前述の試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を示すことを含む、実施形態１６７～１７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７４．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１８９の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１９０および配列番号１９１からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１７３に記載の方法。
実施形態１７５．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１２５～１３０および１４３（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１７４に記載の方法。
実施形態１７６．（ａ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２７もしくはその相補体、または配列番号１２７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２８もしくはその相補体、または配列番号１２８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１４３もしくはその相補体、または配列番号１４３もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２９もしくはその相補体、または配列番号１２９もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（Ｆ）配列番号１８４、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態１７３に記載の方法。
（Ａ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２７もしくはその相補体、または配列番号１２７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２８もしくはその相補体、または配列番号１２８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１４３もしくはその相補体、または配列番号１４３もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２９もしくはその相補体、または配列番号１２９もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（Ｆ）配列番号１８４、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態１７３に記載の方法。
実施形態１７７．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、前述のオリゴマーの組み合わせが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーを含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、
（ｂ）配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーの組み合わせ。
（ａ）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、
（ｂ）配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーの組み合わせ。
実施形態１７８．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３７、４６、１８３、および１８４からなる群から選択される、実施形態１７７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１７９．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８６の配列に含有される、実施形態１７８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８０．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８３または配列番号１８４である、実施形態１７９に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８１．（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３、８４、および１８２からなる群から選択される、実施形態１７７～１８０のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８２．（ａ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８３または配列番号１８４であり、（ｂ）の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８２である、実施形態１７７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８３．少なくとも２つの増幅オリゴマーによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種アンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、実施形態１７７～１８２のいずれか１つに記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８４．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１８９の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１９０および配列番号１９１からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、実施形態１８３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８５．検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１２５～１３０および１４３（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、実施形態１７４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８６．（ａ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、（ｂ）の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列、および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２７もしくはその相補体、または配列番号１２７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２８もしくはその相補体、または配列番号１２８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１４３もしくはその相補体、または配列番号１４３もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２９もしくはその相補体、または配列番号１２９もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（Ｆ）配列番号１８４、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態１７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
（Ａ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｂ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２７もしくはその相補体、または配列番号１２７もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｃ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２８もしくはその相補体、または配列番号１２８もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｄ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１４３もしくはその相補体、または配列番号１４３もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、
（Ｅ）配列番号１８３、配列番号１８２、および配列番号１２９もしくはその相補体、または配列番号１２９もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、あるいは
（Ｆ）配列番号１８４、配列番号１８２、および配列番号１２６もしくはその相補体、または配列番号１２６もしくはその相補体のＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、である、実施形態１７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
実施形態１８７．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を特異的に検出するための検出プローブオリゴマーであって、前述の検出プローブオリゴマーが、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、第１および第２のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的増幅オリゴマーを含むオリゴマーの組み合わせによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されており、
（ａ）第１の増幅オリゴマーが、配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｂ）第２の増幅オリゴマーが、配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、検出プローブオリゴマー。
（ａ）第１の増幅オリゴマーが、配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｂ）第２の増幅オリゴマーが、配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、検出プローブオリゴマー。
実施形態１８８．実施形態１７７～１８６のいずれか１つに記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、キット。
実施形態１８９．実施形態１７７～１８６のいずれか１つに記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、反応混合物。
実施形態１９０．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に増幅するための、実施形態１７７～１８６のいずれか１つに記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせの使用。
実施形態１９１．試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための、実施形態１７７～１８７のいずれか１つに記載の検出プローブオリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせの使用。
上記から、本発明の特定の実施形態が、例示の目的で本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修正が行われ得ることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Claims (48)
- 試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための方法であって、
（１）試料であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を含有する疑いがある試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）
（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または
（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、および
（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、を含む、接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前記試料中に存在する任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施することと、
（３）前記増幅産物の存在または非存在を検出し、それによって前記試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）の前記増幅オリゴマーを含む、請求項１に記載の方法。
- （ａ）（ｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、３５、５４、および５５からなる群から選択されるか、
または（ａ）（ｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含み、任意に配列番号２１、２３～２５、３２、３３、および３５からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）の前記増幅オリゴマーを含む、請求項１に記載の方法。
- （ａ）（ｉｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６７の配列を含み、任意に配列番号２８～３１、３４、４０、４１、および４９～５１からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
- （ａ）（ｉｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６８の配列を含み、任意に配列番号３８、３９、４３、４４、および５３からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
- （ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８０～８２および８５～１００からなる群から選択されるか、
または（ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１もしくは配列番号１７２の配列を含み、任意に（ｉ）配列番号８１、８２、８５、８７～９０、９４、および９６～９８からなる群、もしくは（ｉｉ）配列番号８０、８２、８５、および８７～１００からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。 - （ｂ）の前記増幅オリゴマーが、（ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーであり、任意に前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列であり、任意に（ｂ）の前記増幅オリゴマーが、配列番号５７～５９および６２～７７からなる群から選択される配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- （ａ）および（ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、
（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、
（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、
（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、
（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、
（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、
（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、
（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、
（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、
（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、
（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、
（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、
（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、
（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、または
（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５、である、請求項１に記載の方法。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含み、任意に、
（ａ）（ｉｉ）にあるような前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第１の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３４であり、
（ａ）（ｉｉ）にあるような前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第２の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号５３である、請求項１に記載の方法。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーと、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーとを含み、任意に、
（ａ）（ｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に（ａ）（ｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号２１の前記標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含み、任意に（ａ）（ｉｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号３４の前記標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーを含み、任意に（ｂ）の前記第１および第２の増幅オリゴマーの各々が、配列番号１７０の配列に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
任意に（ｂ）にあるような前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号９４の前記標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｂ）にあるような前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号９５の前記標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項１、１０、および１１のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ（１）の前に前記試料中の他の構成成分から前記標的核酸を精製することをさらに含み、任意に前記精製ステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含み、前記標的ハイブリダイズ配列が、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０からなる群から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出するステップ（３）が、前記インビトロ核酸増幅反応を、前記増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと、前記増幅産物の前記存在または非存在が判定される条件下で接触させ、それによって前記試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の前記存在または非存在を示すことを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含み、
任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。 - 前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４または配列番号１７５の配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含み、任意に、
（ａ）前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７４もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択されるか、あるいは
（ｂ）前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７５もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。 - 前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含み、任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
- 前記少なくとも２つの検出プローブオリゴマーが、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含み、
（Ａ）前記第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
（Ｂ）前記第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、請求項１５に記載の方法。 - ステップ（２）での前記増幅反応が、等温増幅反応であり、任意に前記増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応であり、任意に前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、前記オリゴマーの組み合わせが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーを含み、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）
（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または
（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、
（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーの組み合わせ。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）の前記増幅オリゴマーを含む、請求項２０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- （ａ）（ｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１、２３～２５、３２、３３、３５、５４、および５５からなる群から選択されるか、
または（ａ）（ｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含み、任意に配列番号２１、２３～２５、３２、３３、および３５からなる群から選択される、請求項２１に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）の前記増幅オリゴマーを含む、請求項２０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- （ａ）（ｉｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６７の前記配列を含み、任意に配列番号２８～３１、３４、４０、４１、および４９～５１からなる群から選択される、請求項２３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- （ａ）（ｉｉ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６８の前記配列を含み、任意に配列番号３８、３９、４３、４４、および５３からなる群から選択される、請求項２３に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- （ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８０～８２および８５～１００からなる群から選択されるか、
または（ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１もしくは配列番号１７２の配列を含み、任意に（ｉ）配列番号８１、８２、８５、８７～９０、９４、および９６～９８からなる群、もしくは（ｉｉ）配列番号８０、８２、８５、および８７～１００からなる群から選択される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - （ｂ）の前記増幅オリゴマーが、（ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列の５'に位置するプロモーター配列をさらに含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーであり、任意に前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列であり、任意に（ｂ）の前記増幅オリゴマーが、配列番号５７～５９および６２～７７からなる群から選択される配列を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- （ａ）および（ｂ）の前記標的ハイブリダイズ配列がそれぞれ、
（Ａ）配列番号３０および配列番号８２、
（Ｂ）配列番号３３および配列番号８２、
（Ｃ）配列番号４９および配列番号８２、
（Ｄ）配列番号２１および配列番号８９、
（Ｅ）配列番号３０および配列番号８９、
（Ｆ）配列番号３３および配列番号８９、
（Ｇ）配列番号４９および配列番号８９、
（Ｈ）配列番号２１および配列番号９２、
（Ｉ）配列番号３０および配列番号９２、
（Ｊ）配列番号２１および配列番号９４、
（Ｋ）配列番号３４および配列番号９４、
（Ｌ）配列番号５３および配列番号９４、
（Ｍ）配列番号２１および配列番号９５、
（Ｎ）配列番号３４および配列番号９５、または
（Ｏ）配列番号５３および配列番号９５、である、請求項２０に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉｉ）にあるような第１および第２の増幅オリゴマーを含み、任意に、
（ａ）（ｉｉ）にあるような前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第１の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３４であり、
（ａ）（ｉｉ）にあるような前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号１６８の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第２の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号５３である、請求項２０に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）（ｉ）にあるような増幅オリゴマーと、（ａ）（ｉｉ）にあるような増幅オリゴマーとを含み、任意に、
（ａ）（ｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号１６４の配列に含有され、配列番号１６５の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に（ａ）（ｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号２１の前記標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ａ）（ｉｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号１６７の配列を含み、任意に（ａ）（ｉｉ）にあるような前記増幅オリゴマーが、配列番号３４の前記標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項２０に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ｂ）の第１および第２の増幅オリゴマーを含み、任意に（ｂ）の前記第１および第２の増幅オリゴマーの各々が、配列番号１７０に含有され、配列番号１７１または配列番号１７２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
任意に（ｂ）にあるような前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号９４の前記標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｂ）にあるような前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号９５の前記標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項２０、２９、および３０のいずれか一項に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、前記標的ハイブリダイズ配列が、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０からなる群から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記少なくとも２つの増幅オリゴマーによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種アンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、（ｉ）配列番号１９６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含み、
任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４５、１４７～１５７、および１５９～１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択される、請求項３３に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７４および配列番号１７５からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含み、任意に、
（ａ）前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７４の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４８～１５５および１５９（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択されるか、あるいは
（ｂ）前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択される、請求項３４に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、（ｉｉ）配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択される配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含み、任意に前記検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３１、１３２、１３５、１４０、１４７、１５６、１５７、１６０、および１６１（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）からなる群から選択される、請求項３４に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記少なくとも２つの検出プローブオリゴマーが、第１および第２の検出プローブオリゴマーを含み、
（Ａ）前記第１の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７５の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第１の検出プローブオリゴマーが、配列番号１５７の標的ハイブリダイズ配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、
（Ｂ）前記第２の検出プローブオリゴマーが、（ｉ）配列番号１９７の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラに含有され、（ｉｉ）配列番号１７６の配列もしくはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、任意に前記第２の検出プローブオリゴマーが、配列番号１４８および配列番号１５２からなる群から選択される標的ハイブリダイズ配列（その相補体、ＤＮＡ等価物、およびＤＮＡ／ＲＮＡ等価物を含む）を含む、請求項３４に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を特異的に検出するための検出プローブオリゴマーであって、前記検出プローブオリゴマーが、長さが約１３～約４０個のヌクレオチドであり、第１および第２のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的増幅オリゴマーを含むオリゴマーの組み合わせによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されており、
（ａ）第１の増幅オリゴマーが、（ｉ）長さが約１４～約２０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６２の配列に含有され、配列番号１６３の配列を含むか、または（ｉｉ）長さが約１４～約２５個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６６の配列に含有され、配列番号１６７もしくは配列番号１６８の配列を含む、標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｂ）前記第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１６９に含有され、配列番号１７１、配列番号１７２、または配列番号１７３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、検出プローブオリゴマー。 - 試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を検出するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、請求項３８に記載の少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを含む、オリゴマーの組み合わせ。
- 試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に単離するための捕捉プローブオリゴマーであって、前記捕捉プローブオリゴマーが、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合している標的ハイブリダイズ配列を含み、前記標的ハイブリダイズ配列が、長さが最大約３０個の連続するヌクレオチドであり、配列番号１１～１５、１７、１９、および２０からなる群から選択される配列（そのＤＮＡ等価物およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む）を含む、捕捉プローブオリゴマー。
- 試料からＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に単離するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、請求項４０に記載の少なくとも２つの捕捉プローブオリゴマーを含む、オリゴマーの組み合わせ。
- 請求項２０～３７、３９、および４１のいずれか一項に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、キット。
- 請求項２０～３７、３９、および４１のいずれか一項に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、反応混合物。
- 試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を特異的に検出するための方法であって、
（１）試料であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種核酸を含有する疑いがある試料を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマー、および
（ｂ）配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーを含む、接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前述の試料中に存在する任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ標的核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施することと、
（３）前記増幅産物の存在または非存在を検出し、それによって前記試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。 - 試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の存在または非存在を判定するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、前記オリゴマーの組み合わせが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーを含み、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、
（ｂ）配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーの組み合わせ。 - 試料中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的核酸を特異的に検出するための検出プローブオリゴマーであって、前記検出プローブオリゴマーが、長さが少なくとも約１３個のヌクレオチドであり、第１および第２のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的増幅オリゴマーを含むオリゴマーの組み合わせによって増幅可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されており、
（ａ）前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号１８５の配列に含有され、配列番号３７、配列番号４６、または配列番号１８７の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｂ）前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号１８８に含有され、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号１８２の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、検出プローブオリゴマー。 - 請求項４５に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、キット。
- 請求項４５に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む、反応混合物。
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