CN115947837A - 单克隆抗体HIVmAb771及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了单克隆抗体HIVmAb771及其编码基因和应用。本申请的单克隆抗体HIVmAb771由重链和与之配对的轻链组成；重链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“GYTFTFWG”、“ISPYSGNT”和“ARDSLRAKSMTSFDL”，轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“QSLRNSNGDTF”、“SGS”和“MQSLQIPRT”。本申请的单克隆抗体HIVmAb771，能有效中和多种亚型/重组模式的HIV‑1假病毒，为HIV‑1感染的检测和防治提供了一种新方案和途径。

Description

单克隆抗体HIVmAb771及其编码基因和应用

技术领域

本申请涉及HIV-1中和抗体技术领域，具体涉及一种针对HIV-1 GP140蛋白的单克隆抗体及其编码基因和应用。

背景技术

HIV-1中和抗体能够有效阻止HIV-1结合并进入人的CD4+T细胞。因此，作为对HIV-1感染者的一种治疗手段，艾滋病研究领域一直在致力于开发强效的HIV-1广谱中和抗体。

最早通过噬菌体展示文库技术得到了单克隆抗体b12，但是仅能中和约40％的已知HIV-1病毒。从2010年开始，得益于单个B细胞分选和深度测序等技术的发展进步，已经从HIV-1感染者中分离出多种具有抗HIV-1广谱中和活性的人源单克隆抗体，如针对CD4结合位点的VRC01，针对可变区V1/V2和V3的PG9/PG16和PGT121，针对近膜区(MPER，membraneproximal external region)的10E8抗体和针对gp120-gp41交界处的35O22等。

鉴于HIV-1存在多种进化枝且在世界范围内不同地区存在不同的主要流行株，组合应用两种或更多种广谱中和抗体显然是一种更具潜力的治疗策略。因此，艾滋病研究领域仍需要开发出新的强效广谱反应性HIV-1中和抗体。

发明内容

本申请的目的提供一种新的针对HIV-1GP140蛋白的单克隆抗体及其编码基因和应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种针对HIV-1GP140蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体为HIVmAb771，单克隆抗体HIVmAb771由重链和与之配对的轻链组成；单克隆抗体HIVmAb771的重链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“GYTFTFWG”、“ISPYSGNT”和“ARDSLRAKSMTSFDL”，轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“QSLRNSNGDTF”、“SGS”和“MQSLQIPRT”。

需要说明的是，本申请的关键在于，以HIV-1GP140蛋白作为诱饵，通过流式细胞术从外周血中分离特异性单个记忆B细胞，利用RT-PCR和巢式PCR技术从中克隆、鉴定获得1株全人源单克隆抗体，即HIVmAb771。这株HIV-1单克隆抗体，能有效中和多种亚型/重组模式的HIV-1假病毒，具有高效、广谱性、多用途的特点，可以作为血清学诊断HIV-1的检测抗体，也为HIV-1的治疗提供了强有力的工具。

本申请的一种实现方式中，单克隆抗体HIVmAb771的重链可变区序列为Seq IDNo.1所示序列，轻链可变区序列为Seq ID No.2所示序列。

需要说明的是，以上具体序列的重链可变区和轻链可变区只是本申请的一种实现方式中具体采用的单克隆抗体序列；可以理解，对于单克隆抗体而言，影响其与抗原决定簇形成精密互补的区域是互补性决定区(缩写CDR)，具体的，即重链的CDR1、CDR2和CDR3，以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3；因此，只要保障本申请的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列不变，都能够基本实现本申请单克隆抗体的功能和作用。也就是说，本申请的HIV-1单克隆抗体，其具体序列不仅限于Seq ID No.1所示序列的重链可变区和Seq ID No.2所示序列的轻链可变区。

本申请的第二方面公开了一种编码HIV-1单克隆抗体的核酸片段，该核酸片段编码本申请的单克隆抗体中的单克隆抗体HIVmAb771的重链和轻链。

本申请的一种实现方式中，本申请的核酸片段具体包含编码Seq ID No.1所示序列的重链可变区的核酸片段，和编码Seq ID No.2所示序列的轻链可变区的核酸片段。

本申请的一种实现方式中，编码Seq ID No.1所示序列的重链可变区的核酸片段为Seq ID No.3所示序列，编码Seq ID No.2所示序列的轻链可变区的核酸片段为Seq IDNo.4所示序列。

需要说明的是，以上具体的核酸序列只是本申请的一种实现方式中具体采用的核酸序列，可以理解，对于一个氨基酸而言可以有多个密码子；因此，根据密码子的简并性，在保障编码的氨基酸序列不变的情况下，除了以上限定的核酸序列以外，还可以有若干种编码相同重链或轻链的核酸序列，都在本申请的保护范围内。

本申请的第三方面公开了一种含有本申请的核酸片段的重组质粒。

需要说明的是，本申请的重组质粒是为了能够有效的表达本申请的核酸片段，从而获得相应的重链、轻链或HIV-1单克隆抗体；因此，原则上只要能够将核酸片段转染到宿主细胞中进行核酸表达的载体都可以用于本申请。

本申请的第四方面公开了一种含有本申请的核酸片段或本申请的重组质粒的重组细胞。

需要说明的是，本申请的重组细胞是指转染有本申请的核酸片段或重组质粒的宿主细胞；一般可通过直接培养这样的宿主细胞获得本申请的重链、轻链或HIV-1单克隆抗体。可以理解，采用本申请的重组细胞对本申请的重组质粒进行蛋白表达，提取并纯化表达蛋白，即可获得本申请的HIV-1单克隆抗体。

因此，本申请的第五方面公开了本申请的单克隆抗体的制备方法，包括采用本申请的重组细胞对本申请的重组质粒进行蛋白表达，提取并纯化表达蛋白，即获得本申请的单克隆抗体。

本申请的第六方面公开了本申请针对HIV-1GP140蛋白的单克隆抗体，或者本申请的核酸片段，或者本申请的重组质粒，或者本申请的重组细胞，在制备HIV-1检测试剂和/或治疗的制剂中的应用。

需要说明的是，本申请的HIV-1单克隆抗体对多种不同亚型/重组模式的HIV-1假病毒有中和能力，因此，能够用于制备相应的HIV-1检测试剂和/或治疗制剂。至于核酸片段、重组质粒和重组细胞，这些可以作为制备HIV-1单克隆抗体的原材料，从而用于制备HIV-1检测试剂和/或治疗制剂。

可以理解，本申请的HIV-1检测试剂和/或治疗制剂中，除了本申请的HIV-1单克隆抗体HIVmAb771以外，还可以含有其他辅助性的检测/治疗缓冲液或酶，具体的，根据所采用的检测/治疗方法而定，在此不作具体限定。

本申请的第七方面公开了一种HIV-1检测和/或治疗的制剂，其中含有本申请的单克隆抗体。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请针对HIV-1GP140蛋白的单克隆抗体，即HIVmAb771，对多种不同亚型/重组模式的HIV-1假病毒有中和能力，为HIV-1感染的检测和防治提供了一种新的方案和途径。

附图说明

图1为本申请实施例中流式细胞仪分选HIV-1GP140蛋白特异性IgG+记忆B细胞结果；

图2为本申请实施例中单克隆抗体HIVmAb771重链和轻链氨基酸序列与相应家系基因的比对分析结果。

具体实施方式

本发明从一名HIV-1感染者体内分离得到了一株单克隆抗体，并发现其对多种HIV-1假病毒具有广谱中和活性。具体的，本申请使用HIV-1GP140蛋白作为诱饵，通过流式细胞术从1例HIV-1感染者外周血中分离特异性单个记忆B细胞，利用RT-PCR和巢式PCR技术从中克隆、鉴定获得1株全人源单克隆抗体，即HIVmAb771。

本申请进一步采用假病毒中和实验测试了HIVmAb771单克隆抗体的中和能力，结果显示，HIVmAb771抗体可以中和12株HIV-1假病毒中的9株，中和宽度为75％，平均中和强度为0.390μg/ml，这些数据表明，HIVmAb771是一株具有应用潜力的广谱中和抗体。

本申请筛选获得的单克隆抗体HIVmAb771，具有高效、广谱性、多用途的特点，为HIV-1感染的检测和治疗提供了强有力的工具。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。除非特别说明，以下实施例中采用的仪器、材料都是实验室常规使用的器材。

实施例

一、材料和方法

1.研究批准和生物样品

本研究由深圳市第三人民医院伦理委员会批准(批准号：2021-009)。参与者提供了书面知情同意书，用于样本采集和后续分析。外周血单个核细胞(PBMCs)样本存放在深圳市第三人民医院生物样本库。使用前将PBMCs保存在冷冻介质中，并保存在液氮中。

本例具体采集了1个样本，样本采集方法如下：

外周血单个核细胞分离：用抗凝管采静脉血10mL，转入50mL离心管中，加入10mL的PBS溶液稀释，轻轻混匀；取两支15mL离心管，各加入5mL的Ficoll分离液。然后将稀释的血液各10mL加到Ficoll分离液上层；2000rpm离心20分钟；吸取白细胞层至干净的15mL离心管中；加入PBS至10mL，1500rpm离心10分钟后去掉上清，用3mL细胞冻存液重悬，各取1mL细胞至3个冻存管中，放入冻存盒后置于-80℃冰箱过夜，次日将细胞转入液氮中长期保存。

2.从外周血单个核细胞(PBMCs)样本的B细胞中分离单克隆抗体

复苏冻存的外周血单个核细胞，用10mL的PBS洗涤2次。在100μL染色缓冲液(PBS+2％胎牛血清)中加入CD19-PE-Cy7、CD3-Pacific Blue、CD8-Pacific Blue、CD14-PacificBlue、CD27-APC-H7、IgG-FITC(均购自BD Biosciences)和带有Biotin标记的HIV-1GP140蛋白探针混合物，重悬外周血单个核细胞，于4℃染色30分钟。PBS洗涤2次后，在100μL染色缓冲液(PBS+2％胎牛血清)中加入APC和PE标记的Streptavidin(BD Biosciences)，于4℃对细胞染色30分钟。PBS洗涤2次后，通过BD AriaII分选型流式细胞仪分选HIV-1GP140蛋白特异性IgG+B细胞。其中，HIV-1GP140蛋白参考文献：Sonu Kumar,Bin Ju,Benjamin Shapero,Xiaohe Lin,Li Ren,Lei Zhang,Dan Li,Zehua Zhou,Yi Feng,Cindy Sou,Colin J Mann,Yanling Hao,Anita Sarkar,Jiali Hou,Christian Nunnally,Kunxue Hong,Shuo Wang,Xiangyang Ge,Bin Su,Elise Landais,Devin Sok,Michael B Zwick,Linling He,JiangZhu,Ian AWilson,Yiming Shao.A V_H1-69antibody lineage from an infected Chinesedonor potently neutralizes HIV-1by targeting the V3 glycan supersite.Scienceadvances.2020.6:eabb1328.。

将单个B细胞分选到含有裂解缓冲液的96孔PCR板中，然后按照文献(Hua-XinLiao,Marc C Levesque,Ashleigh Nagel,Ashlyn Dixon,Ruijun Zhang,EmmanuelWalter,Robert Parks,John Whitesides,Dawn J Marshall,Kwan-Ki Hwang,Yi Yang,XiChen,Feng Gao,Supriya Munshaw,Thomas B Kepler,Thomas Denny,M Anthony Moody,Barton F Haynes.High-throughput isolation of immunoglobulin genes from singlehuman B cells and expression as monoclonal antibodies.Journal of virologicalmethods.2009.158:171-179.)的方法进行RT-PCR和巢式PCR，分别扩增重链和轻链可变区域。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序获得的抗体可变区序列送金斯瑞生物科技有限公司合成，并由该公司将抗体重链和轻链的可变区域分别克隆到全长IgG1重链和轻链表达载体pCDNA3.4(金斯瑞生物科技有限公司)中，并大量制备抗体重链和轻链的质粒。获得金斯瑞公司制备的质粒后，利用PEI转染试剂将成对的重链和轻链表达质粒共转染293F细胞(以500mL为例)表达、使用Protein A吸附柱从培养上清中纯化单克隆抗体。具体步骤为：

293F细胞培养于8％ CO₂，37℃培养箱中，将293F细胞浓度调整为1.2×10⁶个/mL，继续培养2小时；配制A液：向12.5mL的opti-MEM(31985070，Gibco)加入250μg抗体重链质粒和250μg抗体轻链质粒；配制B液：向12.5mL的opti-MEM加入2.5mL 1mg/mL的PEI转染试剂(24885-2，Polyscieces)，静置5分钟；将A液和B液混合，静置20分钟，获得AB混合液；将25mL的AB混合液逐滴加入到500mL的293F细胞中，边滴加边摇匀；将细胞继续培养5天；然后离心293F细胞，3000g，离心20分钟，收集上清，使用0.45μm滤膜过滤；打开Protein A重力柱中盖子，利用重力让柱子中20％的乙醇溶液完全流出，用5倍柱体积的10mM的PBS溶液平衡Protein A重力柱；向Protein A重力柱内加入过滤后的细胞上清液，依靠重力作用流出；用3倍柱体积的PBS溶液清洗Protein A重力柱，再用5倍体积的0.1M的甘氨酸-盐酸溶液(pH＝3.0)洗脱；将洗脱液置于30KD的超滤浓缩管中，用PBS补满，4℃下，3500rpm离心40分钟，弃去收集管中废液，加入20mL的PBS溶液，4℃下，3500rpm离心40分钟，吸取浓缩置换后的抗体溶液，测定抗体蛋白浓度。

3.假病毒中和实验检测HIVmAb771抗体的中和能力

通过TZM-bl/假病毒中和实验测定了抗体的中和能力，试验方法参考文献：MingLi,Feng Gao,John R.Mascola,Leonidas Stamatatos,Victoria R.Polonis,MargueriteKoutsoukos,Gerald Voss,Paul Goepfert,Peter Gilbert,Kelli M.Greene,MiroslawaBilska,Denise L.Kothe,Jesus F.Salazar-Gonzalez,Xiping Wei,Julie M.Decker,Beatrice H.Hahn,David C.Montefiori.Human Immunodeficiency Virus Type 1envClones from Acute and Early Subtype B Infections for Standardized Assessmentsof Vaccine-Elicited Neutralizing Antibodies.J Virol.2005.79:10108-10125.。具体的，用DMEM生长培养基(Thermo Fisher Scientific公司产品)将单克隆抗体梯度系列稀释，加入等体积的稀释后的假病毒，5％ CO₂，37℃孵育1小时。随后将100μL含有2.5×10⁴个TZM-bl细胞和25μg/ml DEAE-dextran(Sigma公司产品)的细胞液加入96孔板中，同时设置病毒对照，即只含TZM-bl细胞和假病毒，5％CO₂，37℃培养48小时后，移除细胞培养基并向细胞孔中添加100μl Bright Lite荧光素酶试剂(Vazyme Biotech)，室温孵育2分钟，用多功能酶标仪检测荧光信号。使用GraphPad Prism8.0软件，通过对数(抑制剂)与标准化反应-可变斜率(四参数)模型计算50％抑制性浓度(IC₅₀)。

二、结果及分析

1.单克隆抗体的分离

以HIV-1GP140蛋白为诱饵，通过流式细胞术从1例HIV-1感染者外周血中分离抗原特异性IgG+记忆B细胞。结果如图1所示，该感染者外周血中HIV-1GP140特异性记忆B细胞占IgG阳性的记忆B细胞的比例分别是1.56％，经过单克隆抗体分离鉴定技术，最终获得1株全人源单克隆抗体，即HIVmAb771。

本例分离获得的单克隆抗体HIVmAb771的重链可变区域和轻链可变区域序列，以及测序结果如表1和表2所示。其中，表1为单克隆抗体及其氨基酸序列，表2为单克隆抗体重链可变区域和轻链可变区域核苷酸测序结果。

表1单克隆抗体氨基酸序列

表2单克隆抗体核苷酸测序结果

分析结果显示，HIVmAb771的重链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“GYTFTFWG”、“ISPYSGNT”和“ARDSLRAKSMTSFDL”，轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“QSLRNSNGDTF”、“SGS”和“MQSLQIPRT”，如图2所示。

2.假病毒中和实验结果

通过假病毒中和实验检测了HIVmAb771抗体对HIV-1不同亚型/重组模式假病毒的中和能力，本例制备了398F1、TRO11、X2278、25710、CE0217、CE1176、246F3、X1632、BJOX2000、CH119、CNE55和CNE8假病毒。结果如表3所示，HIVmAb771抗体可以中和12株HIV-1假病毒中的9株，中和宽度为75％，平均中和强度为0.390μg/ml，这些数据表明，HIVmAb771是一株具有应用潜力的广谱中和抗体。

表3抗体HIVmAb771中和HIV-1假病毒的测试结果

以上试验和结果表明，本例筛选获得的1株单克隆抗体HIVmAb771是一株具有较好应用潜力的广谱中和抗体，用于抵抗不同亚型/重组模式HIV-1病毒的感染，本例的功能研究揭示了一种新的广谱中和抗体HIVmAb771，提供了作为检测诊断和/或治疗干预HIV-1感染的潜在后选制剂。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.针对HIV-1GP140蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体为HIVmAb771，单克隆抗体HIVmAb771由重链和与之配对的轻链组成；

单克隆抗体HIVmAb771的重链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“GYTFTFWG”、“ISPYSGNT”和“ARDSLRAKSMTSFDL”，轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“QSLRNSNGDTF”、“SGS”和“MQSLQIPRT”。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体HIVmAb771的重链可变区序列为Seq ID No.1所示序列，轻链可变区序列为Seq ID No.2所示序列。

3.一种编码HIV-1单克隆抗体的核酸片段，其特征在于：所述核酸片段编码权利要求1或2所述的单克隆抗体中的单克隆抗体HIVmAb771的重链和轻链。

4.根据权利要求3所述的核酸片段，其特征在于：包含编码Seq ID No.1所示序列的重链可变区的核酸片段，和编码Seq ID No.2所示序列的轻链可变区的核酸片段。

5.根据权利要求4所述的核酸片段，其特征在于：编码Seq ID No.1所示序列的重链可变区的核酸片段为Seq ID No.3所示序列，编码Seq ID No.2所示序列的轻链可变区的核酸片段为Seq ID No.4所示序列。

6.一种含有权利要求3-5任一项所述的核酸片段的重组质粒。

7.一种含有权利要求3-5任一项所述的核酸片段或权利要求6所述的重组质粒的重组细胞。

8.权利要求1或2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括采用权利要求7所述的重组细胞对权利要求6所述的重组质粒进行蛋白表达，提取并纯化表达蛋白，即获得所述单克隆抗体。

9.权利要求1或2所述的单克隆抗体，或者权利要求3-5任一项所述的核酸片段，或者权利要求6所述的重组质粒，或者权利要求7所述的重组细胞，在制备HIV-1检测和/或治疗的制剂中的应用。

10.一种HIV-1检测和/或治疗的制剂，其特征在于：所述制剂中含有权利要求1或2所述的单克隆抗体。

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