CN116284362A - 广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体VacBB-548及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种广谱中和SARS‑CoV‑2的单克隆抗体VacBB‑548及其应用，该单克隆抗体由重链和与之配对的轻链组成；所述重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“EFTVSSNY”、“IYPGGST”和“ARDFGDLYFDY”，所述轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“QSVSSY”、“GAS”和“QQYGSSPRT”。本发明的新型冠状病毒单克隆抗体VacBB‑548对包括Omicron变体多种亚系在内的8种新型冠状病毒都具有交叉中和、结合活性，并且中和作用优于现有灭活疫苗分离的中和抗体，为新型冠状病毒的防治提供了一种新的选择。

Description

广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体VacBB-548及其应用

技术领域

本发明属于新型冠状病毒治疗技术领域，具体涉及一种广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体VacBB-548及其应用。

背景技术

Spike蛋白是一种三聚体跨膜糖蛋白，是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基S1和S2，其中S1主要包含有N端结构域(NTD)和受体结合区域(RBD)，负责识别和结合宿主细胞受体；S2含有膜融合过程所需的基本元件。当发生病毒感染时，S1亚基与宿主细胞的血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2，ACE2)结合，使得病毒附着在宿主细胞表面，丝氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白；然后宿主细胞的Furin酶在S蛋白的S1/S2位点进行切割，病毒-受体结合使得预融合的S蛋白三聚体不稳定，S1亚基脱落，S2亚基转变为稳定的融合后构象，从而驱动病毒膜与细胞膜融合，使病毒进入宿主细胞。中和抗体(neutralizing antibody，nAb)能够通过阻断spike蛋白与细胞受体ACE2结合从而抑制病毒进入宿主细胞；而spike蛋白上的RBD直接结合ACE2，是中和抗体最重要的识别靶点。RBD中出现的突变通常影响病毒感染和传播，甚至导致病毒逃逸自然感染或疫苗接种诱导的抗体中和作用。

同自然感染病毒一样，接种疫苗能够在人体内诱导出有效的体液免疫反应，因此在预防病毒感染上发挥了关键作用。并且多次接种疫苗可以不断刺激人体免疫系统并诱导出越来越高水平的中和抗体，尤其是一些广谱中和抗体。然而不断出现的新冠病毒变种，尤其是Omicron变种，极大程度上破坏了疫苗所建立的免疫屏障，显著逃逸了疫苗接种者体内产生的中和抗体。目前有不少文献报道，疫苗加强免疫能够在一定水平上对抗病毒逃逸，不过这其中发挥关键作用的抗体特征尚不清楚，尤其是在灭活疫苗接种者体内。同时，从灭活疫苗接种者中分离出来的广谱中和抗体，特别是能中和多种Omicron亚型变异株的，目前报道较少。

因此，为了应对世界各地SARS-CoV-2的不断进化和重组以及中和抗体逃逸的潜在风险，研发新的新型冠状病毒抗体，仍然是本领域的研究重点和难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体VacBB-548及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一方面公开了一种广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体，所述广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体为VacBB-548，该单克隆抗体由重链和与之配对的轻链组成；所述重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“EFTVSSNY”、“IYPGGST”和“ARDFGDLYFDY”，所述轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“QSVSSY”、“GAS”和“QQYGSSPRT”。

需要说明的是，本发明的关键在于，从接种三针灭活疫苗的志愿者的外周血特异性单个记忆B细胞中克隆并鉴定获得了1株单克隆中和抗体，即VacBB-548，其能够对包括新型冠状病毒Omicron变体在内的多种SARS-CoV-2变异假病毒发挥中和作用，具体包括WT(野生型)、Beta、Delta、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5。并且与现有报道的从灭活疫苗中分离的中和抗体相比，本发明的VacBB-548单克隆抗体的中和作用更强。

本发明的一种实现方式中，新型冠状病毒单克隆抗体VacBB-548的重链可变区序列为Seq ID No.1所示序列，轻链可变区序列为Seq ID No.2所示序列。

需要说明的是，以上具体序列的重链序列可变区和轻链序列可变区只是本发明的一种实现方式中具体采用的单克隆抗体序列；可以理解，对于单克隆抗体而言，影响其与抗原决定簇形成精密互补的区域是互补性决定区(缩写CDR)，具体的，即重链序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及轻链序列的CDR1、CDR2和CDR3；因此，只要保障本发明的重链序列和轻链序列的CDR1、CDR2和CDR3序列不变，都能够基本实现本发明新型冠状病毒单克隆抗体的功能和作用。也就是说，本发明的新型冠状病毒单克隆抗体，其具体序列不仅限于以上具体序列的重链序列可变区和轻链序列可变区。

本发明的第二方面公开了一种编码本发明的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的核酸片段，所述核酸片段编码VacBB-548的重链和轻链。

本发明的一种实现方式中，编码Seq ID No.1所示的重链序列可变区的核酸序列如Seq ID No.3所示，编码Seq ID No.2所示的轻链序列可变区的核酸序列如Seq ID No.4所示。

需要说明的是，以上具体的核酸序列只是本发明的一种实现方式中具体采用的核酸序列，可以理解，对于一个氨基酸而言可以有多个密码子；因此，根据密码子的简并性，在保障编码序列不变的情况下，除了以上限定的核酸序列以外，还可以有若干种编码相同重链或轻链的核酸序列，都在本发明的保护范围内。

本发明的第三方面公开了一种含有本发明的核酸片段的重组质粒。

需要说明的是，本发明的重组质粒是为了能够有效的表达本发明的核酸片段，从而获得相应的重链、轻链或新型冠状病毒单克隆抗体；因此，原则上只要能够将核酸片段转染到宿主细胞中进行核酸表达的载体都可以用于本发明。

本发明的第四方面公开了一种含有本发明的核酸片段或本发明的重组质粒的重组细胞。

需要说明的是，本发明的重组细胞是指转染有本发明的核酸片段或重组质粒的宿主细胞；一般可以通过直接培养这样的宿主细胞获得本发明的重链、轻链或新型冠状病毒单克隆抗体。

本发明的第五方面公开了一种本发明的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的制备方法，包括采用本发明的重组细胞对本发明的重组质粒进行蛋白表达，提取并纯化表达蛋白，即获得本发明的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体。

本发明的第六方面公开了本发明的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体，或者本发明的核酸片段，或者本发明的重组质粒，或者本发明的重组细胞，在制备新型冠状病毒防治药物和新型冠状病毒检测试剂中的应用。

需要说明的是，本发明的新型冠状病毒单克隆抗体能够对不同的变种具有较好的交叉中和活性，尤其是对Omicron多种亚系有效；因此，能够用于制备相应的新型冠状病毒抗体药物，或者其他具有类似功能的防治新型冠状病毒的药物。同样的，本发明单克隆抗体对不同的变种的交叉中和活性，也可以用于检测相应的新型冠状病毒变种。至于核酸片段、重组质粒和重组细胞，这些可以作为制备新型冠状病毒单克隆抗体的原材料，从而用于制备新型冠状病毒防治药物和新型冠状病毒检测试剂。

本发明的第七方面公开了一种新型冠状病毒检测试剂，该新型冠状病毒检测试剂中含有本发明的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体，或者含有能够特异性结合本发明的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的抗原。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明的新型冠状病毒单克隆抗体VacBB-548对包括Omicron变体多种亚系在内的8种新型冠状病毒都具有交叉中和活性，并且中和作用优于现有灭活疫苗分离的中和抗体，为新型冠状病毒的防治提供了一种新的选择。

附图说明

图1为本发明实施例中VacBB-548对SARS-CoV-2不同假病毒的中和试验结果。

图2为本发明实施例中VacBB-548的表位鉴定结果。

具体实施方式

本发明使用新型冠状病毒RBD蛋白作为诱饵，通过流式细胞术从已接种3剂灭活疫苗(国药集团)的志愿者中分离单个B细胞，并从中克隆、鉴定获得1株单克隆中和抗体，即VacBB-548，其针对新型冠状病毒WT株(野生型)假病毒IC₅₀范围为0.007μg/mL。VacBB-548的重链属于3-53家系，该家系的抗体通常在恢复期个体中富集，被称为公共抗体。

本发明进一步采用竞争ELISA，通过中和抗体VacBB-548分别与ACE2以及4个代表性中和抗体(类别1：P2C-1F11、类别2：BD-368-2、类别3：S309和类别4：EY6A)的竞争，预测了该单克隆抗体的结合表位。结果显示，VacBB-548与ACE2及类别1抗体P2C-1F11都表现出高强度的竞争，说明它属于类别1抗体。

最后，本发明测试了VacBB-548对新型冠状病毒WT、Beta、Delta以及Omicron亚型变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5的交叉中和活性。结果显示，VacBB-548对所有测试的变种假病毒均保持了较高的中和活性，中和能力优于大多数已报道的单克隆中和抗体。

本发明从接受野生型灭活疫苗的个体中分离并鉴定了1株单克隆中和抗体，它们的种系基因使用、表位识别、中和效力和对SARS-CoV-2变种的交叉中和与自然病毒感染诱导的中和抗体相似。除此之外，本发明证明了灭活疫苗诱导广泛单克隆中和抗体的能力，并获得了1株高效广谱中和抗体VacBB-548，可作为候选治疗性抗体，也用于被动预防各种SARS-CoV-2变异株。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。除非特别说明，以下实施例中采用的仪器、材料都是实验室常规使用的器材，所述技术方案均为本领域的常规技术。

实施例

一、材料和方法

1.研究批准和生物样品

本研究由深圳市第三人民医院伦理委员会批准(批准号：2021-030)。所有参与者提供了书面知情同意书，用于样本采集和后续分析。从深圳市第三人民医院第3次接种SARS-CoV-2灭活疫苗(北京生物制品研究所有限公司BBIBP-CorV)约2周后采集血浆和外周血单个核细胞(PBMC)样本。所有血浆样本在使用前于-80℃下储存，并在56℃下热灭活1小时。PBMC保存在液氮中。

本例具体采集了1个样本，样本采集方法如下：

外周血单个核细胞分离：用抗凝管采静脉血10mL，转入50mL离心管中，加入10mL的PBS溶液稀释，轻轻混匀；取两支15mL离心管，各加入5mL的Ficoll分离液。然后将稀释的血液各10mL加到ficoll分离液上层；2000rpm离心20分钟；吸取白细胞层至干净的15mL离心管中；加入PBS至10mL，1500rpm离心10分钟后去掉上清，用3mL细胞冻存液重悬，各取1mL细胞至3个冻存管中，放入冻存盒后置于-80℃冰箱过夜，次日将细胞转入液氮中长期保存。

2.从灭活疫苗接种者的B细胞中分离单克隆抗体

复苏冻存的外周血单个核细胞，用10mL的PBS洗涤2次。在100μL染色缓冲液(PBS+2％胎牛血清)中加入CD3-Pacific Blue、CD8-Pacific Blue、CD14-Pacific Blue、CD19-PE-Cy7、CD27-APC-H7、IgG-FITC(均来自BD Biosciences)和带有His标签的新型冠状病毒WT株RBD(Sino Biological)探针混合物，重悬外周血单个核细胞，于4℃染色30分钟。PBS洗涤2次后，在100μL染色缓冲液(PBS+2％胎牛血清)中加入APC和PE标记的抗His标签二抗(Abcam)，于4℃对细胞染色30分钟。PBS洗涤2次后，通过BD FACS Aria II分选型流式细胞仪分选新型冠状病毒WT株RBD特异性IgG+B细胞。

将单个B细胞分选到含有裂解缓冲液的96孔PCR板中，然后按照文献“Liao HX,Levesque MC,Nagel A,Dixon A,Zhang R,Walter E,et al.High-throughput isolationofimmunoglobulin genes from single human B cells and expression as monoclonalantibodies.Journal of virological methods.2009；158:171-9.”的方法进行RT-PCR和巢式PCR，分别扩增重链和轻链可变区域。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得抗体命名为VacBB-548。

将测序获得的抗体可变区序列送金斯瑞生物科技有限公司合成，并由该公司将抗体重链和轻链的可变区域分别克隆到全长IgG1重链和轻链表达载体pcDNA3.4(金斯瑞生物科技有限公司)中，并大量制备抗体重链和轻链的质粒。获得金斯瑞公司制备的质粒后，利用PEI转染试剂将成对的重链和轻链表达质粒共转染293F细胞(以500mL为例)表达、使用proteinA吸附柱从培养上清中纯化单克隆抗体。具体步骤为：

293F细胞培养于8％CO₂，37℃培养箱中，将293F细胞浓度调整为1.2×10⁶个/mL，继续培养2小时；配制A液：向12.5mL的opti-MEM(31985070，Gibco)加入250μg抗体重链质粒和250μg抗体轻链质粒；配制B液：向12.5mL的opti-MEM加入2.5mL 1mg/mL的PEI转染试剂(24885-2，Polyscieces)，静置5分钟；将A液和B液混合，静置20分钟，获得AB混合液；将25mL的AB混合液逐滴加入到500mL的293F细胞中，边滴加边摇匀；将细胞继续培养5天；然后离心293F细胞，3000g，离心20分钟，收集上清，使用0.45μm滤膜过滤；打开ProteinA重力柱中盖子，利用重力让柱子中20％的乙醇溶液完全流出，用5倍柱体积的10mM的PBS溶液平衡ProteinA重力柱；向ProteinA重力柱内加入过滤后的细胞上清液，依靠重力作用流出；用3倍柱体积的PBS溶液清洗ProteinA重力柱，再用5倍体积的0.1M的甘氨酸-盐酸溶液(pH＝3.0)洗脱；将洗脱液置于30KD的超滤浓缩管中，用PBS补满，4℃下，3500rpm离心40分钟，弃去收集管中废液，加入20mL的PBS溶液，4℃下，3500rpm离心40分钟，吸取浓缩置换后的抗体溶液，测定抗体蛋白浓度。

3.竞争ELISA法检测抗体的表位

用HRP标记试剂盒(ab102890，Abcam)标记ACE2蛋白和P2C-1F11、BD-368-2、S309、EY6A抗体。具体步骤如下：

将100μg待标记的蛋白或抗体用PBS稀释至100μL，加入10μLModifier试剂，轻柔吹打混匀。打开HRP偶联混合物的瓶盖，用移液枪头吸取抗体样本(已加入Modifier试剂)，直接加在冻干粉材料上，轻柔重悬。盖上瓶盖，室温(20～25℃)下避光放置3小时。孵育3小时(或更久)之后，在每10μL反应中的抗体内加入1μL Quencher试剂，轻柔混匀。30分钟后偶联抗体即可使用，再加入100μL甘油，混匀后-20℃保存(约0.5μg/mL)。

将SARS-CoV-2RBD蛋白(40592-V08B，Sino Biological)按照2μg/mL、每孔100μL的量加入96孔酶标板中，在4℃包被过夜。PBST(含0.5％Tween-20的PBS溶液)洗5次；用封闭液常温封闭1小时(封闭液配方：5％脱脂奶+2％BSA(PBS配制))，每孔200μL，后用PBST洗5次，后面的所有抗体稀释液配方和封闭液相同；将待检测的抗体配制成20μg/mL，之后分别与HRP标记的ACE2及4种代表性中和抗体，即P2C-1F11、BD-368-2、S309和EY6A，等体积混合后，加入96孔板中，每孔100μL，37℃孵育1小时。后用PBST洗5次；显色A液和B液(生工)按1:1混合，每孔100μL，常温避光作用20分钟；然后用50μL 2M H₂SO₄终止反应。用Varioskan LUX多模酶标仪(Thermo Scientific)在450nm(OD)下测量光密度。

4.SARS-CoV-2假病毒的中和试验

HEK-293T细胞和HEK-293T-hACE2细胞用含10％胎牛血清、1％HEPES缓冲液和1％青链霉素的DMEM培养基、于37℃5％CO₂培养箱中培养。新型冠状病毒假病毒是通过将10μg新型冠状病毒刺突蛋白表达质粒和20μg env缺陷型HIV-1骨架载体质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)与共转染HEK-293T细胞产生的。其中新型冠状病毒刺突蛋白表达质粒由金斯瑞生物科技有限公司合成制备。

假病毒制备的具体实验步骤如下：待T75细胞培养瓶中HEK-293T细胞汇合度达到80％左右时，吸弃培养基，用胰酶消化后，加入培养基重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加10mL培养基重悬细胞，计数后取6×10⁶细胞至新的T75细胞培养瓶中培养过夜；取2个1.5mL离心管，各加无血清培养基400μL，分别加入PEI转染试剂120μL和20μgpNL4-3.Luc.R-E-加10μg SARS-CoV-2刺突蛋白表达质粒，混匀后于室温静置5分钟后将两者混合，室温静置20分钟；将转染试剂加入到HEK-293TT75细胞瓶中，混匀后于培养箱中培养约7小时，吸弃培养基，加入新鲜培养基，继续培养48小时；吸取含假病毒的细胞培养基，转移至50mL离心管中，3000rpm离心10分钟，取上清用0.45μm滤器过滤，分装冻存于负80℃低温冰箱备用。

为了确定抗体中和活性，在96孔板中，单克隆抗体以100μg/mL起始5倍的倍比稀释8次，加入等体积稀释的假病毒，在37℃下孵育1小时。随后每孔加入HEK-293T-hACE2细胞100μL，即含3万个细胞。于37℃5％CO₂培养箱中培养48小时后，移除细胞培养基并向细胞孔中添加100μLBright Lite荧光素酶试剂(Vazyme Biotech)。室温孵育2分钟后，使用多功能酶标仪检测化学发光信号。使用GraphPad Prism8.0软件，通过对数(抑制剂)与标准化反应-可变斜率(四参数)模型计算50％抑制性浓度(IC₅₀)。

二、结果及分析

1.单克隆抗体的分离

本例分离获得了1株单克隆中和抗体VacBB-548，其重链可变区和轻链可变区序列，以及测序结果分别如表1和表2所示。

表1单克隆抗体序列

表2单克隆抗体核酸测序结果

分析结果显示，VacBB-548的重链序列的CDR1、CDR2和CDR3依序为“EFTVSSNY”、“IYPGGST”和“ARDFGDLYFDY”，轻链序列的CDR1、CDR2和CDR3依序为“QSVSSY”、“GAS”和“QQYGSSPRT”。

2.SARS-CoV-2假病毒中和试验结果

通过假病毒中和实验分析了新型冠状病毒RBD蛋白特异性单克隆抗体VacBB-548对新型冠状病毒变种的中和活性。为检测新型冠状病毒变种(特别是Omicron变种)对VacBB-548中和活性的影响，本例制备了Beta、Delta以及Omicron亚型变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5变种的假病毒，通过对比野生型病毒的中和活性，分析单克隆抗体对突变株的中和作用。结果如图1所示，VacBB-548可阻断新型冠状病毒假病毒对靶细胞的感染，且中和活性具有明显的浓度依赖性，对变异株假病毒都具有较强的中和作用。该结果表明，VacBB-548是具有应用潜力的新型冠状病毒广谱中和抗体。

3.单克隆抗体的表位鉴定

先前的研究表明，RBD特异性的中和抗体根据与ACE2的竞争以及RBD上识别up和down的构象表位分为四类；与ACE2直接竞争结合RBD是中和抗体有效阻断病毒与受体结合的重要机制之一。本例利用竞争ELISA，根据单克隆抗体与ACE2以及四类表位的代表性抗体(类别1：P2C-1F11，类别2：BD-368-2，类别3：S309，类别4：EY6A)的竞争预测其结合表位。结果如图2所示，VacBB-548可以与ACE2以及类别1抗体P2C-1F11竞争，说明该抗体属于类别1抗体。

综上所述，VacBB-548是具有较好应用潜力的广谱中和抗体，能够有效应对多种SARS-CoV-2变种。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (9)

1.一种广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体，其特征在于，所述广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体为VacBB-548，该单克隆抗体由重链和与之配对的轻链组成；所述重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“EFTVSSNY”、“IYPGGST”和“ARDFGDLYFDY”，所述轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“QSVSSY”、“GAS”和“QQYGSSPRT”。

2.根据权利要求1所述的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体，其特征在于，VacBB-548的重链可变区序列为Seq ID No.1所示序列，轻链可变区序列为Seq ID No.2所示序列。

3.一种编码权利要求1或2所述的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码VacBB-548的重链和轻链。

4.根据权利要求3所述的核酸片段，其特征在于，包含编码Seq ID No.1所示的重链可变区的核酸序列，其序列如Seq ID No.3所示；编码Seq IDNo.2所示的轻链可变区的核酸序列，其序列如Seq ID No.4所示。

5.一种含有权利要求3或4所述的核酸片段的重组质粒。

6.一种含有权利要求3或4所述的核酸片段或权利要求5所述的重组质粒的重组细胞。

7.根据权利要求1或2所述的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括采用权利要求6所述的重组细胞对权利要求5所述的重组质粒进行蛋白表达，提取并纯化表达蛋白，即获得所述广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体。

8.权利要求1或2所述的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体，或者权利要求3或4所述的核酸片段，或者权利要求5所述的重组质粒，或者权利要求6所述的重组细胞，在制备新型冠状病毒防治药物和新型冠状病毒检测试剂中的应用。

9.一种新型冠状病毒检测试剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的广谱中和SARS-CoV-2的单克隆抗体。

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