CN115944626B - 小分子化合物在制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小分子化合物在制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物中的应用，该小分子化合物为N‑[4‑(3‑氟苯氧基)苯基]‑N′‑(4,5,6,7‑四氢‑1氢‑吲唑‑5‑)乙二酰二胺(其结构式如式(I)所示)或者N‑[(3S,4R)‑4‑(1‑甲基‑1氢‑吡唑‑5‑)‑1‑[3‑(2‑萘氧基)丙基]‑3‑吡咯烷基]乙酰胺(其结构式如式(Ⅱ)所示)。实验结果表明，N‑[4‑(3‑氟苯氧基)苯基]‑N′‑(4,5,6,7‑四氢‑1氢‑吲唑‑5‑)乙二酰二胺和N‑[(3S,4R)‑4‑(1‑甲基‑1氢‑吡唑‑5‑)‑1‑[3‑(2‑萘氧基)丙基]‑3‑吡咯烷基]乙酰胺均能够有效提高秀丽隐杆线虫的缺氧耐受能力，有望应用于抗缺氧或缺血再灌注损伤药物的制备中。

Description

小分子化合物在制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及小分子化合物在制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

维持人体组织器官正常代谢以及功能需要良好的血液循环。当机体或者器官血流中断时，由于氧气供应不足导致器官缺血性损伤，但是在恢复供血(即再灌注)后，反而产生更加严重的组织损伤和炎症反应，即缺血器官在恢复血液灌注后缺血性损伤进一步加重的现象，称为缺血-再灌注损伤，其实质即为缺氧引起的组织损伤。目前已有数据表明重大疾病的发生率会随着年龄的增长呈现指数性升高的现象，而涉及缺氧再复氧过程的手术(重大器官的移植、冠动脉搭桥、溶栓术等)都不可避免地会发生缺血-再灌注损伤。虽然临床上可通过采取如间歇血流阻断和缺血预处理等保护措施减轻损伤，但是效果有限。因此，解析缺氧引起的组织损伤是基础生物学和临床医学研究的重要组成部分。

缺氧再复氧损伤是由多种因素共同作用的结果，目前公认的假说主要包括氧自由基的损伤、细胞内的钙超载、白细胞介素介导作用、线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡等。近年来研究发现，秀丽隐杆线虫是一种研究机体缺氧的理想模型。秀丽隐杆线虫是一种生活在自然界土壤中的非寄生性生物，成虫长约1mm，以大肠杆菌为食，已经被全基因组测序，具有发育和生命周期短、便于实验室培养与操作等特点。目前秀丽隐杆线虫被普遍应用于生命科学基础领域研究，不同于人脑细胞以及心肌细胞在缺氧条件下(<0.1％氧气)只能存活几分钟，它已经进化出适应能力，能够在较长时间的缺氧状态下存活。秀丽隐杆线虫在缺氧下可以进入低代谢的假死状态，通过减慢新陈代谢、发育和能量消耗最终存活长达3天，如果不重新引入氧气，它们最终会死亡；但复氧后，它们可以恢复正常的物理和生理活动，包括生殖等。这使得秀丽隐杆线虫成为研究缺氧调控机制的理想模型，而且其基因组的高度保守性和完善的遗传分析方法使得科研人员能够通过秀丽隐杆线虫深入研究Notch信号通路、神经鞘脂信号通路等多种调节缺氧损伤的信号通路。Notch基因及其编码的产物在结构和功能上从线虫到人类几乎所有生物中都是保守的。Notch信号途径在各种脊椎动物和无脊椎动物的各种细胞的分化命运决定中起重要作用。人类Notch基因位于第9号染色体，果蝇仅有一个Notch受体基因，线虫的Notch受体称为LIN-12和GLP-1，研究证实glp-1突变体秀丽线虫相较于野生型具有长时间缺氧耐受能力，其机制可能与glp-1突变导致的生殖腺缺失有关。对于神经鞘脂信号通路，研究显示秀丽隐杆线虫中的神经酰胺合成酶hyl-2在缺氧-复氧过程中起保护作用。野生型动物可以在缺氧条件下生存3天，而hyl-2突变型秀丽线虫对缺氧非常敏感，在缺氧2天后再复氧1天就会死于大面积坏死。在此，研究人员首先探索了导致hyl-2突变体缺氧-复氧超敏反应的相关鞘脂种类，发现缺氧相关的损伤引起非经典鞘脂1-脱氧二氢神经酰胺(doxdhcer)的积累，doxdhcer的积累会导致缺氧过敏，诱导死亡。

到目前为止，关于小分子化合物N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N’-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺和N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺尚未见有关其有缺氧耐受能力药理活性的文献报道。

发明内容

针对背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供了小分子化合物在制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种小分子化合物在制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物中的应用，所述小分子化合物为N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺，其结构式如下式(I)所示：

或者N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺，其结构式如下式(Ⅱ)所示：

优选的，所述药物是以N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺或者N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺为药物活性成分和药学上可接受的辅料组成的药物组合物。

本发明具备如下有益效果：

本发明通过考察小分子化合物即N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺和N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺各自对秀丽隐杆线虫的缺氧耐受能力影响，实验表明，上述两种小分子化合物均能够有效提高秀丽隐杆线虫的缺氧耐受能力，有望应用于抗缺氧或缺血再灌注损伤药物的制备中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺和N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺的结构式；

图2为制备的N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺的质谱图；

图3为制备的N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺；

图4为以秀丽隐杆线虫作为缺氧调控机制的理想模型研究N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺对其缺氧耐受能力的影响结果图；

图5为以秀丽隐杆线虫作为缺氧调控机制的理想模型研究N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺对其缺氧耐受的影响结果图。

具体实施方式

以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。

实施例1

1、制备N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺，具体步骤为：

1)取10mmol 2-[4-(3-氟苯基氧基)苯胺基]-2-草酰乙酸和10mmol(R)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-5-胺和30ml二氯甲烷加入100ml圆底烧瓶中，再加入20mmol二环己基碳二亚胺盐酸盐和10mmol 4-二甲氨基吡啶在室温下反应6小时；

2)反应结束后加入50ml二氯甲烷稀释，有机相再用稀盐酸萃取三次，饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水萃取一次，将有机相用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂后得到粗产物；

3)将得到的粗产物上硅胶柱层析纯化(洗脱溶剂为石油醚和二氯甲烷以体积比2：1混合得到的混合溶剂)，得到白色固体产物(3.1g,产率79.0％)。对所得产物进行高分辨质谱分析，其谱图如图2所示。由图2结果可以确定所得固体产物为N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺。

2、制备N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺，具体步骤为：

1)取10mmolN-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-3-吡咯烷基]乙酰胺和30mlDMF加入100ml圆底烧瓶中，加入30mmol氢化钠，在氮气保护条件下反应3min，再加入10mmol2-(3-溴丙氧基)萘，在室温下反应6h；

2)反应结束后将反应混合液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，将有机相用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂后得到粗产物；

3)将得到的粗产物上硅胶柱层析纯化(洗脱溶剂为石油醚和二氯甲烷以体积比1：1混合得到的混合溶剂)，得到白色固体产物(3.2g,产率81.6％)。对所得产物进行高分辨质谱分析，谱图如图3所示。由图3结果可以确定所得白色固体为N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺。

缺氧耐受(anoxia-stress tolerance)试验

本发明采用秀丽隐杆线虫作为研究缺氧调控机制的理想试验模型研究小分子化合物对秀丽隐杆线虫缺氧耐受能力的影响。具体试验步骤为：

(1)小分子化合物溶液配制

(a)将制备的N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺采用DMSO溶解，配置浓度为10mM的样品储液，然后再用NGM培养基将其浓度稀释至50μM；

(b)将制备的N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺采用DMSO溶解，配置浓度为10mM的样品储液，然后再用NGM培养基将其浓度稀释至50μM；

(2)秀丽隐杆线虫培养

本发明实验中选用的模式生物是野生型秀丽隐杆线虫N2。在实验室条件下，秀丽隐杆线虫以大肠杆菌OP50为食，将单菌落大肠杆菌接种到LB液体培养基中，在37℃摇床200rpm转速条件下生长16小时，随后取100μl菌液加到35mm的线虫生长固体培养基(Nematode Growth Medium，NGM)上，室温过夜使其具有一定厚度，随后将秀丽隐杆线虫挑到NGM培养基上，并置于20℃生化培养箱中培养。

(3)秀丽隐杆线虫的缺氧耐受试验

(a)将同步化的L1期幼龄秀丽隐杆线虫置于分别置于加有N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N’-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺(终浓度50μM)和N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺的NGM培养基中，并设置对照组，对照组中加入同等体积的DMSO，将化合物样品组和对照组同时置于20℃生化培养箱中培养，每组3个重复，每个重复至少同步化150条线虫；

(b)20℃生化培养箱中培养72小时后(即此时的秀丽隐杆线虫进入了成年期第一天)，将培养皿转至缺氧装置中(可维持低于0.1％O2浓度的环境条件)，并将整个缺氧装置放回到生化培养箱中继续以20℃条件培养；

(c)72小时后将秀丽隐杆线虫从缺氧装置中取出，置于生化培养箱20℃下常氧复苏24小时；

(d)利用铂金丝轻触没有反应的秀丽隐杆线虫被认为死亡。根据存活的线虫的数目占总数目的比值可以得出化合物对提高秀丽隐杆线虫缺氧耐受能力的作用。试验结果见图4和图5。

由图4结果可知，使用N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺(终浓度50μM)处理秀丽隐杆线虫后，给药组的秀丽隐杆线虫生存率达到34.19％，比对照组(7.08％)显著提高，说明该小分子化合物能提高秀丽隐杆线虫对缺氧耐受的能力，即得到结果显示N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N′-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺具有抗缺氧活性，有望用于制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物。

由图5结果可知，使用N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺(终浓度50M)处理秀丽隐杆线虫后，给药组的秀丽隐杆线虫生存率达到31.42％，比对照组(6.2％)显著提高，说明该小分子化合物能够提高秀丽隐杆线虫对缺氧耐受的能力。即结果显示N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺具有抗缺氧活性，有望用于制备抗缺氧或缺血再灌注损伤药物。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.小分子化合物在制备抗缺氧药物中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N´-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺，其结构式为下式（I）所示：

（I）；

或者N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺，其结构式为下式（Ⅱ）所示：

（Ⅱ）。

2.如权利要求1所述的小分子化合物在制备抗缺氧药物中的应用，其特征在于：所述药物是以N-[4-(3-氟苯氧基)苯基]-N´-(4,5,6,7-四氢-1氢-吲唑-5-)乙二酰二胺或者N-[(3S,4R)-4-(1-甲基-1氢-吡唑-5-)-1-[3-(2-萘氧基)丙基]-3-吡咯烷基]乙酰胺为药物活性成分和药学上可接受的辅料组成的药物组合物。