CN115895897A - 一种提升粪便样本中菌群纯度的方法 - Google Patents

一种提升粪便样本中菌群纯度的方法 Download PDF

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徐炜
张帮周
何剑全
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Abstract

本发明是微生物中的一种提升粪便样本中菌群纯度的方法，所述方法纤维素酶对人体粪便的纤维素成分进行降解。本发明利用纤维素酶实现对人体粪便的纤维素成分降解，便于将处理后的粪便悬液制备成菌群胶囊。

Description

一种提升粪便样本中菌群纯度的方法
技术领域
本发明涉及微生物的技术领域，尤其涉及一种提升粪便样本中菌群纯度的方法。
背景技术
粪菌移植(Fecal microbiota transplantation)能够安全有效的治疗包括艰难梭菌感染(CDI)、溃疡性结肠炎(UC)以及克罗恩病(IBD)在内的多种肠道疾病。而随着相关的研究的深入和增多，医生和患者对粪菌移植的接受度也越来越高，提供菌群移植治疗技术的机构和企业也随之增加。
现今常用的移植产品主要有口服胶囊和菌液两种。不论是哪种产品，其前处理步骤均要经过粪便样本均质化处理、过滤处理、离心收集三个步骤以达到收集除杂并洗涤样本的目的。
人类的粪便包含有四分之三的水分以及四分之一的固体，固体成分主要由大量未消化的残渣，包括蛋白质、无机物、脂肪、未消化的食物纤维、脱了水的消化液残余、以及从肠道脱落的细胞和死掉的细菌。现有的处理工艺在处理粪便样本时容易出现大量的食物残渣堵塞过滤网导致过滤困难或是彻底堵塞。过滤后的滤液中依然含有大量的小分子杂质，这些残渣多由纤维构成，难以通过过滤和离心的方式去除，杂质最终将混合在口服胶囊和菌液中并进到患者的肠道中。这些小分子杂质不仅使得患者治疗所需的口服胶囊或菌液的用量大幅增加，严重影响和患者的舒适度和体验感，与此同时也会带来相当的风险。部分患者可能会出现轻微的副作用或影响相应的治疗效果。
纤维素酶是一种复合酶，它是能够将纤维素酶降解成葡萄糖的一组酶的总称。单一的酶难以完全降解纤维素，而是需要多种酶协同作用从而完成降解。市场上所售卖的纤维素酶多来源于细菌或是真菌等微生物经过发酵提纯浓缩所得。一定量的纤维素酶即可高效的将目标物中的纤维素降解为葡萄糖，而不影响除了纤维素以外的物质。如专利申请202211547215.6公开的一种高固含量的蔗渣酶解制备葡萄糖的方法，其是将CuCl2耦合乙醇预处理样与缓冲溶液混合，然后添加添加剂和纤维素酶进行酶解，接下来分批补充蔗渣混合料和纤维素酶，补料完成后，CuCl2耦合乙醇预处理蔗渣的绝干质量与缓冲溶液的体积比为(25～35)：100。
然而，目前并无利用纤维素酶降解粪便中的纤维素成分的相关报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种提升粪便样本中菌群纯度的方法，该方法利用纤维素酶实现对人体粪便的纤维素成分降解，便于将处理后的粪便悬液制备成菌群胶囊。
本发明的另一个目的是提供一种提升粪便样本中菌群纯度的方法，该方法在粪便样本提取的前处理工艺中加入高活性纤维素酶，并优化相应的前处理工艺，从而降低最终成品中杂质的含量，减少成品的总体积，提升菌群纯度。
申请人发现：相较于其它方法，纤维素酶更适合用于降解粪便中的纤维素成分，并将处理后的粪便悬液制备成菌群胶囊，用于治疗患者。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种提升粪便样本中菌群纯度的方法，所述方法纤维素酶对人体粪便的纤维素成分进行降解。
具体包括如下步骤：
步骤1，获取粪便样本，
所述粪便样本为新鲜的粪便样本，每一份样本需单独处理。
步骤2，配置无菌均质液，
称取NaCl晶体，加入超纯水中搅拌溶解，再称取维生素C加入NaCl溶液中搅拌溶解；将溶液定容至10L即为均质液(NaCl终浓度为0.8-1.0％、维生素C终浓度为0.0002-0.005％)；
具体地说，称取80-100gNaCl晶体，加入1L超纯水中用干净的玻璃棒搅拌溶解，再称取0.2-5g维生素C加入NaCl溶液中搅拌溶解。将溶液定容至10L即为均质液(NaCl终浓度为0.8-1.0％、维生素C终浓度为0.0002-0.005％)。
进一步，并将配置好的均质液分装至2个5L的蓝盖瓶中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，取出后于室温环境静置冷却至室温备用。
步骤3.纤维素酶制备；
将改良Mandels营养液(含有20g·L-1的滤纸碎片)，灭菌后冷却至室温，然后接入里氏木霉菌液，于摇床中发酵三天；然后将发酵液通过离心机进行离心处理，取上清液再次通过滤膜以除去菌体得到滤液，将滤液通过超滤进行浓缩即得到纤维素酶；
具体地说，在250ml的锥形瓶中加入100ml改良Mandels营养液(含有20g·L-1的滤纸碎片)，于121℃灭菌20min冷却至室温后接入10％(V：V)的里氏木霉菌液，于摇床中以30℃，150rpm/min的条件发酵三天。将发酵液通过离心机5000rcf离心5min，取上清液再次通过0.22μm的滤膜以除去菌体。将滤液通过超滤进行浓缩，得到的纤维素酶置于4℃备用。
步骤4.样本处理；
将纤维素酶按照粪便重量的2％-7％(质量百分比，以下同)的浓度添加到无菌均质液，然后往粪便样本中加入无菌均质液(含有2％-7％的纤维素酶)，并于密闭环境下用搅拌机搅拌均质；
具体地说，往50g粪便样本中加入300-800ml的无菌均质液(含有2％-7％的纤维素酶)，并于10-30℃的密闭环境下用搅拌机搅拌均质，搅拌机转数为200-700rpm，搅拌时间为15-50min。
步骤5.菌体收集。
将步骤3中均质好的粪便悬液依次通过20-400目的筛网，将滤液收集新的干净容器中，并用离心机离心处理滤液；离心后弃去离心上清液，并用等量生理盐水重悬菌泥；将菌泥用生理盐水稀释100倍后用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit死活荧光染料染色，之后利用流式细胞术检测样本活性。
具体地说，将步骤3中均质好的粪便悬液依次通过4-6层的20-400目的筛网，将滤液收集新的干净容器中，并用离心机离心处理滤液，离心机离心力为4000-10000rcf，离心时间5-15min，离心温度4-30℃。离心后弃去离心上清液，并用等量生理盐水重悬菌泥，再次用相同的离心参数进行离心，弃去离心上清液并收集菌泥。将菌泥用生理盐水稀释100倍后用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit死活荧光染料染色15分钟，之后利用流式细胞术检测样本活性。
进一步，所述方法，是均质溶液中按粪便重量的5％添加纤维素酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
粪便样本中含有大量未被人体消化的食物残渣，这些残渣的主要成分为人体难以分解利用的纤维素，在均质过程中加入纤维素酶可以在不影响菌群的情况下分解粪便样本中的纤维素，从而达到除去纤维素残渣的效果。
经试验结果证明，在均质溶液中按粪便重量的5％添加纤维素酶可以分解粪便样本中的大分子纤维素，使得均质液整体更为细腻，减少肉眼可见的食物残渣，同时降低过滤消耗的时间，提升过滤收集到的滤液体积，且不影响菌群的活性，不会造成菌群活性降低从而影响疗效。
同时，纤维素酶将小分子纤维素分解为可溶于水的单糖，从而通过离心将这部分杂质从菌泥中分离去除，纯度提升，灌装成的胶囊数量减少，患者移植所需服用的胶囊数量减少，这将极大提高患者的接受度、舒适度及体验感，同时还能降低残渣引发的副作用，增加菌群移植的安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施滤液体积示意图。
图2为本发明实施菌泥重量示意图。
图3为本发明实施每100ml菌泥重量示意图。
图4为本发明实施菌泥活性示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合试验对本发明的实施进行详细说明。
一、试剂耗材
1.试验材料：
1.1试验仪器：
离心机、流式细胞仪、涡旋振荡器、移液枪、电子天平、磁力搅拌器、高压蒸汽灭菌锅。
1.2试验试剂：
NaCl(食品级)、纤维素酶、维生素C、LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial ViabilityKit死活荧光染料、生理盐水
1.3试验材料：
200目筛网、粪便样本。
二、实验方法
1.供体招募
招募志愿者提供粪便样本，在健康志愿者的知情同意下收集样本。健康志愿者都完成了一份基于问卷的访谈，并接受了体检。健康志愿者都在现场的粪便容器中提供新鲜的粪便样本，约100-200g，每一份样本单独处理。
2.无菌均质液配置
称取80-100gNaCl晶体，加入1L超纯水中用干净的玻璃棒搅拌溶解，再称取0.2-5g维生素C加入NaCl溶液中搅拌溶解。将溶液定容至10L即为均质液(NaCl终浓度为0.8-1.0％、维生素C终浓度为0.0002-0.005％)。并将配置好的均质液分装至2个5L的蓝盖瓶中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min。取出后于室温环境静置冷却至室温备用。
3.纤维素酶制备
在250ml的锥形瓶中加入100ml改良Mandels营养液(含有20g·L-1的滤纸碎片)，于121℃灭菌20min冷却至室温后接入10％(V：V)的里氏木霉菌液，于摇床中以30℃，150rpm/min的条件发酵三天。将发酵液通过离心机5000rcf离心5min，取上清液再次通过0.22μm的滤膜以除去菌体。将滤液通过超滤进行浓缩，得到的纤维素酶置于4℃备用。
4.样本处理
将步骤1中获得的粪便样本分成A、B两组，两组处理方式如下。
A组(对照组)：往50g粪便样本中加入300-800ml的无菌均质液，并于10-30℃的密闭环境下用搅拌机搅拌均质，搅拌机转数为200-700rpm，搅拌时间为15-50min。
B组(实验组)：往50g粪便样本中加入300-800ml的无菌均质液(含有2％-7％的纤维素酶)，并于10-30℃的密闭环境下用搅拌机搅拌均质，搅拌机转数为200-700rpm，搅拌时间为15-50min。
5.菌体收集
将步骤3中均质好的粪便悬液依次通过4-6层的20-400目的筛网，将滤液收集新的干净容器中，并用离心机离心处理滤液，离心机离心力为4000-10000rcf，离心时间5-15min，离心温度4-30℃。离心后弃去离心上清液，并用等量生理盐水重悬菌泥，再次用相同的离心参数进行离心，弃去离心上清液并收集菌泥。将菌泥用生理盐水稀释100倍后用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit死活荧光染料染色15分钟，之后利用流式细胞术检测样本活性。
6.数据分析
使用Graphpad Prism来处理数据。采用Welch的校正的双尾未配对Student’st测验(Two-tailed unpaired student’s t test with welch；s correction)来评价两个独立组之间的差异。差异的显著性水平用*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001来表示。
实施例：
称取90gNaCl晶体，加入1L超纯水中用干净的玻璃棒搅拌溶解，再称取1g维生素C加入NaCl溶液中搅拌溶解。将溶液定容至10L即为均质液(NaCl终浓度为0.9％、维生素C终浓度为0.001％)并将配置好的均质液分装至2个5L的蓝盖瓶中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min。取出后于室温环境静置冷却至室温备用。
往50g粪便样本中加入450ml无菌均质液(含有5％的高活性纤维素酶)，并于24℃的密闭环境下搅拌均质，搅拌机转数为500rpm，搅拌时间30min。将均质好的粪便悬液依次通过50目、100目、150目、200目、250目、300目共六层筛网，将滤液收集新的干净容器中，并用离心机离心处理滤液，离心机离心力为7500rcf，离心时间7min，离心温度24℃。离心后弃去离心上清液，并用等量生理盐水重悬菌泥，再次用相同的离心参数进行离心，弃去离心上清液并收集菌泥。将菌泥用生理盐水稀释100倍后用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterialViability Kit死活荧光染料染色15分钟，之后利用流式细胞术检测样本活性。
三、结果分析
1.滤液体积
结果如图1所示，两个样本实验组收集到的滤液体积均高于对照组，经纤维素酶处理后，滤液体积增加17.70％。实验组样本添加纤维素酶均质30min后粪便悬液更为细腻，未见明显大块食物残渣。经200目滤网过滤时，过滤效率优于对照组，且不易堵塞滤网，滤网上的残留物更少。
2.菌泥重量
虽然不同样本间存在差异，但整体趋势是相同的。两组相比，实验组收集到的菌泥总量更少(图2)。相较于对照组，实验组的菌泥总量减少15.65％，每100ml滤液收集到的菌泥重量减少21.53％(图3)。
3.菌泥活性
样本一实验组菌泥活性略高于对照组(p<0.05)，样本二两组间菌泥活性无显著性差异(p>0.05)(图4)。综合来看，纤维素酶对菌群活性无影响。
综上所述，粪便样本中含有大量未被人体消化的食物残渣，这些残渣的主要成分为人体难以分解利用的纤维素，这导致粪便样本在过滤提取时容易出现大分子残渣堵塞滤网及大量小分子残渣残留在菌泥中难以去除的情况。而细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，因此在均质过程中加入纤维素酶可以在不影响菌群的情况下分解粪便样本中的纤维素，从而达到防止堵塞以及除去纤维素残渣的效果。
经试验结果证明，在均质溶液中按粪便重量的5％添加纤维素酶可以分解粪便样本中的大分子纤维素，使得均质液整体更为细腻，减少肉眼可见的食物残渣，有效防止过滤时堵塞现象的发生。同时降低过滤消耗的时间，提升过滤收集到的滤液体积，减少不必要的损耗，且不影响菌群的活性，不会造成菌群活性降低从而影响疗效。与此同时，纤维素酶将小分子纤维素分解为可溶于水的单糖，从而通过离心将这部分杂质从菌泥中分离去除。纤维素酶处理后，菌泥重量降低15.65％，纯度提升，灌装成的胶囊数量减少，患者移植所需服用的胶囊数量减少。这将极大提高患者的接受度、舒适度及体验感，同时还能降低残渣引发的副作用，增加菌群移植的安全性。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于所述方法纤维素酶对人体粪便的纤维素成分进行降解。
2.根据权利要求1所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于具体包括如下步骤：
步骤1，获取粪便样本，
步骤2，配置无菌均质液，
称取NaCl晶体，加入超纯水中搅拌溶解，再称取维生素C加入NaCl溶液中搅拌溶解；将溶液定容至10L即为均质液(NaCl终浓度为0.8-1.0％、维生素C终浓度为0.0002-0.005％)；
步骤3.纤维素酶制备；
将改良Mandels营养液(含有20g·L-1的滤纸碎片)，灭菌后冷却至室温，然后接入里氏木霉菌液，于摇床中发酵三天；然后将发酵液通过离心机进行离心处理，取上清液再次通过滤膜以除去菌体得到滤液，将滤液通过超滤进行浓缩即得到纤维素酶；
步骤4.样本处理；
将纤维素酶按照粪便重量的质量百分比2％-7％的浓度添加到无菌均质液，然后往粪便样本中加入无菌均质液，并于密闭环境下用搅拌机搅拌均质；
步骤5.菌体收集；
将步骤3中均质好的粪便悬液依次通过20-400目的筛网，将滤液收集新的干净容器中，并用离心机离心处理滤液；离心后弃去离心上清液，并用等量生理盐水重悬菌泥；将菌泥用生理盐水稀释100倍后用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit死活荧光染料染色，之后利用流式细胞术检测样本活性。
3.根据权利要求2所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于所述步骤1中，所述粪便样本为新鲜的粪便样本，每一份样本需单独处理。
4.根据权利要求3所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于步骤2中，称取80-100gNaCl晶体，加入1L超纯水中用干净的玻璃棒搅拌溶解，再称取0.2-5g维生素C加入NaCl溶液中搅拌溶解。将溶液定容至10L即为均质液。
5.根据权利要求4所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于步骤2中，NaCl终浓度为0.8-1.0％、维生素C终浓度为0.0002-0.005％，并将配置好的均质液分装至2个5L的蓝盖瓶中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，取出后于室温环境静置冷却至室温备用。
6.根据权利要求2所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于步骤3中，在250ml的锥形瓶中加入100ml改良Mandels营养液(含有20g·L-1的滤纸碎片)，于121℃灭菌20min冷却至室温后接入10％(V：V)的里氏木霉菌液，于摇床中以30℃，150rpm/min的条件发酵三天。将发酵液通过离心机5000rcf离心5min，取上清液再次通过0.22μm的滤膜以除去菌体。将滤液通过超滤进行浓缩，得到的纤维素酶置于4℃备用。
7.根据权利要求4所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于步骤4中，具体地说，往50g粪便样本中加入300-800ml的无菌均质液(含有2％-7％的纤维素酶)，并于10-30℃的密闭环境下用搅拌机搅拌均质，搅拌机转数为200-700rpm，搅拌时间为15-50min。
8.根据权利要求4所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于步骤5中，将步骤3中均质好的粪便悬液依次通过4-6层的20-400目的筛网，将滤液收集新的干净容器中，并用离心机离心处理滤液，离心机离心力为4000-10000rcf，离心时间5-15min，离心温度4-30℃；离心后弃去离心上清液，并用等量生理盐水重悬菌泥，再次用相同的离心参数进行离心，弃去离心上清液并收集菌泥；将菌泥用生理盐水稀释100倍后用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit死活荧光染料染色15分钟，之后利用流式细胞术检测样本活性。
9.根据权利要求2所述的提升粪便样本中菌群纯度的方法，其特征在于步骤4中，均质溶液中按粪便重量的5％添加纤维素酶。
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