CN111888322B - 一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用 - Google Patents

一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111888322B
CN111888322B CN202010987079.7A CN202010987079A CN111888322B CN 111888322 B CN111888322 B CN 111888322B CN 202010987079 A CN202010987079 A CN 202010987079A CN 111888322 B CN111888322 B CN 111888322B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sheep placenta
extracting
placenta
supernatant
extract
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010987079.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111888322A (zh
Inventor
张向飞
胡忠国
王翔
王洁
朱熠
樊红柳
肖静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHENGDU QINGKE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Original Assignee
CHENGDU QINGKE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHENGDU QINGKE BIO-TECHNOLOGY CO LTD filed Critical CHENGDU QINGKE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Priority to CN202010987079.7A priority Critical patent/CN111888322B/zh
Publication of CN111888322A publication Critical patent/CN111888322A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111888322B publication Critical patent/CN111888322B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A61K8/982—Reproductive organs; Embryos, Eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/805—Corresponding aspects not provided for by any of codes A61K2800/81 - A61K2800/95

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用，提取方法包括以下步骤：分离获得羊胎盘子叶，将羊胎盘子叶置于过氧乙酸中浸泡后清洗；将羊胎盘子叶破碎并均质，得羊胎盘浆液；将羊胎盘浆液震荡提取，并离心，得沉淀和上清液；调节上清液至中性后进行微滤，得微滤液，继续对微滤液进行超滤，得超滤液；向沉淀中加水，调节混合液pH值为碱性，然后将混合液于50‑65℃条件下振荡提取；将提取后的混合液降至室温，调节pH值为6‑6.5，然后向其中加入木瓜蛋白酶，于50‑60℃条件下继续振荡酶解，最后灭酶，离心，收集上清液；将超滤液和上清液混合，制得。该提取液可有效解决现有的提取液存在的美白效果差的问题。

Description

一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用
技术领域
本发明属于胎盘提取技术领域，具体涉及一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用。
背景技术
胎盘(Placenta)又名“紫河车”，为常用中药，被认为有补肾益精、益气养血的功效。现代医学研究表明：胎盘含有多种免疫球蛋白、活性肽等生物活性物质及氨基酸、矿物质等成分，可作为机体免疫功能的调节剂和营养美容的保健品。科学家对多种动物胎盘进行对比实验后发现，羊胎盘的细胞组织结构与人胎盘最为相似，可望成为同人类胎盘具有同等养生价值的替代物。
随着社会经济的不断进步和物质生活的丰富，人们对爱美的追求越来越强烈，近年来各种美容护肤品不断被开发出来，一些美容护肤品采用了羊胎素、羊胚胎或羊胎盘提取物，配合其他保湿剂、润肤剂等成分，并认为其中的羊胎素、羊胚胎或羊胎盘提取物具有美容养颜、抗衰除皱等功能特点。
但是，按照现有的方法无法将充分将羊胎盘中的有效物质提出，使得提取液美白功效不明显。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种羊胎盘提取液及其提取方法和应用，该提取方法提取获得的提取液可有效解决现有的提取液存在的美白功效不明显的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜胎盘，分离获得羊胎盘子叶，冲洗至水流无血色；
(2)向步骤(1)中清洗后的羊胎盘子叶中加水，破碎并均质，得羊胎盘浆液；
(3)将步骤(2)中的羊胎盘浆液于35-45℃条件下震荡提取，然后调节pH值为5-6，于3-5℃条件下离心，得沉淀和上清液；
(4)调节步骤(3)中上清液至中性后进行微滤，得微滤液，继续对微滤液进行超滤，得超滤液；
(5)向步骤(3)中的沉淀中加水，调节混合液pH值为碱性，然后将混合液于50-65℃条件下振荡提取；
(6)将步骤(5)中提取后的混合液降至室温，调节pH值为6-6.5，然后向其中加入木瓜蛋白酶，于50-60℃条件下继续振荡酶解，最后灭酶，离心，收集上清液；
(7)将步骤(4)中超滤液和步骤(6)中上清液混合，制得。
进一步地，步骤(1)中用剂量为100U/ml的卡那霉素溶液和生理盐水的混合液进行冲洗。
进一步地，步骤(1)中冲洗后的羊胎盘子叶还置于过氧乙酸中浸泡，然后在清洗至无过氧乙酸残留，其中，过氧乙酸的体积浓度为0.1-0.3％，浸泡时间为5-10min。
进一步地，步骤(1)中过氧乙酸的体积浓度为0.1％，浸泡时间为10min。
上述方案中，先将羊胎盘子叶用卡那霉素溶液清洗，然后再用过氧乙酸进行浸泡，进行病毒灭活，然后向其中加水进行破碎均质，方便后续提取过程中有效物质溶出，获得羊胎盘浆液，对羊胎盘浆液进行振荡浸提，可将羊胎盘细胞内的有效成分提出，然后进行离心，对离心后的上清液进行微滤和超滤，获得有效成分一，将离心后的沉淀加水后调节呈碱性，在碱性条件下，继续进行浸提，使得细胞膜的通透性得到改变，使得细胞内的有效成分充分溶出，获得有效成分二，将两种有效成分混合，制得羊胎盘提取液，该提取过程中，可充分将羊胎盘细胞内和细胞膜中的有效成分提取获得，提高提取液中的有效成分的含量，进而，提高羊胎盘提取液中有效成分的种类和含量，使得该提取液具有美白功能。
进一步地，步骤(2)中羊胎盘与水按照质量体积比为1:3-5的比例混合，破碎过程的转速为5000-10000rpm，均质3-5次，每次3-5min。
进一步地，步骤(2)中羊胎盘与水按照质量体积比为1:3的比例混合，破碎过程的转速为10000rpm，均质5次，每次4min。
上述方案中，将羊胎盘和水按照1：3-5的比例混合后，在5000-10000转的转速下破碎，羊胎盘中的有效成分可充分溶解于水中，水占比过大，导致后续过滤费时费力，水占比过小，有效成分溶解后易出现饱和，导致有效成分提取不完全。
进一步地，步骤(3)中羊胎盘浆液振荡提取的转速为110-130rpm，提取时间为160-200min，离心转速为9000-11000rpm，离心时间为8-12min。
进一步地，步骤(3)中羊胎盘浆液振荡提取的转速为120rpm，提取时间为180min，离心转速为10000rpm，离心时间为10min。
上述方案中，采用110-130rpm的转速下提取160-200min，可初步将羊胎盘细胞中的有效成分进行溶出，提高初步溶出量，然后在9000-11000rpm转速下，可充分将固液两相物质分离，实现将含有有效成分的提取液与固态物质分离。
进一步地，步骤(4)中微滤过程滤膜的孔径为0.2μm，超滤过程中滤膜的孔径为10KD和3KD。
进一步地，步骤(4)中微滤的具体操作为：微滤过程中，蠕动泵的转速为80rpm，微滤至滤液体积占上清液总体积的10％时，停止，收集微滤液。
进一步地，步骤(4)中超滤的具体操作为：先将微滤液用孔径为10KD的超滤膜进行超滤，滤过液体积至微滤液体积一半时停止，然后将滤过液继续用孔径为3KD的超滤膜进行超滤，当滤过液体积减少一半时，停止，收集剩余滤过液，即为超滤液。
上述方案中，分离出的提取液中含有大量杂质，先使用0.2μm的滤膜进行过滤，可将提取液中大于该孔径的杂质去除，再将微滤液用10KD孔径的超滤膜进行过滤，使得尺寸大于10KD的杂质被滤除，最后将滤液用3KD的超滤膜进行过滤，使得尺寸小于3KD的杂质被滤除，尺寸在10-3KD之间的物质被收集，该物质便为所需的有效成分。
进一步地，步骤(5)中沉淀与水的质量体积比为1:3-30，振荡提取的转速为110-130rpm，提取时间为3-6h。
进一步地，步骤(5)中沉淀与水的质量体积比为1:3，振荡提取的转速为120rpm，提取时间为3h。
进一步地，步骤(6)木瓜蛋白酶的加入量为4500-5000U/g，酶解时间为100-140min。
进一步地，步骤(6)木瓜蛋白酶的加入量为4800U/g，酶解时间为120min。
上述方案中，将羊胎盘浆液离心后的沉淀与水混合，调节溶液为碱性，然后在50-65℃条件下振荡提取，可初步将沉淀细胞膜中的有效成分提取，再向其中加入木瓜蛋白酶，利用木瓜蛋白酶进行酶解，进一步提高有效成分的提取量。
进一步地，步骤(7)中超滤液与上清液按照1-2:1-2的体积比混合。
进一步地，步骤(7)中超滤液与上清液按照1:1的体积比混合。
上述方案中，将超滤液和上清液按照特定比例混合，获得羊胎盘提取液，该提取液中所含的有效成分种类更多，其产生的美白效果更好。
本发明所产生的有益效果为：
本发明中的方法分别将羊胎盘细胞内容物和细胞膜成分中的有效物质提取，可充分获得羊胎盘中的美白有效成分，使得羊胎盘提取液应用于化妆品中，使得化妆品具有显著的美白效果；而且，本发明中的提取方法简单，便于操作，提取过程中使用的化学溶剂较少。
附图说明
图1为实施例3中提取液培养小鼠黑色素细胞96h后的镜下细胞形态图；
图2为对比例1中提取液处理96h后的上清液及沉淀颜色对比图；
图3为实施例3中提取液处理96h后的上清液及沉淀颜色对比图；
图4为实施例2中提取液培养小鼠黑色素细胞96h后的镜下细胞形态图；
图5为对比例2中提取液处理96h后的上清液及沉淀颜色对比图；
图6为实施例2中提取液处理96h后的上清液及沉淀颜色对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种羊胎盘提取液，其提取方法包括以下步骤：
(1)组织清洗和病毒灭活：将新鲜羊胎盘置于生物安全柜中的托盘里，用剪刀和镊子分离出子叶，弃去胎膜及其余组织，将分离好的羊胎盘子叶用含100u/mL卡那霉素的0.9％生理盐水冲洗3次至水流无色；然后用0.1％的过氧乙酸溶液浸泡羊胎盘子叶10min，浸泡结束后立即用灭菌水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留；
(2)破碎均质：向步骤(1)中清洗后的羊胎盘子叶中加无菌水，羊胎盘子叶与水的质量体积比为100g：350ml，用高剪切乳化均质机进行破碎，转速为6000rpm，均质3次，每次5min，得羊胎盘浆液；
(3)水浴浸提：将步骤(2)中的羊胎盘浆液于35℃恒温水浴振荡器中，转速110rpm振荡提取160min，然后调节pH值为5，于3℃条件下，转速9000rpm离心8min，得沉淀和上清液；
(4)微滤和超滤：调节步骤(3)中上清液至中性后进行用0.2μm孔径的滤膜进行微滤，得微滤液，具体微滤操作为：蠕动泵的转速为80rpm，微滤至滤液体积占上清液总体积的10％时，停止；继续对微滤液用孔径为10KD和3KD孔径滤膜进行超滤，具体超滤操作为：先将微滤液用孔径为10KD的超滤膜进行超滤，滤过液体积至微滤液体积一半时停止，然后将滤过液继续用孔径为3KD的超滤膜进行超滤，当滤过液体积减少一半时，停止，收集剩余滤过液，得超滤液；
(5)沉淀碱提：向步骤(3)中的沉淀中加水，沉淀与水的质量体积比为1:10，调节混合液pH值为10，然后将混合液置于恒温振荡水浴锅中，于55℃、110rpm条件下振荡提取3h；
(6)沉淀酶解：将步骤(5)中提取后的混合液降至室温，调节pH值为6，然后向其中加入剂量为4600U/g的木瓜蛋白酶，于50℃条件下继续振荡酶解110min，最后将PH调至7.0，在90℃沸水中灭酶处理10min，然后于4℃、10000rpm离心10min，收集上清液；
(7)混合：将步骤(4)中超滤液和步骤(6)中上清液按照1:1.5的体积比混合，制得。
实施例2
一种羊胎盘提取液，其提取方法包括以下步骤：
(1)组织清洗和病毒灭活：将新鲜羊胎盘置于生物安全柜中的托盘里，用剪刀和镊子分离出子叶，弃去胎膜及其余组织，将分离好的羊胎盘子叶用含100u/mL卡那霉素的0.9％生理盐水冲洗5次至水流无色；然后用0.3％的过氧乙酸溶液浸泡羊胎盘子叶5min，浸泡结束后立即用灭菌水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留；
(2)破碎均质：向步骤(1)中清洗后的羊胎盘子叶中加无菌水，羊胎盘子叶与水的质量体积比为100g：500ml，用高剪切乳化均质机进行破碎，转速为9000rpm，均质5次，每次3min，得羊胎盘浆液；
(3)水浴浸提：将步骤(2)中的羊胎盘浆液于45℃恒温水浴振荡器中，转速130rpm振荡提取200min，然后调节pH值为6，于5℃条件下，转速11000rpm离心8min，得沉淀和上清液；
(4)微滤和超滤：调节步骤(3)中上清液至中性后进行用0.2μm孔径的滤膜进行微滤，得微滤液，具体微滤操作为：蠕动泵的转速为80rpm，微滤至滤液体积占上清液总体积的10％时，停止；继续对微滤液用孔径为10KD和3KD孔径滤膜进行超滤，具体超滤操作为：先将微滤液用孔径为10KD的超滤膜进行超滤，滤过液体积至微滤液体积一半时停止，然后将滤过液继续用孔径为3KD的超滤膜进行超滤，当滤过液体积减少一半时，停止，收集剩余滤过液，得超滤液；
(5)沉淀碱提：向步骤(3)中的沉淀中加水，沉淀与水的质量体积比为1:25，调节混合液pH值为11，然后将混合液置于恒温振荡水浴锅中，于50-65℃、130rpm条件下振荡提取4h；
(6)沉淀酶解：将步骤(5)中提取后的混合液降至室温，调节pH值为6.5，然后向其中加入剂量为4800U/g的木瓜蛋白酶，于60℃条件下继续振荡酶解140min，最后将PH调至7.0，在100℃沸水中灭酶处理10min，然后于4℃、10000rpm离心10min，收集上清液；
(7)混合：将步骤(4)中超滤液和步骤(6)中上清液按照2:1的体积比混合，制得。
实施例3
一种羊胎盘提取液，其提取方法包括以下步骤：
(1)组织清洗和病毒灭活：将新鲜羊胎盘置于生物安全柜中的托盘里，用剪刀和镊子分离出子叶，弃去胎膜及其余组织，将分离好的羊胎盘子叶用含100u/mL卡那霉素的0.9％生理盐水冲洗5次至水流无色；然后用0.1％的过氧乙酸溶液浸泡羊胎盘子叶10min，浸泡结束后立即用灭菌水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留；
(2)破碎均质：向步骤(1)中清洗后的羊胎盘子叶中加无菌水，羊胎盘子叶与水的质量体积比为100g：300ml，用高剪切乳化均质机进行破碎，转速为10000rpm，均质4次，每次5min，得羊胎盘浆液；
(3)水浴浸提：将步骤(2)中的羊胎盘浆液于40℃恒温水浴振荡器中，转速120rpm振荡提取180min，然后调节pH值为5，于4℃条件下，转速10000rpm离心10min，得沉淀和上清液；
(4)微滤和超滤：调节步骤(3)中上清液至中性后进行用0.2μm孔径的滤膜进行微滤，得微滤液，具体微滤操作为：蠕动泵的转速为80rpm，微滤至滤液体积占上清液总体积的10％时，停止；继续对微滤液用孔径为10KD和3KD孔径滤膜进行超滤，具体超滤操作为：先将微滤液用孔径为10KD的超滤膜进行超滤，滤过液体积至微滤液体积一半时停止，然后将滤过液继续用孔径为3KD的超滤膜进行超滤，当滤过液体积减少一半时，停止，收集剩余滤过液，得超滤液；
(5)沉淀碱提：向步骤(3)中的沉淀中加水，沉淀与水的质量体积比为1:3，调节混合液pH值为11，然后将混合液置于恒温振荡水浴锅中，于60℃、120rpm条件下振荡提取3h；
(6)沉淀酶解：将步骤(5)中提取后的混合液降至室温，调节pH值为6.5，然后向其中加入剂量为4800U/g的木瓜蛋白酶，于55℃条件下继续振荡酶解120min，最后将PH调至7.0，在100℃沸水中灭酶处理10min，然后于4℃、10000rpm离心10min，收集上清液；
(7)混合：将步骤(4)中超滤液和步骤(6)中上清液按照1:1的体积比混合，制得。
对比例1
一种羊胎盘提取液，其提取方法包括以下步骤：
(1)组织清洗和病毒灭活：将新鲜羊胎盘置于生物安全柜中的托盘里，用剪刀和镊子分离出子叶，弃去胎膜及其余组织，将分离好的羊胎盘子叶用含100u/mL卡那霉素的0.9％生理盐水冲洗5次至水流无色；然后用0.2％的过氧乙酸溶液浸泡羊胎盘子叶8min，浸泡结束后立即用灭菌水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留；
(2)破碎均质：向步骤(1)中清洗后的羊胎盘子叶中加无菌水，羊胎盘子叶与水的质量体积比为100g：400ml，用高剪切乳化均质机进行破碎，转速为8000rpm，均质4次，每次5min，得羊胎盘浆液；
(3)沉淀酶解：调节步骤(2)中羊胎盘浆液pH值为6.5，然后向其中加入剂量为4800U/g的木瓜蛋白酶，于55℃条件下继续振荡酶解120min，最后将PH调至7.0，在100℃沸水中灭酶处理10min，然后于4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，制得。
对比例2
一种羊胎盘提取液，其提取方法包括以下步骤：
(1)组织清洗和病毒灭活：将新鲜羊胎盘置于生物安全柜中的托盘里，用剪刀和镊子分离出子叶，弃去胎膜及其余组织，将分离好的羊胎盘子叶用含100u/mL卡那霉素的0.9％生理盐水冲洗5次至水流无色；然后用0.2％的过氧乙酸溶液浸泡羊胎盘子叶8min，浸泡结束后立即用灭菌水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留；
(2)破碎均质：向步骤(1)中清洗后的羊胎盘子叶中加无菌水，羊胎盘子叶与水的质量体积比为100g：400ml，用高剪切乳化均质机进行破碎，转速为80000rpm，均质4次，每次5min，得羊胎盘浆液；
(3)水浴浸提：将步骤(2)中的羊胎盘浆液于40℃恒温水浴振荡器中，转速120rpm振荡提取180min，然后调节pH值为5，于4℃条件下，转速10000rpm离心10min，得沉淀和上清液；
(4)微滤和超滤：调节步骤(3)中上清液至中性后进行用0.2μm孔径的滤膜进行微滤，得微滤液，具体微滤操作为：蠕动泵的转速为80rpm，微滤至滤液体积占上清液总体积的10％时，停止；继续对微滤液用孔径为10KD和3KD孔径滤膜进行超滤，具体超滤操作为：先将微滤液用孔径为10KD的超滤膜进行超滤，滤过液体积至微滤液体积一半时停止，然后将滤过液继续用孔径为3KD的超滤膜进行超滤，当滤过液体积减少一半时，停止，收集剩余滤过液，得超滤液；
(5)沉淀酶解：调节步骤(3)中沉淀pH值为6.5，然后向其中加入剂量为4800U/g的木瓜蛋白酶，于55℃条件下振荡酶解120min，最后将PH调至7.0，在100℃沸水中灭酶处理10min，然后于4℃、10000rpm离心10min，收集上清液；
(6)混合：将步骤(4)中超滤液和步骤(5)中上清液按照1:1的体积比混合，制得。
试验例
美白功效评价
建立小鼠黑色素瘤细胞(B16-F1)模型美白功效评价的试验方法，具体为：
(1)将样本分装至无菌1.5mLEP管中，-20℃保存备用；
(2)样本稀释：考察样本在6孔板中培养是否具有毒性，将样本浓度设定为C1(原液浓度占比1/5)、C2(原液浓度占比1/10)、C3(原液浓度占比1/40)、C4(原液浓度占比1/400)、阴性对照(0.01MPBS浓度占比1/5)、阳性对照(1mg/mL曲酸浓度占比1/5)；
(3)在生物安全柜中打开6孔板，用微量移液器每孔加入10μL25mmol的促黑剂，各孔再加入相对应的400μL稀释样本组；
(4)将准备好的80％融合度的细胞消化备用；
(5)细胞消化：弃废液，清洗细胞，加入1.5mL0.25％胰蛋白酶消化；将消化下来的细胞离心；倒掉上清，将细胞弹散，加入2mLDH+15％FBS培养液混匀，稀释10倍后计数；
(6)根据计数结果，计算总的细胞悬液量，制成细胞悬液，充分摇匀后放入37℃，5％CO2浓度孵箱中培养；
(7)细胞形态观察：培养24h后镜下观察细胞形态和融合度；
(8)细胞收获：细胞培养至96h后，镜下观察细胞形态和融合度，并拍照记录；先收集各组细胞上清拍照后待用，细胞消化离心后沉淀拍照，倒掉上清，细胞沉淀备用；
(9)黑色素含量检测：将各组细胞上清用酶标仪在405nm处测得吸光度值；各组细胞沉淀也进行黑色素含量检测；
(10)结果判定：阴性对照细胞上清与沉淀均为黑色，阳性对照细胞上清为正常培养基颜色，细胞沉淀为灰色即为有效；若样本组细胞上清与沉淀和阴性组比较颜色均有所变浅，则判断样本此浓度有美白功效。
1、分别对对比例1中的提取液和实施例3中的提取液进行美白效果评价，具体为：
(1)接种：将小鼠黑色素瘤细胞(B16-F1)接种至6孔板，接种密度为2.5×104个/mL，5×104个/孔；
(2)加药：接种时同时加药，阳性对照组为200ug/mL曲酸，加药同时加入促黑激素；
(3)检测：加药后观测细胞形态，在96h后收集细胞观察色度，并测定吸光度值，具体结果见图1-图3和表1-2。
通过图1可以看出，小鼠黑色素瘤细胞在实施例3中的提取液中培养96h后细胞的形态均正常，证明该提取液无毒性。
通过图2和图3可以看出，对比文件1中提取液在美白功效评价试验中上清液与细胞沉淀的颜色均接近阴性对照组，证明该提取液不具美白功效；实施例3中的提取液在美白功效试验中上清液与细胞沉淀颜色均明显变浅，更接近阳性对照组，证明具有显著的美白功效。
表1：对比例1中提取液美白功效评价试验酶标检测数据表
Figure GDA0003781671090000081
表2：实施例3中提取液美白功效评价试验酶标检测数据表
Figure GDA0003781671090000082
通过表1和表2中数据可以得知，实施例3和对比例1中的提取液进行美白功效评价实验96h后，在405nm处对沉淀中的黑色素含量进行检测，实施例3中的黑色素含量明显低于对比例1中的黑色素含量，证明实施例3中的提取液美白功效显著。
2、分别将对比例2中的提取液和实施例2中的提取液进行美白效果评价，具体为：
(1)接种：将小鼠黑色素瘤细胞(B16-F1)接种至6孔板，接种密度为2.5×104个/mL，5×104个/孔；
(2)加药：接种时同时加药，阳性对照组为200ug/mL曲酸，加药同时加入促黑激素；
(3)检测：加药后观测细胞形态，在96h后收集细胞观察色度，具体结果见图4-6和表3-4。
通过图4可以看出，小鼠黑色素瘤细胞在实施例2中的提取液中培养96h后细胞的形态均正常，证明该提取液无毒性。
通过图5和图6可以看出，对比例2中提取液在美白功效评价试验中上清液与细胞沉淀的颜色无明显变化，证明该提取液不具美白功效；实施例2中的提取液在美白功效试验中上清液与细胞沉淀颜色均明显变浅，细胞沉淀变浅更明显，更接近阳性对照组，证明具有显著的美白功效。
表3对比例2中提取液美白功效评价试验酶标检测数据表
Figure GDA0003781671090000091
表4实施例2中提取液美白功效评价试验酶标检测数据表
Figure GDA0003781671090000092
通过表3和表4中数据得知，对比例2和实施例3中的沉淀吸光度值均小于阴性对照组，但是对比例2中的吸光度值的减小幅度不如实施例2中大，实施例2中的上清液吸光度值明显小于阴性对照组，证明对比例2和实施例2中的提取液具有一定的美白效果，但是实施例2中提取液的美白效果明显大于对比例2中的提取液。

Claims (10)

1.一种具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取新鲜胎盘，分离获得羊胎盘子叶，冲洗至水流无血色；
（2）向步骤（1）中清洗后的羊胎盘子叶中加水，破碎并均质，得羊胎盘浆液；
（3）将步骤（2）中的羊胎盘浆液于35-45℃条件下震荡提取，然后调节pH值为5-6，于3-5℃条件下离心，得沉淀和上清液；
（4）调节步骤（3）中上清液至中性后进行微滤，得微滤液，继续对微滤液进行超滤，得超滤液；
（5）向步骤（3）的沉淀中加水，调节混合液pH值为碱性，然后将混合液于50-65℃条件下振荡提取；
（6）将步骤（5）中提取后的混合液降至室温，调节pH值为6-6.5，然后向其中加入木瓜蛋白酶，于50-60℃条件下继续振荡酶解，最后灭酶，离心，收集上清液；
（7）将步骤（4）中超滤液和步骤（6）中上清液混合，制得。
2.如权利要求1所述的具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，步骤（1）中冲洗后的羊胎盘子叶还置于过氧乙酸中浸泡，其中，过氧乙酸的体积浓度为0.1-0.3%，浸泡时间为5-10min。
3.如权利要求1所述的具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，步骤（2）中羊胎盘与水按照质量体积比为1:3-5的比例混合，破碎过程的转速为5000-10000rpm，均质3-5次，每次3-5min。
4.如权利要求1所述的具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，步骤（3）中羊胎盘浆液振荡提取的转速为110-130rpm，提取时间为160-200min，离心转速为9000-11000rpm，离心时间为8-12min。
5.如权利要求1所述的具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，步骤（4）中微滤过程滤膜的孔径为0.2μm，超滤过程中滤膜的孔径为10KD和3KD。
6.如权利要求1所述的具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，步骤（5）中沉淀与水的质量体积比为1:3-30，振荡提取的转速为110-130rpm，提取时间为3-6h。
7.如权利要求1所述的具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，步骤（6）木瓜蛋白酶的加入量为4500-5000U/g，酶解时间为100-140min。
8.如权利要求1所述的具有美白功能的羊胎盘提取液的提取方法，其特征在于，步骤（7）中超滤液与上清液按照1-2:1-2的体积比混合。
9.采用权利要求1-8中任一项所述提取方法制得的具有美白功能的羊胎盘提取液。
10.权利要求9中的具有美白功能的羊胎盘提取液在制备美白化妆品中的应用。
CN202010987079.7A 2020-09-18 2020-09-18 一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用 Active CN111888322B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010987079.7A CN111888322B (zh) 2020-09-18 2020-09-18 一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010987079.7A CN111888322B (zh) 2020-09-18 2020-09-18 一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111888322A CN111888322A (zh) 2020-11-06
CN111888322B true CN111888322B (zh) 2022-09-13

Family

ID=73224088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010987079.7A Active CN111888322B (zh) 2020-09-18 2020-09-18 一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111888322B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001039879A (ja) * 1999-07-30 2001-02-13 Koji Murata 胎盤エキスの精製により成る抗アレルギー剤及びその製造方法
CN1896268A (zh) * 2006-06-27 2007-01-17 扬州大学 从羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法及其用途
KR20110109391A (ko) * 2010-03-31 2011-10-06 인제대학교 산학협력단 돼지 태반 추출물을 포함하는 주름 개선, 미백 화장료 조성물
CN102327292A (zh) * 2011-07-12 2012-01-25 湖州康海斯生物科技有限公司 一种羊胚胎及羊胎盘精制粉及其制备方法
CN102327291A (zh) * 2011-07-12 2012-01-25 湖州康海斯生物科技有限公司 一种羊胚胎及羊胎盘素原液及其制备方法
CN103088095A (zh) * 2011-11-02 2013-05-08 江南大学 一种羊角蛋白肽的制备方法
CN104940100A (zh) * 2015-06-19 2015-09-30 成都清科生物科技有限公司 一种人胎盘提取物及其制备方法和应用
AU2019100414A4 (en) * 2019-04-16 2019-05-30 Jilin University Deer Placenta Active Protein as well as Its Extraction Method and Application

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001039879A (ja) * 1999-07-30 2001-02-13 Koji Murata 胎盤エキスの精製により成る抗アレルギー剤及びその製造方法
CN1896268A (zh) * 2006-06-27 2007-01-17 扬州大学 从羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法及其用途
KR20110109391A (ko) * 2010-03-31 2011-10-06 인제대학교 산학협력단 돼지 태반 추출물을 포함하는 주름 개선, 미백 화장료 조성물
CN102327292A (zh) * 2011-07-12 2012-01-25 湖州康海斯生物科技有限公司 一种羊胚胎及羊胎盘精制粉及其制备方法
CN102327291A (zh) * 2011-07-12 2012-01-25 湖州康海斯生物科技有限公司 一种羊胚胎及羊胎盘素原液及其制备方法
CN103088095A (zh) * 2011-11-02 2013-05-08 江南大学 一种羊角蛋白肽的制备方法
CN104940100A (zh) * 2015-06-19 2015-09-30 成都清科生物科技有限公司 一种人胎盘提取物及其制备方法和应用
AU2019100414A4 (en) * 2019-04-16 2019-05-30 Jilin University Deer Placenta Active Protein as well as Its Extraction Method and Application

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antifatigue effects of peptide isolated from sheep placenta;Li Wang等;《chinese herbal medicines》;20181231;第279-284页 *
Enzymolysis of By-product derived from sheep placenta to production of highly active antioxidant peptide;Li Ming等;《Synthesis and Catalysis：Open Access》;20170226;第2卷(第1:3期);第1-7页 *
羊胎盘中SOD提取条件及小分子肽的分析纯化研究;林媛;《万方》;20131008;全文 *
羊胎盘素提取新工艺及其营养成分的分析测定;乌云;《食品科学》;20051231;第26卷(第9期);第295-297页 *
羊胎盘肽研究与利用进展;李志忠等;《食品工业科技》;20191231;第40卷(第5期);第286-290页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111888322A (zh) 2020-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104195205B (zh) 从动物胎盘制备高活性胶原蛋白肽的方法与所制备的高活性胶原蛋白肽及其用途
US4108849A (en) Process for extracting and processing glycoproteins, mucopolysaccharides and accompanying substances
CN109207545B (zh) 一种胶原蛋白提取方法
CN108635372A (zh) 一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法
CN112553273B (zh) 一种超小分子量透明质酸钠的制备工艺
CN109350627A (zh) 一种羊胎素冻干粉及其制备方法
CN111888322B (zh) 一种具有美白功能的羊胎盘提取液及其提取方法和应用
CN105541857B (zh) 一种汉防己甲素提取物及其制备方法和应用
DE2625289A1 (de) Verfahren zur herstellung eines sterilen kollagenproduktes mit filz- bzw. vliesartiger faserstruktur
CN116590370A (zh) 一种可促进软骨细胞生长的软骨肽及其制备方法
CN113908088A (zh) 一种洗发水
CN110897971B (zh) 一种含卷柏素的护发清洁组合物及其制备方法
CN114159341A (zh) 一种冻干眼贴及其制备方法
CN103194068A (zh) 一种稳定丝素蛋白溶液的方法
CN113476361A (zh) 一种桃胶和丝胶蛋白的混合提取液及其制备方法与应用
CN108578264A (zh) 胎盘素及其制备、应用
US5932717A (en) Methods of obtaining DNA-RNA hybrids from sturgeon milt
CN109646718A (zh) 用于微整形的再生组织基质组合物、制备及应用
CN110066845A (zh) 猪胆皮胶原蛋白的制备方法
CN109172643A (zh) 一种双黄连注射液及其制备工艺
CN108048396A (zh) 一种绵羊肌肉干细胞的分离方法
CN107012526A (zh) 一种羊胎盘复合再生纤维修复材料的制备方法
CN108030914A (zh) 一种基底膜胶原材料及其制备方法与应用
CN114306385A (zh) 一种外泌体医用修复贴及其制备方法和应用
CN115895897A (zh) 一种提升粪便样本中菌群纯度的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant