CN115894370A

CN115894370A - 一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法

Info

Publication number: CN115894370A
Application number: CN202310192990.2A
Authority: CN
Inventors: 董泽军; 肖雪蓉; 张凌
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明提供了一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法，属于天然产物技术领域。本发明采用高速逆流色谱分离法，以烷烃‑乙酸乙酯‑醇‑水体系作为两相溶剂体系，其中，烷烃包括石油醚和/或正己烷，醇包括甲醇和/或乙醇，两相溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。本发明提供的方法能够快速、高效制备得到草乌甲素，草乌甲素的分离量大、无损耗、收率高、纯度高；而且，本发明提供的方法，具有操作简便、重现性好和分离环境缓和的特点。进一步地，本发明通过控制烷烃、乙酸乙酯、醇和水的体积比能够得到高纯度的草乌甲素。

Description

一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法

技术领域

本发明涉及天然产物技术领域，具体涉及一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法。

背景技术

滇西乌头（学名：Aconitum bulleyanum Diels），毛茛科乌头属植物。滇西乌头的主要的活性成分之一为草乌甲素（Bulleyaconitine A，C₃₅H₄₉NO₁₀，M⁺643，结构式如式I所示），具有中枢镇痛和外周镇痛的双重药理作用，且镇痛时间长、无成瘾性的特点，其副作用小，对各重要器官无明显损伤、无致畸作用，临床主要用于带状疱疹及癌症晚期疼痛、风湿及类风湿关节炎、肩周炎及良性关节痛等急慢性疼痛疾患的治疗，效果显著。

式I。

中国专利CN1054976A、CN101555227A、CN101830849A、CN102775349A、CN102924376A、CN104326981A、CN106008344A、CN107245054A以及现有技术“袁梅. 滇西乌头的生药及化学成分的研究[D]. 云南中医学院, 2012.”均公开了草乌甲素的分离方法。上述方法除“滇西乌头的生药及化学成分的研究”仅采用柱色谱分离纯化外，其他方法均采用柱色谱和重结晶联用的分离纯化方法。然而，柱色谱以及重结晶耗时长，导致草乌甲素的分离效率低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法，本发明提供的方法能够从滇西乌头中高效、大批量地分离得到草乌甲素。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法，包括以下步骤：

将含草乌甲素的粗提物进行高速逆流色谱分离，得到草乌甲素；所述高速逆流色谱分离采用的两相溶剂体系为烷烃-乙酸乙酯-醇-水体系；所述烷烃包括石油醚和/或正己烷；所述醇包括甲醇和/或乙醇；所述两相溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。

优选地，所述两相溶剂体系中烷烃、乙酸乙酯、醇和水的体积比为（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5）。

优选地，所述高速逆流色谱分离条件包括：温度为20~30℃；主机的转速为500~1000r/min；所述流动相的流速为5~20mL/min；检测波长为254nm。

优选地，所述含草乌甲素的粗提物的制备方法包括以下步骤：

将滇西乌头根茎依次进行酸浸和醇提，得到提取液；

将所述提取液进行酸化，得到酸化提取液；

将所述酸化提取液进行碱化，得到碱化提取液；

将所述碱化提取液进行萃取后浓缩，得到含草乌甲素的粗提物；所述萃取采用的萃取剂包括酯类溶剂和/或卤代烷烃类溶剂。

优选地，所述酸浸采用的酸溶液包括盐酸溶液和/或硫酸溶液，所述酸溶液的质量浓度为36~38%。

优选地，所述酸浸的时间为8~15h。

优选地，所述醇提采用的溶剂为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数为50~95%。

优选地，所述醇提的温度为50~80℃，醇提的次数为2~4次，单次醇提的时间为1~4h。

优选地，所述酸化采用的酸溶液包括盐酸溶液和/或硫酸溶液；所述酸化提取液的pH值为2~3。

优选地，所述碱化采用的碱包括氨、二乙胺和三乙胺中的一种或几种；所述碱化提取液的pH值为8~10。

本发明提供了一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法，包括以下步骤：将含草乌甲素的粗提物进行高速逆流色谱分离，得到草乌甲素；所述高速逆流色谱分离采用的两相溶剂体系为烷烃-乙酸乙酯-醇-水体系，所述两相溶剂体系中烷烃、乙酸乙酯、醇和水的体积比为（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5）；所述烷烃包括石油醚和/或正己烷；所述醇包括甲醇和/或乙醇；所述两相溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。重结晶法存在耗时长，分离效率低的问题。柱色谱分离法采用硅胶或氧化铝为固定相，采用不同极性的有机溶剂对样品进行洗脱进而分离得到目标化合物。然而，柱色谱分离耗时长，分离效率低；洗脱剂和固定相的用量大，且固定相对样品的吸附力强且不可逆，导致固定相不能被重复利用，分离成本高。而本发明采用高速逆流色谱技术（HSCCC），固定相以及流动相均为溶剂，无需使用任何固体的固定相，通过控制两相溶剂体系，即可快速、高效地通过液液分配色谱分离得到草乌甲素；两相溶剂体系用量少，对于样品没有吸附，使得两相溶剂体系能够重复利用，大大降低了草乌甲素的分离纯化成本。而且，本发明采用的高速逆流色谱法对草乌甲素的分离量大，分离效率高，对样品无损耗，重现性好，操作简单，分离环境缓和的特点，适宜工业化生产。

本发明通过控制两相溶剂体系中烷烃、乙酸乙酯、醇和水的体积比进一步提高了草乌甲素的纯度。如实施例测试结果所示，本发明仅对含草乌甲素的粗提物进行高速逆流色谱分离即可得到纯度在99.49%以上的草乌甲素。

附图说明

图1为实施例1制备的含草乌甲素的粗提物的高效液相色谱图；

图2为实施例1制备的含草乌甲素的粗提物的MS总离子流谱图；

图3为实施例1制备的含草乌甲素的粗提物的高速逆流色谱图；

图4为实施例1制备的草乌甲素的高效液相色谱图；

图5为实施例1制备的草乌甲素的MS总离子流谱图；

图6为实施例1制备的草乌甲素的质谱图；

图7为实施例1制备的草乌甲素的¹H谱图；

图8为实施例1制备的草乌甲素的¹³C谱图。

具体实施方式

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

在本发明中，所述含草乌甲素的粗提物的制备方法优选包括以下步骤：

将含草乌甲素的乌头根茎依次进行酸浸和醇提，得到提取液；

将所述提取液进行酸化，得到酸化提取液；

将所述酸化提取液进行碱化，得到碱化提取液；

本发明将含草乌甲素的乌头根茎依次进行酸浸和醇提，得到提取液。

在本发明中，所述含草乌甲素的乌头根茎优选为滇西乌头根茎，更优选为干燥滇西乌头根茎，所述含草乌甲素的乌头根茎在使用前优选先进行粉碎，本发明对于所述粉碎没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的粉碎方式粉碎至粒径为80~100目即可。在本发明中，所述酸浸采用的酸溶液优选包括盐酸溶液和/或硫酸溶液，更优选包括盐酸溶液或硫酸溶液；所述酸溶液的质量浓度优选为36~38%，更优选为37%。在本发明中，所述含草乌甲素的乌头根茎干重与酸溶液体积之比优选为1g：0.5~3mL，更优选为1g：1~1.5mL。在本发明中，所述酸浸的温度优选为10~30℃，更优选为15~25℃；所述酸浸的时间优选为8~15h，更优选为10~12h。

在本发明中，所述醇提采用的溶剂优选为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数优选为50~95%，更优选为60~80%，进一步优选为70%；所述醇提的温度优选为50~80℃，更优选为60~70℃；所述醇提的次数优选为2~4次，更优选为3次；单次醇提的时间优选为1~4h，更优选为2~3h。在本发明中，所述滇西乌头根茎（干重）的质量与醇提用溶剂的体积之比优选为1kg：5~10L，更优选为1kg：7~8L。

所述醇提完成后，本发明优选还包括将所得醇提液进行浓缩，得到提取液。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式浓缩至无乙醇味即可。

得到提取液后，本发明将所述提取液进行酸化，得到酸化提取液。

在本发明中，所述酸化采用的酸溶液优选包括盐酸溶液和/或硫酸溶液，更优选包括盐酸溶液或硫酸溶液；所述酸溶液的质量浓度优选为36~38%，更优选为37%；本发明对于所述酸溶液的用量没有特殊限定，能够将所得酸化提取液的pH值控制在2~3即可；所述酸化提取液的pH值更优选为2.5。在本发明中，所述酸化的温度优选为室温；所述酸化优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速度没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速度即可。

所述酸化完成后，本发明优选还包括将所得酸化体系进行静置后固液分离，得到酸化提取液。在本发明中，所述静置的温度优选为室温，本发明对于所述静置的时间没有特殊限定，静置至固体不再增加即可。本发明对于所述固液分离没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。

得到酸化提取液，本发明将所述酸化提取液进行碱化，得到碱化提取液。

在本发明中，所述碱化采用的碱优选包括氨、二乙胺和三乙胺中的一种或几种，更优选为氨、二乙胺或三乙胺；所述碱优选以碱水溶液形式使用，所述碱水溶液的质量浓度优选为25~28%，更优选为25%；本发明对于所述碱的用量没有特殊限定，能够将所得碱化提取液的pH值控制在8~10即可；所述碱化提取液的pH值更优选为9。在本发明中，所述碱化的温度优选为室温；所述碱化优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速度没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速度即可。

所述碱化完成后，本发明优选还包括将所得碱化体系进行静置后固液分离，得到碱化提取液。在本发明中，所述静置的温度优选为室温，本发明对于所述静置的时间没有特殊限定，静置至固体不再增加即可。本发明对于所述固液分离没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。

得到碱化提取液后，本发明将所述碱化提取液进行萃取后浓缩，得到含草乌甲素的粗提物；所述萃取采用的萃取剂包括酯类溶剂和/或卤代烷烃类溶剂。

在本发明中，所述酯类溶剂优选包括乙酸乙酯和/乙酸甲酯。在本发明中，所述卤代烷烃类溶剂优选包括二氯甲烷和/或氯仿。在本发明中，所述萃取的次数优选为2~4次，更优选为3次；所述碱化提取液与单次萃取用萃取剂的体积比优选为1：1~4，更优选为1：2~3。在本发明中，所述浓缩的温度优选为40~70℃，更优选为50~60℃；所述浓缩优选为减压浓缩；本发明对于所述浓缩的压力和的时间没有特殊限定，浓缩至没有溶剂即可。

得到含草乌甲素的粗提物后，本发明将含草乌甲素的粗提物进行高速逆流色谱分离，得到草乌甲素；所述高速逆流色谱分离采用的两相溶剂体系为烷烃-乙酸乙酯-醇-水体系；所述烷烃包括石油醚和/或正己烷；所述醇包括甲醇和/或乙醇；所述两相溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。

在本发明中，所述两相溶剂体系优选为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体系、石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水体系、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系或正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水体系。在本发明中，所述两相溶剂体系中烷烃、乙酸乙酯、醇和水的体积比优选为（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5），更优选为（2~3）：（2~3）：（2~3）：（2~3），进一步优选为（2.5~3）：（2~2.5）：（2.5~3）：（2~2.5）。在本发明中，所述两相溶剂体系在使用前优选进行脱气处理。在本发明中，所述脱气处理优选为超声脱气处理，所述超声脱气处理的温度优选为10~30℃，更优选为20~25℃；所述超声脱气处理的时间优选为10~30min，更优选15~20min；本发明对于所述超声脱气处理的功率条件没有特殊限定，能够将两相溶剂体系中的气泡脱除即可。在本发明中，所述两相溶剂体系优选在储液罐中混合后分相得到，所述两相溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。

在本发明中，所述高速逆流色谱分离前优选还包括对所述高效逆流色谱的色谱柱进行平衡，所述平衡优选为：利用固定相将高效逆流色谱的色谱柱填充满，注入流动相至两相溶剂体系在色谱柱中达到平衡状态（上下分层）。在本发明中，所述平衡参数优选包括：温度优选为20~30℃，更优选为25℃；主机优选采用正转方式，所述主机的转速优选为500~1000r/min，更优选为700~800r/min；所述流动相的流速优选为5~20mL/min，更优选为10~15mL/min。

在本发明中，将所述含草乌甲素的粗提物进行高速逆流色谱分离优选为：利用固定相将含草乌甲素的粗提物溶解，将所得含草乌甲素的粗提物溶液进样，注入流动相进行高速逆流色谱分离。本发明对于所述含草乌甲素的粗提物溶液的浓度没有特殊限定，优选根据仪器设备性能，配置成浓度为相应浓度的溶液，所述含草乌甲素的粗提物溶液的浓度优选为2~30mg/mL，更优选为5~20mg/mL，进一步优选为10~15mg/mL。

在本发明中，所述高速逆流色谱分离条件优选包括：温度优选为20~30℃，更优选为25℃；主机优选采用正转方式，所述主机的转速优选为500~1000r/min，更优选为700~800r/min；流动相（即烷烃-乙酸乙酯-醇-水体系的下相）的流速优选为5~20mL/min，更优选为10~15mL/min；检测波长优选为254nnm。在本发明中，所述草乌甲素的高速逆流色谱分离的出峰位置为58.7~64min。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

（1）将干燥滇西乌头根茎粉碎至粒径为80~100目，在1000g干燥滇西乌头根茎粉中加入质量浓度为37%的盐酸溶液1L混合均匀，在室温条件下浸润12h，加入7L体积分数为70%的乙醇水溶液混合均匀，在60℃条件下减压回流醇提3次，每次醇提时间为2h，将所得醇提液合并后浓缩至无乙醇味，得到提取液。

（2）在所述提取液中加入质量浓度为37%的盐酸溶液调节pH值至3，静置后过滤，得到酸化提取液。在搅拌条件下，在所述酸化提取液中加入质量浓度为25%的氨水调节pH值至9，过滤，得到碱化提取液。

（3）将所述碱化提取液置于分液漏斗中，加入氯仿萃取3次，合并有机相，在60℃条件下减压浓缩至无溶剂，得到含草乌甲素的粗提物。其中，碱化提取液与单次萃取用萃取剂的体积比为1:2。

（4）利用高速逆流色谱分离

将石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水（2.5：2.5：3：2，v/v/v/v）置于储液罐中混合均匀，在室温条件下超声脱气20min，分相，得到两相溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相；将固定相充满逆流色谱的色谱柱，设置循环水浴温度为25℃，主机正转转速为800r/min，以10mL/min的流速泵入流动相至两相溶剂在色谱柱中达到平衡状态。将300mg所述含草乌甲素的粗提物溶解于20mL固定相中，得到含草乌甲素的粗提物溶液，进样，进行高速逆流色谱分离，在254nm下检测，接收出峰时间为58.7~64min的目标成分，得到草乌甲素。

含草乌甲素的粗提物的高效液相色谱图如图1所示，含草乌甲素的粗提物的MS总离子流谱图如图2所示，含草乌甲素的粗提物的部分峰数据如表1所示。

表1 含草乌甲素的粗提物的部分峰数据

由表1和图1~2可知，草乌甲素的保留时间为8.713min。

图3为含草乌甲素的粗提物的高速逆流色谱（HSCCC）图。

使用高效液相色谱仪对得到的草乌甲素的纯度进行检测。HPLC分析条件为：Agilent1260 ZORBAX SB-C18柱（5μm，4.6mm×150，I.D.），DAD检测器254nm，流动相为乙腈-水（0~100，v/v），流动相流速为1.0mL/min。草乌甲素的高效液相色谱图如图4所示，草乌甲素的MS总离子流谱如图5所示。草乌甲素的峰数据如表2所示：

表2 草乌甲素的高效液相色谱数据

由图4~5和表2可知，草乌甲素的纯度为99.49%，其保留时间为8.648min。

目标化成分的结构鉴定：对草乌甲素进行¹H-NMR、¹³C-NMR和质谱分析。草乌甲素的质谱图如图6所示，氢谱图如图7所示，碳谱图如图8所示，草乌甲素的结构表征数据如下：无色透明块状结晶（石油醚/二乙胺），分子式为C₃₅H₄₉NO₁₀(M⁺，643)。¹H-NMR (CD₃OD): δ 8.04(2H, d, J = 8.8 Hz, H-2' and H-6'), 7.01 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3' and H-5'),4.86 (1H, overlap, H-14b), 3.98 (1H, d, J = 6.6 Hz, H-6b), 3.86 (3H, s, 4'-OCH₃), 3.61 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-18), 3.52, 3.27, 3.22, 3.15 ( each 3H, s, 4´ -OCH₃), 3.37 (1H, dd, J = 8.7, 5.9 Hz, H-16), 3.21 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-18), 1.27 (3H, s, OCOCH₃), 1.09 (3H, t, J = 7.2 Hz, H-21)。¹³C-NMR (CD₃OD): δ85.0 (d, C-1), 25.9 (t, C-2), 36.4 (t, C-3), 39.5 (s, C-4), 49.2 (d, C-5),83.2 (d, C-6), 49.2 (d, C-7), 85.6 (s, C-8 ), 45.2 (d, C-9), 40.9 (d, C-10),50.0 (s, C-11), 34.3 (t, C-12), 75.1 (s, C-13), 78.8 (d, C-14), 39.5 (t, C-15), 83.2 (d, C-16), 61.5 (d, C-17), 78.8 (t, C-18), 53.6 (t, C-19), 48.9 (t,C-20), 12.3 (q, C-21), 54.9 (q, 1-OCH₃), 57.0 (q, 6-OCH₃), 58.0 (q, 16-OCH₃),58.2 (q, 18-OCH₃) ，54.7 (q, 4'-OCH₃), 170.1 (s, OCOCH₃), 20.4 (q, OCOCH₃),166.4 (s, C-7'), 122.4 (s, C-1'), 131.6 (2d, C-2' and C-6'), 113.5 (2d, C-3'and C-5'), 164.0 (s, C-4')。由图6~8以及上述结构表征数据可知本发明提取的目标产物为草乌甲素。

实施例2

按照实施例1的方法制备草乌甲素，与实施例1的区别仅在于：两相溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比=3:2:3:2）；草乌甲素的纯度为99.12%。

实施例3

按照实施例1的方法制备草乌甲素，与实施例1的区别仅在于：两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比=2.5:2.5:3:2）；草乌甲素的纯度为99.50%。

实施例4

按照实施例1的方法制备草乌甲素，与实施例1的区别仅在于：两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（体积比=2.5:2.5:3:2）；草乌甲素的纯度为97.35%。

对比例1

按照实施例1的方法制备草乌甲素，与实施例1的区别在于溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-乙腈-水（体积比=2.5:2.5:3:2），由于溶剂体系分为三层，不能进行高速逆流色谱分离。

对比例2

按照实施例1的方法制备草乌甲素，与实施例1的区别在于两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（体积比=2.5:2.5:4:2）；高速逆流色谱中草乌甲素在20min内出峰，同时伴有其他成分，不能有效分离草乌甲素。

对比例3

按照实施例1的方法制备草乌甲素，与实施例1的区别在于两相溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水（体积比=2.5:2.5:4:2）；高速逆流色谱中草乌甲素20min内出峰，同时伴有其他成分，不能有效分离草乌甲素。

对比例4

按照实施例1的方法制备草乌甲素，与实施例1的区别在于两相溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水（体积比=4:2.5:3:2）；高速逆流色谱中草乌甲素超过2h以上，造成时间和成本的浪费。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用高速逆流色谱制备草乌甲素的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两相溶剂体系中烷烃、乙酸乙酯、醇和水的体积比为（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5）：（1.5~3.5）。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱分离条件包括：温度为20~30℃；主机的转速为500~1000r/min；所述流动相的流速为5~20mL/min；检测波长为254nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含草乌甲素的粗提物的制备方法包括以下步骤：

将所述提取液进行酸化，得到酸化提取液；

将所述酸化提取液进行碱化，得到碱化提取液；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酸浸采用的酸溶液包括盐酸溶液和/或硫酸溶液，所述酸溶液的质量浓度为36~38%。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述酸浸的时间为8~15h。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述醇提采用的溶剂为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数为50~95%。

8.根据权利要求4或7所述的方法，其特征在于，所述醇提的温度为50~80℃，醇提的次数为2~4次，单次醇提的时间为1~4h。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酸化采用的酸溶液包括盐酸溶液和/或硫酸溶液；所述酸化提取液的pH值为2~3。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱化采用的碱包括氨、二乙胺和三乙胺中的一种或几种；所述碱化提取液的pH值为8~10。