CN115877015A - 一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法。属于疫苗生产过程控制技术领域。包括首先确定目的蛋白表达量达到目标标准时的阳性细胞比率,作为在生产中监测抗原含量合格时的标准,然后在实际生产中从接毒后第2天开始对悬浮培养细胞每隔24小时取样检测阳性细胞比率,当阳性细胞比率达到抗原合格的标准时即可停止取样检测。本发明可以相对实时监测悬浮培养工艺杆状病毒表达系统中目的蛋白表达过程,并提前确定当前批次细胞悬液的目的蛋白含量能否合格,便于进行后序的操作,有利于生产过程的控制,降低生产成本。对所有用悬浮细胞进行杆状病毒培养表达蛋白的工艺均可适用,在生产实践中具有非常大的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗生产过程控制技术领域,更具体的说是涉及一种快速判定杆状病毒表达的目的蛋白含量的方法。
背景技术
利用杆状病毒表达系统表达目的蛋白制备基因工程亚单位疫苗,已被广泛地应用于疫苗领域。由于可以采用昆虫细胞中的sf9、High Five细胞或Trichoplusia ni(简称T.ni细胞)等进行大规模悬浮培养,生产效率较高,可以获得较低的生产成本。在大生产中,最理想的工艺步骤是,细胞悬浮培养过程(包括杆状病毒繁殖以表达目的蛋白的过程)和后续对病毒液的灭活操作连续进行,这样省去把病毒液先贮存起来等待目的蛋白含量检测结果出来后再将病毒液重新倒入罐中进行灭活这个中间步骤。但前提是,在灭活操作前要知道病毒液中的蛋白含量是否达到标准要求;否则将不合格的病毒液拿去灭活,造成人力和物料的浪费。
对于悬浮培养工艺的杆状病毒表达体系而言,目前并无适宜的方法对生产过程中目的蛋白的表达情况进行相对实时监控,人们往往都是通过前期进行“一个不同培养时间目的蛋白表达量的研究”,将目的蛋白表达量最大时的时间点作为抗原收获时间,固定为生产工艺参数,在随后的大生产中,按工艺参数时间范围进行抗原的收获,待抗原收获后将样品送质检部门检测反馈后才知道目的蛋白含量是否合格,检测结果远远滞后于实际需要。而且,在大生产中,接毒时细胞的生长状态、毒种情况、整个生产设施等环节中无论哪个位置发生轻微偏差,抗原表达就会受到影响,按预定的工艺参数进行抗原收获可能就会有抗原含量不合格的情况出现,如果根据最终质检部门的检测结果来处理抗原含量不合格这一工序,显然已经滞后很多,费时且增加成本,因此在生产过程中的实时监控是非常有必要的。而生产过程中的实时监控,如取样后采用ELISA法检测,往往需要先对样品进行纯化后才能检测,样品纯化费时费力,且有些ELISA法检测一般需要12小时以上;如采用液相色谱仪检测尽管可以在2个小时内出结果,但需要使用到液相色谱这一昂贵设备。
因此,如何提供一种在生产中相对实时的监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法。本方法的优势在于,首先确定目的蛋白表达量达到目标标准时的阳性细胞比率,作为在生产中监测目的蛋白含量合格时的标准,然后在实际生产中从接毒后第2天开始每隔24小时从悬浮培养细胞中取样检测阳性细胞比率,当阳性细胞比率达到抗原合格标准时即认为本批次目的蛋白含量能够合格。本方法可以在2.5小时左右完成,提前判定病毒液是否合格,填补了国内目前悬浮培养杆状病毒表达系统生产中无实时监测目的蛋白表达量方法的这一空白,有利于提前安排下一步工艺操作,在实际生产中具有很好的现实意义。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法,包括:
1)先确定目的蛋白表达量达到目标标准时的阳性细胞比率,作为生产中监测抗原含量合格时的标准:从接种病毒后的第1天起,每隔20~30小时取悬浮培养中不同时间点的细胞悬液检测目的蛋白表达量,同时测定以上不同时间点对应的阳性细胞比率,直至阳性细胞比率达到80%以上,将目的蛋白表达量达到目标标准时所对应的阳性细胞比率值作为判定目的蛋白含量能否合格的标准;
2)在实际生产中,从接种病毒后的第2天起,每隔20~30小时取悬浮培养中不同时间点的细胞悬液分别检测并计算阳性细胞比率,阳性细胞比率计算方法与步骤1)相同,当阳性细胞比率达到或超过标准时,表明本批次目的蛋白含量能够合格,取样监测停止。
优选的:步骤1)中阳性细胞的检测采用的方法为间接免疫荧光法,滴加的一抗是针对目的蛋白的单抗;阳性细胞比率的计算方法:荧光显微镜下观察有荧光的细胞为阳性细胞,随机选取视野中100个细胞,计算阳性细胞所占百分比即为阳性细胞比率。
优选的:步骤1)目的蛋白为猪瘟E2蛋白;标准:悬浮培养至第4~5天时,阳性细胞比率≥80%,此时猪瘟E2蛋白≥30μg/ml。
优选的:步骤1)阳性细胞比率的计算方法具体过程:
(1)离心:取接毒后的细胞悬液样品1ml离心,弃去大部分上清,保留少量上清液重悬细胞;
(2)涂片:取适量重悬后的细胞悬液,在载玻片中点样,干燥;
(3)固定:将载玻片在丙酮、甲醇体积比为80:20的固定溶液中固定,干燥;
(4)加一抗:解冻猪瘟E2蛋白单克隆抗体,稀释抗体,点样孵育;
(5)洗片;
(6)加二抗:将载玻片干燥,加入二抗,孵育;
(7)洗片;
(8)封片;
(9)结果观察:在荧光显微镜下观察载玻片,有绿色荧光的细胞为阳性,随机选取100个细胞,计算阳性细胞所占百分比。
本发明还提供了上述任一的方法为在制备基因工程亚单位疫苗中的应用。
进一步的,步骤(2)也可以涂在6孔或12孔的类似于载玻片的带有凹面的容器内。
本发明还提供了上述任一的方法为在制备基因工程亚单位疫苗中的应用。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明公开提供了一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法,填补了目前悬浮培养工艺杆状病毒表达系统中缺乏实时监控目的蛋白表达量的方法这一空白,取得的技术效果:与目前可以采用的ELISA方法检测相比,检测样品不需要纯化等处理,操作方便,快速,可以在灭活前实时取样检测,确定细胞悬液中的蛋白含量能否合格,便于进行后序的操作,有利于生产过程的控制,降低生产成本。与当前可以采用的液相色谱仪检测法相比,本发明使用设备简单,操作方便。因此,对于当前的纯悬浮培养进行病毒繁殖的大生产工艺控制而言,是一个非常有益的工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的T-E20329-1培养期间的部分荧光图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法。
实施例中,所需试剂、仪器、操作步骤如无特殊提及,均为常规试剂、仪器和方法,例如:
材料:
T.ni细胞:全称为Trichoplusia ni细胞,由美国法玛威股份有限公司惠赠,金河佑本生物制品有限公司实验室保存。
一抗:鼠抗猪瘟E2蛋白单克隆抗体WH303,货号:RAE0826,批号:MAB21/01,制造商:Proteintech公司,工作浓度为1:800。
FITC-羊抗鼠IgG抗体,货号:F0257,批号:SLCH0334,制造商:SIGMA,工作浓度为1:2000。
蛋白含量检测采用“猪瘟病毒(CSFV-Ag)抗原检测试剂盒”,货号:ES-CSF-03,批号:107HS989,制造商:MEDIAN试剂盒,使用的阳性对照为自制的含量经标定的E2蛋白标准品。
在此不再一一赘述。
实施例1
一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原(杆状病毒表达猪瘟E2蛋白)表达量的方法
1、确定E2蛋白表达量达到目标标准时的阳性细胞比率,作为在生产中监测抗原含量合格时的标准。
(1)细胞准备:摇瓶培养T.ni细胞放大体积培养30ml,密度达到6.7×106个/ml,分别各转移2ml细胞悬液至三个摇瓶中,补充细胞培养液至30ml继续培养继续;
(2)接种病毒:当密度达到2×106个/ml左右时,按照MOI为0.01~0.5的比例接毒;
(3)取样:每隔24小时无菌抽取细胞悬液样品2ml,1ml用于细胞密度、细胞活率及阳性细胞比率的测定,另1ml用于蛋白含量的测定。
(4)细胞密度及活率检测。采用Life细胞计数仪进行细胞计数和细胞活率计算。
其中,阳性细胞比率按以下步骤进行检测:
离心:将1.0mL接毒后的细胞悬液样品无菌移至2.0mL微量离心管中。以1,000×g离心3分钟(Eppendorf离心机5415C或类似产品)。然后弃去大部分上清液,保留少量上清液(约30微升)于离心管中。
涂片:使用移液枪重新悬浮细胞沉淀(混合均匀,至少抽吸10~15次),得到细胞悬浮液,然后将细胞悬浮液点在12孔载玻片的4个孔里,每孔大约5微升细胞悬浮液,尽量使其均匀分布。在20℃(±5℃)下干燥20±10分钟。
固定:将载玻片在丙酮:甲醇(80:20,v/v)配制成的固定液(共约20ml,丙酮:甲醇为16ml:4ml)中固定30分钟,20℃(±5℃)。在20℃(±5℃)下干燥5~10分钟。
加一抗:解冻保存在-20℃(±5℃)的猪瘟E2单克隆抗体。根据生产商的建议,用磷酸缓冲液(PBS,pH 7.2~7.4)稀释抗体。向每个孔加入10~20μL稀释的抗体,点在样品上,在37℃(±2℃)的保湿盒中孵育45+/-5分钟。
洗片:用含有0.05%吐温20的PBS浸洗载玻片5分钟,以60±10RPM的频率摇动。一共洗三次,最后一次使用去离子水洗玻片。
加二抗:将载玻片在20℃(±5℃)干燥15±5分钟。向每一个样品孔加入20μL用PBS稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体,在保湿盒中37℃(±2℃)孵育30分钟。
洗片:重复洗片步骤(用含有0.05%吐温20的PBS浸洗载玻片5分钟,以60±10RPM的频率摇动。一共洗三次,最后一次使用去离子水洗玻片)。
封片:每个孔加10μL的90%甘油水溶液,盖上盖玻片。
结果观察:在荧光显微镜下观察载玻片。有绿色荧光的细胞为阳性。随机选取100个细胞,计算阳性细胞所占百分比即为阳性细胞比率。
(5)每天检测蛋白含量,直至第7天培养结束。测定方法采用常规夹心ELISA方法。
(6)确定含量合格的阳性细胞比率标准
表1汇总的检测结果显示(T-E203291培养期间的部分荧光图片见图1),在接毒后的7天内,当阳性细胞比率在80%以上时,细胞悬液中蛋白含量均可达到30μg/ml以上;随着培养时间的延长,蛋白含量还在增长,直至第6天达到最高峰;而当在培养的第一周内阳性细胞率均在40%以下时,直到培养至7天,病毒含量仍旧很低,远远达不到30μg/ml。在实际商业化生产中,结合生产成本考虑,设定蛋白含量合格标准为≥30μg/ml,从阳性细胞比率和蛋白含量的结果关系,即可确定蛋白含量合格的标准为接毒后1~5天内阳性细胞比率≥80%。
表1猪瘟E2蛋白监测表
注:a、接毒后第0天阳性细胞比率没必要测定,当阳性细胞比率已达到100%,后续也无必要继续测阳性细胞比率。
b、在接种病毒后的第1~2天,如果细胞密度超过3.5x106个/ml时,一般为了有利于细胞生长,通过添加新鲜培养基,将细胞密度降到2.5x106个/ml以下。
2、猪瘟E2蛋白抗原的制备
按照上述标准,进行了3批悬浮细胞的培养和病毒繁殖(结果见表2)。从接种病毒后的第2天开始监测细胞悬液的阳性细胞比率,T-E20329在接毒后的第4天,阳性细胞比率已超过80%,即可判定该批次细胞培养液目的蛋白含量合格,接毒后第6天收获,测得其含量为86.9μg/ml,同样,T-E20409和T-E20420批也于接毒后的第4天,阳性细胞比率达80%以上,于接毒后第6天收获,测得其蛋白含量分别为97.92μg/ml和74.24μg/ml,3批抗原的生产中,都于接毒后的第4天即可判定目的蛋白表达量能够合格,而不是必须等到常规生产中第6天收获后交质检部门检测以后才能得知结果,至少提前3天得知结果以有充足的时间准备下一步工序的工作。
表2E2蛋白的制备
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种监测悬浮培养杆状病毒表达系统抗原表达量的方法,其特征在于,包括:
1)先确定目的蛋白表达量达到目标标准时的阳性细胞比率,作为生产中监测抗原含量合格时的标准:从接种病毒后的第1天起,每隔20~30小时取悬浮培养中不同时间点的细胞悬液检测目的蛋白表达量,同时测定以上不同时间点对应的阳性细胞比率,直至阳性细胞比率达到80%以上,将目的蛋白表达量达到目标标准时所对应的阳性细胞比率值作为判定目的蛋白含量能否合格的标准;
2)在实际生产中,从接种病毒后的第2天起,每隔20~30小时取悬浮培养中不同时间点的细胞悬液分别检测并计算阳性细胞比率,阳性细胞比率计算方法与步骤1)相同,当阳性细胞比率达到或超过所述标准时,表明本批次目的蛋白含量能够合格,取样监测停止。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中阳性细胞的检测采用的方法为间接免疫荧光法,滴加的一抗是针对目的蛋白的单抗;所述阳性细胞比率的计算方法:荧光显微镜下观察有荧光的细胞为阳性细胞,随机选取视野中100个细胞,计算阳性细胞所占百分比即为阳性细胞比率。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤1)所述目的蛋白为猪瘟E2蛋白;所述标准:悬浮培养至第4~5天时,阳性细胞比率≥80%,此时猪瘟E2蛋白≥30μg/ml。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤1)所述阳性细胞比率的计算方法具体过程:
(1)离心:取接毒后的细胞悬液样品1ml离心,弃去大部分上清,保留少量上清液重悬细胞;
(2)涂片:取适量重悬后的细胞悬液,在载玻片中点样,干燥;
(3)固定:将载玻片在丙酮、甲醇体积比为80:20的固定溶液中固定,干燥;
(4)加一抗:解冻猪瘟E2蛋白单克隆抗体,稀释抗体,点样孵育;
(5)洗片;
(6)加二抗:将载玻片干燥,加入二抗,孵育;
(7)洗片;
(8)封片;
(9)结果观察:在荧光显微镜下观察载玻片,有绿色荧光的细胞为阳性,随机选取100个细胞,计算阳性细胞所占百分比。
5.权利要求1~4任一所述的方法为在制备基因工程亚单位疫苗中的应用。
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