CN1076726A - 甲型肝炎疫苗及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备甲型肝炎L-A-1减毒病毒 株和以所说的病毒株为毒种大规模工业化生产甲型 肝炎疫苗的方法。

Description

本发明涉及甲型肝炎疫苗，特别是涉及制备甲型肝炎L-A-1减毒病毒株和以该病毒株为毒种生产甲型肝炎疫苗的方法，以及该疫苗在预防甲型肝炎病毒感染中的应用。

甲型肝炎是一种由自然界广泛存在的甲型肝炎病毒（HAV）引起的全球性传染病，全世界约有40亿人口受到该疾病的威协。在包括中国在内的发展中国家，由于人口众多、社会经济落后及卫生条件低下等原因，时有甲型肝炎的大规模暴发或局部流行。在经济发达的美国，每年也有高达10，000例肝炎病人与此类病毒感染有关，甲型肝炎的发病率占临床肝炎总病例数的15～20%。据粗估计，在中国有近5亿人口受到甲型肝炎的威协，每10万人口中约有200～300人遭受感染。上海市1983年和1988年两次甲型肝炎大流行，给当地人民的健康和国民经济发展带来严重损害，对此，至今人们仍然心有余悸。面对这样的现实，迫切要求发展有高特异性和安全的、可适用于临床应用的甲型肝炎疫苗，对易感人群进行大规模免疫接种，以大幅度降低甲型肝炎发病率并有效地控制其暴发性流行。

七十年代中期以来，许多研究者致力于甲型肝炎减毒活疫苗或灭活疫苗的研究。如美国专利4，164，566号公开了在亚人类灵长目动物（如狨猴）细胞培养物中连续传代选育甲型肝炎病毒，并以其所得到的甲型肝炎病毒CR326病毒株在多种细胞系内传代增殖制备甲型肝炎疫苗的方法。美国专利4，532，215号和4，636，469号中公开了从甲型肝炎病人粪便中至少经5次传代以制备甲型肝炎HM-175病毒株的方法。美国专利，4，506，016号公开了使甲肝病毒首先适应于人肾细胞，然后再适应于人肺纤维母细胞，以制备可用作疫苗之减毒甲肝病毒的方法。上述这些现存技术虽然分别建立了不同的方法学并分离纯化了不同的甲型肝炎减毒病毒株，但他们几乎都只是限于动物试验和小数目人体试验阶段，而且所获得病毒株的免疫接种效果、和诱导动作抗体生成的能力远不能令人满意（如参见P.L.Provost    et    al.，J.of    Med.Vivol.20∶165-175，1986和K.Midthun    et    al.，J.of    Inf.Dis.163∶735-739，1991）.

中国专利申请85107525号公开了一株新的甲型肝炎H₂减毒病毒株及其纯化和减毒方法，但他们使用的病毒株与我们的不同，而且病毒株的分离条件和纯化方法也有所差异，特别是该专利申请并没有详细描述以所说的种子病毒株工业化生产甲型肝炎疫苗的方法。

本发明的一个目的是提供一种制备甲型肝炎减毒活病毒株的方法，该方法包括制备甲型肝炎急性期病人粪便样品的悬浮液，以此病毒悬浮液感染人二倍体细胞，达到病毒增殖高峰后分离细胞提取物，并以该提取物作为种子病毒来源用同一细胞基质进行连续传代减毒。

本发明的另一个目的是提供一株以上述方法制备的甲型肝炎减毒活疫苗L-A-1病毒株，该病毒株已于1992年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏登记号为CCTCC    No。

本发明的再一个重要的和更具实际意义的目的是提供一种以L-A-1甲型肝炎减毒病毒株为毒种，大规模工业化生产甲型肝炎疫苗的方法，该方法包括用旋转培养法培养人胚肺二倍体细胞并用Earle氏液洗细胞，然后直接接种L-A-1减毒病毒株，培养约4周后换成作为疫苗的199综合培养液并继续于35-36℃下培养。

根据本发明，首先直接利用人二倍体细胞从甲型肝炎急性期病人粪便样品中分离甲型肝炎病毒颗粒，然后于低温条件下采用同一细胞基质连续传代，以得到本发明的甲型肝炎减毒活性疫苗L-A-1病毒株。将该疫苗病毒株加到人胚肺二倍体细胞培养物中旋转培养，可大规模工业化生产甲型肝炎疫苗。

现对制备本发明甲型肝炎减毒活病毒和以该L-A-1甲型肝炎减毒病毒株为毒种生产甲型肝炎疫苗的方法详细描述如下。

Ⅰ.甲型肝炎L-A-1病毒株的制备

1.病毒接种物的制备

采集甲型肝炎急性期病人的粪便标本，用无牛血清Eagle氏基本培养（MEM）制成5%（V/V）悬浮液。该悬浮液经高速离心后，取上清液通过200nm滤膜除菌过滤。所得滤液经常规血清学方法和免疫电镜观察，证实其中含有27-32nm大小的HAV颗粒，此即为病毒接种物（参见胡孟冬等，上海医学，1988，11∶653-656）。

2.病毒的分离和纯化

用于分离病毒的宿主细胞为已知的人胚肺二倍体细胞系。首先将人肺二倍体细胞接种于带有玻片的小方瓶内，于37℃下培养。培养5-7天后形成均匀致密的细胞单层，然后在该细胞单层上接种按步骤Ⅰ所述方法制得的病毒接种物。37℃吸附4小时后，补加含维生素C的维持液（pH7.4-7.8），再于32-34℃下培养。培养期间每隔1周换液一次，以除掉不利于细胞生长的有害代谢产物，并定期用直接免疫荧光法（IF）监测细胞内病毒增殖水平。经3-4周后，待病毒增殖达到高峰时收集细胞。经用胰蛋白酶消化，三次反复冻融及超声处理等方法以破碎细胞，离心后得到细胞提取物，该提取物即可作为种子病毒的来源，作进一步的传代减毒。

3.病毒的传代减毒

通过在人肺二倍体细胞内连续传代，使上述强毒力病毒减毒。为此，用不含牛血清的MEM按不同倍数稀释上述用作种子病毒来源的细胞提取物，按前述方法于32℃在人肺二倍体细胞中连续传代。一般可在大约5代后转入2BS细胞于37℃下继续传代，其中可每隔5代以终未稀释法进行克隆化，共连续传15-25代，并于不同代次接种狨猴（Sauguirus fuscicollis）以评价减毒效果并进行体内免疫原性试验。试验表明，在连续传10代后病毒即已明显减毒，约20代时可获得令人满意的减毒效果，由此得到本发明的L-A-1减毒活疫苗病毒株。当最低稀释倍数（一般为10^-2）的病毒接种瓶内有大约90-100%的被感染细胞呈现免疫荧光阳性时即可收获病毒。

该病毒株已按照专利法实施细则第25条的规定，于1992年12月21日保藏在中国武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏登记号为CCTCC    No.

本发明的L-A-1减毒活病毒株可以疫苗液的形式直接接种在适当培养基中旋转培养的人胚肺二倍体细胞单层上，于低温下培养增殖，以大规模生产完全适用于人体免疫接种的甲型肝炎疫苗。

Ⅱ.甲型肝炎减毒活疫苗的生产

首先取人胚肺二倍体细胞按1∶2-1∶4的比例扩增传代，其中细胞扩增所用培养基是添加10-15%小牛血清的MEM，pH7.2-7.6。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养5至8天，形成均匀、致密的细胞单层。然后弃去生长液。用新鲜Earle氏液反复冲洗细胞3-5次。向培养瓶内加入适当量按前述方法制得的毒种液并于34-36℃下培养之。每周换液一次，约4周后弃去维持液及残存的小牛血清，并向培养瓶内直接加入由199综合培养液构成的疫苗液。继续培养2-5天后低温冷冻收存细胞。经三次反复冻融和超声处理破碎细胞，然后离心除去细胞碎片和亚细胞结构部分。收集上清得到半成品甲型肝炎疫苗。

如此制得的半成品疫苗液，按新生物制品检定规程，经病毒测定、小鼠安全性试验、牛血清含量测定、无菌试验、支原体污染检测、pH值和外观检验、以及猴体试验等一系列检验合格后，即可作为成品甲型肝炎疫苗，用于临床进行人体或动物的预防免疫接种。

与已有技术相比，本发明生产甲型肝炎活疫苗方法的主要改进包括：（1）在病毒宿主细胞的增殖阶段，以旋转培养法代替静止培养法，如此可显著地扩大细胞培养面积，使细胞增殖率提高5倍以上，且可以比较容易地除去或减少牛血清残存量，减小疫苗制品的不良反应。（2）根据甲型肝炎病毒的生物学特性，用Earle氏液冲洗细胞表面，可更加有利于病毒的吸附感染。（3）将疫苗液（199综合培养液）直接加入培养瓶内，可减小病毒的损失，提高疫苗的产率和滴度，并可改善病毒的稳定性。

如上文所述，在本发明L-A-1病毒株减毒过程中，始终以狨猴体内试验作为评价减毒效果和免疫原性的手段，因为狨猴与黑猩猩或其他灵长类实验动物相比有更好的敏感性，从而保证了毒株选育结果的可靠性和安全性。对部分产生抗体的狨猴进行攻击保护试验，发现全部有抗HAV的动物无论抗体滴度高或低，均可抵抗强毒的攻击，获得100%保护。

我们曾在中国国内的近30个地区对以狨猴为实验对象，基于L-A-1减毒病毒株制备的甲肝活疫苗进行了多达10万余人的大规模接种观察，并对其中约3，500人（包括对照组约1，500人）基于局部和全身临床反应、肝脏酶分析、血清学反应、抗体水平、粪便排毒等项指标进行了精细观察。结果表明，对不同地区、不同年龄组以多批疫苗进行的临床试用，未见有临床上有意义的不良反应。大量血清学试验结果表明，接种疫苗后可使绝大部分受试者产生良好的抗体反应。仅一次免疫注射抗体阳转率即达到95%以上，抗体滴度4周GMT为4.438-4.464，8周为5.098-6.276。

疫苗接种后进行追踪观察，未发现受试者发生再感染。在既往精细观察组中，于不同时间、不同地区随机选择部分受试者进行中和抗体和粪便排毒检测，结果表明可以产生保护性中和抗体，且粪便排毒试验均为阴性（包括使用抗原直接检测法和细胞培养法）。另外，狨猴试验还证实，凡能产生抗体反应者，无论抗体效价高低，均具有抵抗强毒株攻击的能力。

对既往接受本发明甲型肝炎疫苗的受试者追踪观察4年，发现抗体均持续阳性，表明该疫苗具有良好的免疫原性，免疫接种后至少可获得4年以上的持续保护。局部地区的流行病学调查也显示，接种该疫苗后可使易感者早期获得免疫保护，并能抵抗野生病毒的感染。

迄今我们已使用按本发明方法制得的、基于L-A-1疫苗株的甲型肝炎减毒活疫苗完成了近60万人的人体接种观察，在安全性及免疫原性方面进行了多指标详细考核，结果表明该疫苗株是极其安全和有效的甲型肝炎疫苗毒株。特别是我们首先证明了本发明的疫苗不仅具有流行病学保护效果，而且根据对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性志愿者的接种效果观察，首次证明了乙型肝炎病毒感染者不但可接受本发明疫苗的接种，而且可提供与健康人相同的保护作用。

实施例1

将含有L-A-1病毒株的甲型肝炎急性期病人粪便样品悬浮在无牛血清MEM中制成5%悬浮液，经12，000转/分钟高速离心15分钟后，取上清液用200nm滤膜除菌过滤。经免疫电镜观察和血清学分析表明所得滤液中确实含有HAV颗粒。

按常规方法培养人胚肺二倍体细胞，6天后生长成致密的单层。向其中加入上述含病毒滤液并于37℃下吸附4小时。补加维持液（pH7.6）后于32℃低温适应传代。每周换液一次，并于不同时间用直接免疫荧光法（IF）监测病毒增殖水平，当病毒增殖达到高峰，即被感染细胞中90%以上呈现免疫荧光阳性时收获细胞。按常规方法用胰蛋白酶消化细胞。并经三次反复冻融及超声处理，以破碎细胞并提取HAV。

同样以人胚肺细胞单层为细胞基质，按上述同样方法于32℃下进行连续传代，传至4代后转入2BS细胞于37℃下继续传代培养，并于不同代次进行狨猴体内减毒评价和免疫原性试验。发现在第10次传代后病毒即已明显减毒。将此减毒病毒株接种于同一细胞基质上继续减毒传代，并于第20-27代连续收获病毒，直接用于制备本发明的甲型肝炎减毒活疫苗。

实施例2

取人胚肺二倍体细胞，添加含10小牛血清的MEM（pH7.4），以1∶4比例在37℃下旋转培养7天，使之生长成致密单层。然后弃去生长液，用新鲜配制的Earle氏液反复冲洗细胞表面（3次）。接种按实施例1所述方法制备的毒种液后于37℃吸附4小时，并补加维持液（即加有维生素C的乳白蛋白水解液）置35℃下培养。每周换液一次，4周后弃去维持液及残存的小牛血清，并直接加入199综合培养液（即疫苗液）。继续培养4天后冷冻收存细胞。经三次反复冻融破碎细胞，合并细胞溶解产物并以低速离心，收集上清即得到本发明的甲型肝炎疫苗。

Claims (7)

1、一种制备甲型肝炎减毒活病毒株的方法，该方法包括提供含H-L-1病毒株的甲型肝炎急性期病人粪便样品的悬浮液，以此病毒悬浮液感染人二倍体细胞，当达到病毒增殖高峰后制备细胞提取物，并以该提取物为种子病毒来源用同一细胞基质进行连续传代减毒。

2、根据权利要求1的方法，其中所说的人二倍体细胞和所说的同一细胞基质是指人胚肺二倍体细胞单层。

3、根据权利要求1的方法，其中所说的连续传代是传10至25代。

4、根据权利要求1的方法，其中所说的连续传代减毒是用狨猴为检测对象监测病毒减毒水平。

5、按权利要求1至4中所一项所述的方法制备的甲型肝炎L-A-1-减毒活病毒株，其保藏登记号为CCTCC  No.V92004。

6、一种以甲型肝炎L-A-1减毒活病毒株为毒种大规模工业化生产甲型肝炎疫苗的方法，该方法包括用旋转培养法培养人胚肺二倍体细胞，用Earle氏液洗细胞表面，然后直接接种H-L-1减毒活病毒并置35℃下培养，约4周后，换成199综合培养液继续培养。

7、根据权利要求6的方法，其中所说的继续培养的时间为2-5天。