CN112098642A - 一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，包括抗体芯片点制、活细胞质检、芯片封闭、活细胞收集、活细胞染色、活细胞与抗体芯片孵育、芯片清洗及晾干、芯片扫描及数据处理等步骤，通过抗体芯片和染色后活细胞进行反应，在较短时间内筛选得到能够和细胞表面靶点相结合的抗体，实验操作难度低，适用性广泛，各种能制备成单细胞悬液的样本均可适用该发明，且成本较传统靶点开发方法大大降低。

Description

一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法。
背景技术
在活细胞筛选过程中，药物作用靶点涉及受体、酶、离子通道、转运体、免疫系统、基因等，相对于未知的药物靶点来说，已知的药物靶点只不过是冰山一角，如何能在众多的未知里发现并找到有效的药物靶点是当今医药领域的难题，新靶点的开发在整个药物研发过程中起着至关重要的作用，现代药物研究中，新靶点的建立往往是新药创新的前提和保障，而目前大部分医药公司都缺乏新靶点开发的有效手段，目前人类已发现的靶点停滞在500个左右，新靶点发现和确认的周期一般在三到五年左右，不仅周期较长、可重复性和通量较低，而且进行抗体开发需进行后续验证，开发成本高。
发明内容
针对背景技术中指出的问题，本发明提出一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.抗体芯片点制：用博奥醛基修饰基片和6万个抗体库，采用点样仪点制抗体芯片；
S2.活细胞质检：用显微镜观察细胞是否长势良好，并对细胞计数和采用台盼蓝对细胞染色，以确认细胞的个数以及细胞的存活率；
S3.芯片封闭：采用封闭液对抗体芯片进行封闭，并置于摇床1.5h；
S4.活细胞收集：每150ml皿中加入6ml EDTA对细胞消化，消化后将细胞进行离心处理，离心后去除上清液，随后加入IXPBS重悬细胞形成活细胞悬液；
S5.活细胞染色：按照每1ml活细胞悬液加0.2ul的DNA染料对细胞进行染色，染色时间0.5h，染色完成后离心并去除上清液，加入1ml IXPBS重悬细胞后再次离心，再次加入1ml IXPBS重悬细胞形成重悬细胞液；
S6.活细胞与抗体芯片孵育：取出抗体芯片，正面向上平放于反应容器中，缓慢加入所述重悬细胞液，室温下静置0.5h；
S7.芯片清洗及晾干：取出抗体芯片，在IXPBS中清洗，放置于芯片架上晾干；
S8.芯片扫描及数据处理：将芯片反面向下放置扫描仪中扫描，并对读片结果进行分析。
本发明进一步设置为：在S2中，细胞数量需达到1X107个。
本发明进一步设置为：在S3中，所述封闭液由2mg BSA溶于20ml PBST溶液中制成。
本发明进一步设置为：在S4中，细胞消化时可将细胞放入温箱孵育5min后进行离心处理。
本发明进一步设置为：在S4、S5中，离心时，离心的转速为1200rpm,时间为5min。
本发明进一步设置为：在S6中，在取出抗体芯片之前，需对所述重悬细胞液中加入EDTA溶液防止细胞聚团。
综上所述，本发明的有益效果为：通过抗体芯片和染色后活细胞进行反应，在较短时间内筛选得到能够和细胞表面靶点相结合的抗体，实验操作难度低，适用性广泛，各种能制备成单细胞悬液的样本均可适用该发明，且成本较传统靶点开发方法大大降低。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，包括以下步骤：
S1.抗体芯片点制：用博奥醛基修饰基片和6万个抗体库，采用采用ARRAYJET喷墨式飞行点样仪点制抗体芯片。
S2.活细胞质检：用显微镜观察细胞是否长势良好，细胞数量需达到1X107个，并对细胞计数和采用台盼蓝对细胞染色，以确认细胞的个数以及细胞的存活率。
S3.芯片封闭：采用封闭液对抗体芯片进行封闭，封闭液由2mg BSA溶于20ml PBST溶液中制成，并置于摇床1.5h。
S4.活细胞收集：若细胞处于悬浮状态，直接离心收集后重悬即可，每150ml皿中加入6ml EDTA对细胞消化，若细胞消化较慢，可将细胞放入温箱孵育5min以加速细胞消化，消化后将细胞进行离心处理，离心的转速为1200rpm,时间为5min，离心后去除上清液，随后加入IXPBS重悬细胞形成活细胞悬液。
S5.活细胞染色：按照每1ml活细胞悬液加0.2ul的DNA染料对细胞进行染色育，染色时间0.5h，染色完成后离心并去除上清液，加入1ml IXPBS重悬细胞后再次离心，再次加入1ml IXPBS重悬细胞形成重悬细胞液，离心时，离心的转速为1200rpm,时间为5min。
S6.活细胞与抗体芯片孵育：取出抗体芯片，正面向上平放于反应容器中，缓慢加入所述重悬细胞液，室温下静置0.5h，在此过程中，保持芯片区域始终浸没于重悬细胞液中，可每隔一段时间观察抗体芯片，吸取细胞液逐滴加在抗体芯片上，以帮助反应；在取出抗体芯片之前，取出一滴重悬细胞液滴于载玻片上在显微镜下观察细胞是否聚团，若细胞聚团严重，会影响抗体芯片孵育过程，可在重悬细胞液中加入EDTA溶液以防止细胞聚团。
S7.芯片清洗及晾干：取出抗体芯片，在IXPBS中清洗，在倒入IXPBS清洗时，需缓慢的加入，以细胞不会因为液体流动为准，在IXPBS中翻转抗体芯片，使得未结合细胞自然沉降，随后从溶液中取出抗体芯片，用吸水纸吸干多余溶液，完成清洗步骤，并将抗体芯片放置于芯片架上晾干。
S8.芯片扫描及数据处理：将芯片反面向下放置于GenePix4200A扫描仪中，将Pixel size设置为5μm、PMT设置为320进行扫描，在PMT为320的情况下，细胞过爆点均为活细胞，未过爆点为失活细胞，并对读片结果进行分析。
在S4中，若细胞处于悬浮状态，则去除消化步骤，直接离心收集后重悬即可。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.抗体芯片点制：用博奥醛基修饰基片和6万个抗体库，采用点样仪点制抗体芯片；
S2.活细胞质检：用显微镜观察细胞是否长势良好，并对细胞计数和采用台盼蓝对细胞染色，以确认细胞的个数以及细胞的存活率；
S3.芯片封闭：采用封闭液对抗体芯片进行封闭，并置于摇床1.5h；
S4.活细胞收集：每150ml皿中加入6ml EDTA对细胞消化，消化后将细胞进行离心处理，离心后去除上清液，随后加入IXPBS重悬细胞形成活细胞悬液；
S5.活细胞染色：按照每1ml活细胞悬液加0.2ul的DNA染料对细胞进行染色，染色时间0.5h，染色完成后离心并去除上清液，加入1ml IXPBS重悬细胞后再次离心，再次加入1mlIXPBS重悬细胞形成重悬细胞液；
S6.活细胞与抗体芯片孵育：取出抗体芯片，正面向上平放于反应容器中，缓慢加入所述重悬细胞液，室温下静置0.5h；
S7.芯片清洗及晾干：取出抗体芯片，在IXPBS中清洗，放置于芯片架上晾干；
S8.芯片扫描及数据处理：将芯片反面向下放置扫描仪中扫描，并对读片结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，其特征在于：在S2中，细胞数量需达到1X107个。
3.根据权利要求1所述的一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，其特征在于：在S3中，所述封闭液由2mg BSA溶于20ml PBST溶液中制成。
4.根据权利要求1所述的一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，其特征在于：在S4中，细胞消化时可将细胞放入温箱孵育5min后进行离心处理。
5.根据权利要求1所述的一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，其特征在于：在S4、S5中，离心时，离心的转速为1200rpm,时间为5min。
6.根据权利要求1所述的一种基于高通量抗体芯片的活细胞筛选方法，其特征在于：在S6中，在取出抗体芯片之前，需对所述重悬细胞液中加入EDTA溶液防止细胞聚团。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023016135A1 (zh) * 2021-08-12 2023-02-16 中国科学技术大学 生物样品中细菌鉴定及抗生素敏感性测试的分析方法

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