CN110157672A - 用于捕获特定细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于捕获特定细胞(例如，多种癌细胞，包括不表达EpCAM的癌细胞)的方法以及一种涉及该方法的用于分析特定细胞的方法。本发明包括一种用于捕获血液或生物流体中存在的特定细胞的方法，所述方法包括：使采样血液或生物流体富集，以及在流场中将特定细胞从血液或生物流体中捕获到亲水聚合物层上。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于从血液或者生物流体中捕获特定细胞(例如，血液或者生物流体中存在的癌细胞)的方法以及一种用于分析特定细胞的方法。
背景技术
当形成癌细胞时，已知它们到一定时候将出现在血液或者生物流体中。出现在血液中的这样的癌细胞被称为“循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)”。由此，可以预期：可对循环肿瘤细胞进行分析，例如用以评价癌症治疗效果、预测预后预期寿命、预测给药之前抗癌药物的效果、或者检验基于癌细胞遗传分析的治疗方法。
然而，存在下述问题：由于循环肿瘤细胞的数量非常少(若干～数百个细胞/1mL血液)，因此难以捕获这样的癌细胞。
例如，CellSearch系统被称为用于捕获循环肿瘤细胞的技术。涉及抗原-抗体反应(通过EpCAM抗体进行捕获)的该技术仅能够捕获表达EpCAM的癌细胞，因此，能够被捕获的癌细胞的种类是有限的。
引用文献列表
专利文献
专利文献1：JP 2005-523981 T
发明内容
技术问题
本发明的目的在于解决上述问题，并提供用于捕获特定细胞(例如，多种癌细胞，包括不表达EpCAM的癌细胞)的方法以及涉及该方法的用于分析特定细胞的方法。
解決问题的方案
本发明涉及一种用于捕获血液或者生物流体中存在的特定细胞的方法，所述方法包括：使采样血液或生物流体富集；以及在流场中将特定细胞从血液或生物流体中捕获到亲水聚合物层上。
优选地，特定细胞为癌细胞。
优选地，富集通过离心进行。
优选地，在富集之前，稀释采样血液或生物流体。
优选地，将缓冲溶液或液体培养基用于稀释。
优选地，流场通过振荡形成。
优选地，亲水聚合物层由选自聚(甲基)丙烯酰吗啉和下式(I)所示的聚合物中的至少一种亲水聚合物形成：
式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基，m表示1～5，n表示重复数。
优选地，亲水聚合物层由选自(甲基)丙烯酰吗啉和下式(I-1)所示的化合物中的至少一种亲水性单体与附加单体的共聚物形成：
式中，R1、R2和m如上所述。
优选地，亲水聚合物层的厚度为10～500nm。
本发明的另一方面涉及一种用于分析特定细胞的方法，包括：通过用于捕获特定细胞的方法从血液或生物流体中捕获特定细胞，以及分析特定细胞。
发明的有益效果
本发明的用于捕获血液或生物流体中存在的特定细胞的方法包括：使采样血液或生物流体富集，以及在流场中将特定细胞从血液或生物流体中捕获到亲水聚合物层上。特别是，由于在流场中实施该方法中的捕获步骤，因此可以不良地捕获血细胞(包括红细胞和白细胞以及血小板)，同时特定细胞比如癌细胞可以较少地受到流场影响，或者，相反地可以更好地捕获特定细胞比如癌细胞。由此，可以有效地捕获特定细胞(例如，多种癌细胞，包括不表达EpCAM的癌细胞)，从而选择性地捕获特定细胞比如癌细胞。
附图说明
图1显示具有其上形成有亲水聚合物层的孔的多孔板的示例性示意图。
[符号说明]
1：多孔板
11：孔
21：亲水聚合物层
具体实施方式
本发明的用于捕获血液或生物流体中存在的特定细胞的方法包括：使采样血液或生物流体富集，以及在流场中将特定细胞从血液或生物流体中捕获到亲水聚合物层上。
具体地，根据本发明方法，取样自例如身体的血液或生物流体首先例如通过离心法经过富集处理，以制备具有低于采样血液或生物流体的血细胞等水平的试样。然后，可在流场中将试样与亲水聚合物层接触，以从试样中捕获特定细胞比如癌细胞。因此，首先，由于富集处理降低血细胞等的细胞粘附抑制作用，因此处理过的特定细胞显示出它们固有的粘附于亲水聚合物的能力。此外，由于在流场中实施捕获步骤，因此与没有流场的方法相比，可以不良地捕获血细胞(包括红细胞和白细胞以及血小板)，同时特定细胞比如癌细胞可以较少地受到流场的影响，或者，相反地可以更好地被捕获。因此，本发明方法在选择性地捕获特定细胞方面是有效的，达到在没有流场的情况下永远无法实现的程度。
由此，可以有效地将血液或生物流体中的肿瘤细胞等捕获到亲水聚合物层上。然后，可以预期：通过计数被捕获的肿瘤细胞等的数量，可以确定血液或生物流体中的肿瘤细胞等的数量，例如用以评价癌症治疗效果。此外，可将被捕获的肿瘤细胞等进行培养，然后用来确定药物比如抗癌药物的效果。这使得我们能够确定在给药之前药物比如抗癌药物的体外效果，并且还有助于筛选药物比如抗癌药物。
可在用于捕获特定细胞的方法中使用的特定细胞的例子包括癌细胞(任何癌细胞，包括不表达EpCAM的癌细胞)。癌细胞的例子包括循环肿瘤细胞(CTCs)。
用于捕获特定细胞的方法包括首先使采样血液或生物流体富集。富集处理可为富集血液或生物流体的任何处理。特别是，它可以通过离心适当地进行。
优选地，在200～3000G(×g)的离心力下实施离心工艺。200G以上的离心力可以改善血细胞的分离并且减少特定细胞的损失(因特定细胞被混入红细胞等的部分中而导致的损失)，从而有效地选择性地捕获特定细胞。3000G以下的离心力可以减少对特定细胞的压力，从而维持它们的原始性质。离心力更优选为300～2800G，还更优选为400～2500G。
离心的持续时间和温度可例如考虑分离血细胞的能力来适当地进行选择。例如，离心可在2～40℃(优选地，3～30℃)的条件下，实施1～120分钟(优选地，1～60分钟)。离心工艺可通过公知技术进行，比如使用公知的离心分离器进行。
离心工艺中，可将采样血液或生物流体离心，随后除去包含血小板的上层清液，制备具有低于采样血液或生物流体的血小板水平的试样。此外，可将采样血液或生物流体离心，随后分离中间单核细胞层，分离和除去红细胞和血小板，从而制备具有提高水平的特定细胞比如癌细胞的试样。
用于捕获特定细胞的方法可包括：在富集处理之前，降低血液或生物流体中的蛋白质水平的附加处理。降低血液或生物流体中的蛋白质水平的附加处理可例如通过稀释采样血液或生物流体来实施。稀释可使用具有与人类血液相同的pH(约7.4)的缓冲溶液比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或者液体培养基比如杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)来实施。具体地，其可通过用缓冲溶液稀释采样血液或生物流体、或者通过将采样血液或生物流体添加至液体培养基用于稀释来进行，以获得低于采样血液或生物流体的蛋白质水平。
用于捕获特定细胞的方法中，富集处理(可选地，前面是附加处理)之后是在流场中将特定细胞捕获到亲水聚合物层上。
亲水聚合物层(由亲水聚合物形成的层)可形成在特定基底上。基底的例子包括：丙烯酸(酯)类树脂(聚丙烯酸(酯)类树脂)，比如聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸；环烯烃类树脂(聚环烯烃)；碳酸酯类树脂(聚碳酸酯)；苯乙烯类树脂(聚苯乙烯)；聚酯类树酯，比如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)；聚二甲基硅氧烷；以及玻璃，比如钠钙玻璃和硼硅(酸盐)玻璃。
亲水聚合物层(由亲水聚合物形成的层)的厚度优选为10～500nm，更优选为30～400nm，还更优选为50～350nm。在将厚度调整在上述范围之内时，可以良好地实现癌细胞的选择性捕获以及其它蛋白质和细胞的低吸附。
亲水聚合物可适当地选自具有亲水性的聚合物。例如，其可为一种或两种或更多种亲水性单体的均聚物或者共聚物，或者一种或两种或更多种亲水性单体与附加单体的共聚物。这样的均聚物和共聚物的例子包括聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰吗啉、聚甲基丙烯酰吗啉、聚丙烯酰胺以及聚甲基丙烯酰胺。
亲水性单体可为包含亲水基的任何单体。亲水基的例子包括公知的亲水基，比如酰胺基、硫酸基、磺酸基、羧酸基、羟基、氨基以及氧(化)乙烯基。
亲水性单体的具体例子包括：(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯(例如，(甲基)丙烯酸烷氧基烷基酯比如(甲基)丙烯酸甲氧基乙酯，以及(甲基)丙烯酸羟烷基酯比如(甲基)丙烯酸羟乙酯)、(甲基)丙烯酰胺以及包含环基的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，(甲基)丙烯酰吗啉)。其中，优选(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷氧基烷基酯以及(甲基)丙烯酰吗啉，其中更优选(甲基)丙烯酸烷氧基烷基酯，其中特别优选丙烯酸-2-甲氧基乙酯。
可适当地选择附加单体，只要它没有抑制亲水聚合物的效果即可。其例子包括可以赋予温度响应性的芳香族单体，比如苯乙烯、乙酸乙烯酯以及N-异丙基丙烯酰胺。
特别是，亲水聚合物优选选自聚(甲基)丙烯酰吗啉和下式(I)所示的聚合物中的至少一种：
式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基，m表示1～5，n表示重复数。
R2表示的烷基优选具有1～10个碳原子，更优选1～5个碳原子。特别是，R2特别优选为甲基或者乙基。符号m优选为1～3。符号n(重复单元的数量)优选为15～1500，更优选为40～1200。
或者，亲水聚合物还可合适地为选自(甲基)丙烯酰吗啉和下式(I-1)所示的化合物中的至少一种亲水性单体与附加单体的共聚物。
式(I-1)中，R1、R2和m如上所述。
亲水聚合物层的表面优选至少部分(部分或者全部)与水的接触角为25～75°，更优选为35～75°，还更优选为35～70°。在亲水聚合物层具有这种预定的与水的接触角时，可以良好地实现本发明的效果。
亲水聚合物层可通过下述方法形成：将亲水聚合物溶解或分散在任何溶剂中以制备亲水聚合物溶液或分散体，然后通过公知方法(比如，方法(1)：通过将亲水聚合物溶液或分散体注射到基底表面(基底的凹处)中，并且将其保留干燥预定时间，或者，方法(2)：通过将亲水聚合物溶液或分散体涂布(喷雾)到基底表面，并且将其保留干燥预定时间)用亲水聚合物溶液或分散体全部或者部分涂覆基底表面。据此，可以制造配置有由亲水聚合物形成的聚合物层的基底。然后，可将配置有亲水聚合物层的基底与视需要的其它部件组合，以制备能够分析特定细胞的装置。
溶剂、注射法、涂布(喷雾)法以及其它条件可采用传统公知的材料或方法。
方法(1)或方法(2)中的保留/干燥时间可根据基底尺寸、引入液体的种类以及其它参数适当地进行选择。保留时间优选为5分钟～10个小时，更优选为10分钟～5个小时，还更优选为15分钟～2个小时。干燥优选在室温(约23℃)～80℃下实施，更优选在室温～50℃下实施。此外，干燥可在减压条件下实施。此外，可将亲水聚合物溶液或分散体保留特定时间段，可选地随后在干燥之前排出过剩溶液或分散体。
溶剂可为能够溶解亲水聚合物的任何溶剂，并且可根据所使用的亲水聚合物适当地选择。其例子包括：水、有机溶剂和它们的溶剂混合物。有机溶剂的例子包括：醇类，比如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和甲氧基丙醇；酮类，比如丙酮和甲基乙基酮；四氢呋喃；乙腈；乙酸乙酯；以及甲苯。
用于捕获特定细胞的方法中，可在流场中将通过使血液或生物流体经过富集处理制得的试样(具有较低血细胞水平的试样)与配置有亲水聚合物层的基底接触，以捕获特定细胞。
用于捕获特定细胞的方法中使用的术语“流场”是指其中试样流动(移动)的条件。本发明中，在试样流动的同时，实施捕获到亲水聚合物层上。流场可适当地通过例如振荡来形成。
振荡可通过任何方式实施，优选地例如通过往复振荡、旋转振荡、8字形振荡、波形振荡或者上下(前后)振荡实施，更优选地通过波形振荡实施。这种振荡可通过公知振荡器产生。
振荡速度(振荡器的旋转数)优选为1～100rpm，更优选为5～50rpm，还更优选为10～30rpm。振荡期间的倾斜角(振荡角度)优选为1～40度，更优选为2～20度，还更优选为3～10度。振荡的温度和持续时间可适当地例如考虑捕获特定细胞的能力来选择。例如，振荡可在室温(约23℃)～45℃的温度下实施1～360分钟。
将试样与亲水聚合物层接触可通过能够进行这种接触的任何方法进行，例如通过注射或者涂布(喷雾)试样进行。
通过在流场中将试样与亲水聚合物层接触，可以将试样中存在的特定细胞捕获到亲水聚合物层上，同时降低血细胞等的吸附。因此，可例如通过将接触试样保留在流场中预定时间然后将其进行洗涤，选择性地将特定细胞捕获到亲水聚合物层上。然后，可以预期：通过计数被捕获的特定细胞的数量，可以确定采样血液或生物流体中的特定细胞的数量，例如用以评价癌症治疗效果。
用于捕获特定细胞的方法可使用例如包括基底(比如多孔板或者腔室载玻片)与可选的附加部件的装置来实施。图1图示示例性多孔板1。
图1中的多孔板1是旨在捕获特定细胞的装置(其中孔11以所谓的矩阵式排列)。多孔板1具备多个具有圆形开口的孔11。孔11凹陷，可将通过使采样血液或生物流体经过富集处理以减低血细胞等水平而制得的试样注入其中。与直接对采样血液或生物流体进行分析时相比，在对注入流场中的试样进行分析时，可以有效地捕获特定细胞。因此，可以确认血液或生物流体中特定细胞的存在与否、计数特定细胞的数量、培养特定细胞、判定药物效果以及筛选药物。
虽然图1图示了作为示例的具有以4行×6列排列的24个孔11的24孔板，但是多孔板1具有至少两个孔11即可，并且可设置任何数量的孔11。除24孔板外的示例包括其中孔11的数量为6、96、384个等的常规多孔板。
每个孔11是在多孔板1的表面开口的非贯通孔。可通过各开口，将通过使血液或生物流体经过富集处理而制得的试样注入孔11中。如果确认存在特定细胞的话，则还可注射用于培养特定细胞的培养液。
对各孔11的开口直径R和深度D没有特别限定，其可为常规的多孔板1的那些参数。虽然图1中各孔11的内侧表面大致垂直于多孔板1的相对面，但是孔11的内侧表面可从开口到底部倾斜以变细。或者，内侧表面可从开口到底部倾斜以扩张。
虽然图1中的孔11为圆形开口，但是孔11的开口可为任何形状比如四边形。
多孔板1可适宜地为其中多个孔11为可分(离)的多孔板。在配置有多个孔时，可将它们分成用于计数特定细胞的数量的孔和用于培养特定细胞的孔。例如，可首先在用于计数的孔中确定特定细胞的存在与否，并且如果确定存在的话，然后可在用于培养的孔中培养特定细胞，然后将其用来判定药物效果。适当的腔室载玻片中，腔室的数量为至少一个但不大于十个。
多孔板1或腔室载玻片中，孔11优选具有至少部分地形成在其内表面上的亲水聚合物层。图1所示的示例中，亲水聚合物层21形成在孔的底表面和一部分侧表面上。
一旦将通过使血液或生物流体经过富集处理而制得的试样引入孔11中并且使用振荡器振荡(流场)，则可以将试样中存在的特定细胞捕获到亲水聚合物层21上，同时降低血细胞等的吸附。因此，可通过将引入试样保留在流场中预定时间然后将其进行洗涤，选择性地将特定细胞捕获到亲水聚合物层21上。
本发明的用于分析特定细胞的方法包括：通过上述方法从血液或生物流体中捕获特定细胞比如癌细胞，以及分析特定细胞。这种方法可以捕获特定细胞(例如，多种癌细胞，包括不表达EpCAM的癌细胞)。此外，这种方法可以充分地从血液或生物流体中捕获特定细胞，同时降低其它蛋白质和细胞的粘附或者附着，从而选择性地捕获特定细胞。
用于分析特定细胞的方法中，可适宜地将亲水聚合物层与(已将血细胞等从其中除去的)血液接触。这可以进一步增强特定细胞比如癌细胞的选择性捕获。血细胞等的除去可通过公知技术(比如膜分离以及如上所述的离心)进行。
实施例
本发明通过参照下述实施例进行具体说明，但不限于下述实施例。
(装置实施例1)
使用偶氮二异丁腈(AIBN)，在80℃的温度下将丙烯酸-2-甲氧基乙酯进行热聚合6个小时，制备聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)(分子量：Mn＝约15，000，Mw＝约50，000)。然后，制备1.0质量％的聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)在甲醇中的溶液。
将该聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)溶液(1质量％)注入聚苯乙烯24孔板的孔中，并且在室温下放置30分钟。其后，使用吸液管部分地吸取溶液，随后进行干燥，制备医用分析装置。
(装置实施例2)
如装置实施例1那样制备医用分析装置，所不同的只是：将聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)溶液的浓度变更为2.5质量％。
(装置实施例3)
如装置实施例1那样制备医用分析装置，所不同的只是：将聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)溶液的浓度变更为5.0质量％。
(装置实施例4)
如装置实施例1那样制备医用分析装置，所不同的只是：使用硼硅(酸盐)玻璃腔室载玻片，并且将聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)溶液的浓度变更为0.3质量％。
(装置实施例5)
如装置实施例4那样制备医用分析装置，所不同的只是：将聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)溶液的浓度变更为0.5质量％。
(装置实施例6)
如装置实施例1那样制备医用分析装置，所不同的只是：未注射聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)溶液，并且未形成聚(丙烯酸-2-甲氧基乙酯)层。
[亲水聚合物层(涂层)的厚度]
医用分析装置的亲水聚合物层的厚度通过使用TEM，在加速电压为15kV、放大倍率为1000倍的条件下，测量(图示)亲水聚合物层的截面来测定。
[与水的接触角]
将2μL体积的蒸馏水滴落在各医用分析装置的亲水聚合物层的表面上。三十秒后，在室温下通过θ/2方法测量接触角。
[掺入癌细胞的全血的分析]
将染色的人类结肠腺癌(HT-29)细胞悬浮在全血中以使得每mL血液为100个细胞的浓度，制备掺料血液。使用等体积的液体培养基稀释掺料血液，制备掺料血液稀释物。接下来，向15mL离心管中添加用于分离的溶液(Lymphoprep，密度＝1.077±0.001g/mL)，然后添加掺料血液稀释物，随后在室温(约23℃)下在800G的离心力下离心20分钟。然后，分离单核细胞层。向分离的单核细胞层中添加磷酸盐缓冲(PBS)溶液，随后再次离心，富集单核细胞层。在离心之后，将最下层的聚集体悬浮在体积等于初始全血体积的含有10％胎牛血清(FBS)的液体培养基中。在静止条件下(在不振荡的情况下)或者在振荡的条件下，将1mL部分的悬浮物注入各孔或者腔室中，并且在37℃的温度下放置1个小时以产生粘附。然后，用PBS溶液洗去未粘附细胞。其后，使用荧光显微镜计数粘附癌细胞的数量。
使用购自Taitec公司的Wave-PR振荡器，在37℃的温度下，通过波形振荡(倾斜角6°，20rpm)进行振荡。
[表1]
在将通过使血液或生物流体经过富集处理而制得的试样在流场中与亲水聚合物层(涂层)接触时，选择性地捕获了特定细胞比如癌细胞，并且提高了粘附特定细胞的数量。
Claims (10)
1.一种用于捕获血液或生物流体中存在的特定细胞的方法，所述方法包括：
使采样血液或生物流体富集；以及
在流场中将特定细胞从血液或生物流体中捕获到亲水聚合物层上。
2.根据权利要求1所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，特定细胞为癌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，富集通过离心进行。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，在富集之前，稀释采样血液或生物流体。
5.根据权利要求4所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，将缓冲溶液或液体培养基用于稀释。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，流场通过振荡形成。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，亲水聚合物层由选自聚(甲基)丙烯酰吗啉和下式(I)所示的聚合物中的至少一种亲水聚合物形成：
式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基，m表示1～5，n表示重复数。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，亲水聚合物层由选自(甲基)丙烯酰吗啉和下式(I-1)所示的化合物中的至少一种亲水性单体与附加单体的共聚物形成：
式中，R1表示氢原子或者甲基，R2表示烷基，m表示1～5。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的用于捕获特定细胞的方法，
其中，亲水聚合物层的厚度为10～500nm。
10.一种用于分析特定细胞的方法，包括：
通过权利要求1～9中任一项所述的用于捕获特定细胞的方法从血液或生物流体中捕获特定细胞，以及
分析特定细胞。
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