CN115837092A - 一种凝胶海绵敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种凝胶海绵敷料及其制备方法，本发明凝胶海绵敷料的制备方法，包括：制备丝素蛋白溶液，制备壳聚糖溶液，制备外泌体，将壳聚糖溶液和丝素蛋白溶液体积比2:3，进行混合，得混合液，调节混合液的pH至中性，将混合液注入模具中于‑25℃至‑18℃冷冻10‑15小时，于‑75℃至‑65℃冷冻4‑8小时，再冷冻干燥40‑50小时，再真空干燥10‑15小时，制得海绵支架，称量外泌体并用PBS缓冲液浸润溶解，称量海绵支架加入PBS溶解的外泌体，再加入乙酰基五肽和乙酰基六肽，浸润溶胀后制得凝胶海绵敷料‑80℃保存；本发明制备的凝胶海绵敷料的表面孔径为50‑150μm，内部横切孔径为200‑500μm，可以加速创面的愈合，特别是在高血糖环境下。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种凝胶海绵敷料及其制备方法。
背景技术
外泌体作为一种活细胞分泌的亚细胞成分，广泛参与细胞之间的交流，并可以作为干细胞的旁分泌因子来发挥生物学效应。目前的研究表明多种干细胞来源的外泌体可以促进创面修复与皮肤组织再生，而外泌体对皮肤相关细胞功能的，影响是其中的机制之一，例如外泌体可以促进成纤维细胞、上皮细胞的増殖、迁移、分泌功能等。
此外，对于糖尿病慢性创面而言，由于局部组织高糖、炎症状态等可使相关细胞的增殖、迁移能力、分泌相关蛋白能力受损，创面愈合困难。例如高糖的环境会抑制HSFs的功能，促进细胞的凋亡。
动物研宄表明应用外泌体可以促进创面修复与皮肤再生。目前外泌体的应用方法主要是通过创面周围局部多点注射、尾静脉注射。然而这样的外泌体应用方法也存在缺点，例如尾静脉全身给药的方法可能会造成外泌体的流失、浪费，也可能会对机体的其他部位产生未知影响；无论是尾静脉注射、局部多点注射的方式会造成皮肤的二次创伤，对于糖尿病患者，由于周围神经、血管病变，即使是很小的伤口也有可能发展为难愈性溃疡，增加感染风险，在肢端皮肤尤为严重；周围局部注射不能使外泌体广泛、均匀的接触创面等。因此探索一种简单、无创、有效的外泌体应用方式，不但有助于创面的愈合，也将为外泌体在临床的应用于推广奠定基础。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种凝胶海绵敷料及其制备方法，以解决目前对外泌体的给药方式的不足，进一步解决创面愈合困难的问题，进一步解决在高血糖环境中创面愈合困难。
为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种凝胶海绵敷料的制备方法，包括：
S100、制备丝素蛋白溶液；
S200、制备壳聚糖溶液；
S300、制备外泌体；
S400、将所述壳聚糖溶液和丝素蛋白溶液体积比2:3，进行混合，搅拌20-40min，得混合液；调节所述混合液的pH至中性；
将所述混合液注入模具中于-25℃至-18℃冷冻10-15小时，于-75℃至-65℃冷冻4-8小时，再冷冻干燥40-50小时，再真空干燥10-15小时，制得海绵支架；
称量外泌体并用PBS缓冲液浸润溶解；
称量所述海绵支架加入PBS溶解的外泌体，再加入乙酰基五肽和乙酰基六肽，浸润溶胀后制得凝胶海绵敷料-80℃保存。
进一步，所述丝素蛋白溶液的浓度为2w/v%-6w/v%。
进一步，所述壳聚糖溶液采用1（v/v）%醋酸溶解壳聚糖，所述壳聚糖溶液的浓度为2w/v%-6w/v%。
进一步，所述海绵支架的质量与所述外泌体的体积比为0.169g：0.4-0.6ml。
进一步，所述乙酰基五肽和乙酰基六肽的总质量与所述海绵支架的质量比为0.05:0.169。
进一步，所述外泌体的制备方法包括：
取3-8代的GMSCs，以2*106/皿的密度接种于15cm的细胞培养皿中，加入含10%FBS，1ｘ双抗的DMEMＤ/F12培养基20ml，在37℃，5%CO2的条件下培养；
待培养皿中的细胞汇合率达到75-80%后，弃去培养基，15mlPBS清洗，每皿中加入20ml含10%exosomes-free血清DMEMＤ/F12培养基，继续培养48h后收集培养上清；
将细胞用0.25%的胰酶消化后离心，重悬后按1:4传代，继续培养，收集细胞培养上清；
将收集的细胞培养上清在4℃、2000ｇ的条件下离心，收集离心后的上清并用0.22μm的滤膜过滤；
将过滤后的上清置于超滤离心管中，4℃，5000ｇ的条件下离心20min，收集超滤后的液体；
将qEV-外泌体分离柱固定在铁架台上，柱子下方放置15ml离心管，接收废液或者收集分离出的外泌体。
第二方面，本发明提供所述凝胶海绵敷料的制备方法所制备的凝胶海绵敷料。
进一步，所述凝胶海绵敷料的表面孔径为50-150μm；所述凝胶海绵敷料的内部横切孔径为200-500μm；所述凝胶海绵敷料的厚度为0.5-2mm。凝胶海绵敷料在去离子水中的溶胀率为2110%，在PBS中的溶胀率为1750%，在SBF中的溶胀率为1556%，在FBS中的溶胀率为1440%。
第三方面，本发明提供一种制备凝胶海绵敷料的组合物，包括：
169重量份海绵支架；
50重量份的乙酰基五肽和乙酰基六肽；
与重量份对应的400-600体积份的外泌体；
所述海绵支架由以下重量份的组合物制成：
3体积份的2w/v%-6w/v%丝素蛋白溶液；
2体积份的2w/v%-6w/v%壳聚糖溶液。
进一步，所述丝素蛋白溶液浓度为4w/v%；所述壳聚糖溶液浓度为2w/v%；所述乙酰基五肽和乙酰基六肽的质量比为1:1。
本发明的有益效果在于：本发明提供的凝胶海绵敷料及其制备方法，凝胶海绵敷料的表面孔径为50-150μm；所述凝胶海绵敷料的内部横切孔径为200-500μm；所述凝胶海绵敷料的厚度为0.5-2mm，可以增加辅料透气性以及携带更多的有效药物，并且对于伤口的渗出液有较好的吸收；搭载GMSCs外泌体，可以促进创面的愈合，特别是高血糖环境下，创面愈合困难的情况。
附图说明
图1 为本发明实施例海绵支架。
图2为本发明实施例凝胶海绵敷料。
图3为本发明实施例凝胶海绵敷料内横切孔径的扫描电镜图。
图4为本发明实施例凝胶海绵敷料表面孔径的扫描电镜图。
图5为本发明实施例编号1及空白组小鼠实验图。
实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
称取60 g生丝和25.44 g的无水碳酸钠备用，量取12 L的去离子水倒入不锈钢桶中，并用电磁炉加热。在去离子水即将沸腾时，加入称量好的无水碳酸钠，继续加热并搅拌至沸腾，使得无水碳酸钠充分溶解，再加入称量好的生丝，保持沸腾煮90 min，每隔5 min搅拌一次，以溶解生丝表面的丝胶。将脱胶后的生丝用去离子水揉搓4遍，使得生丝表面的丝胶充分清除，最后将脱胶丝中的水分拧干，置于通风橱过夜干燥。
将干燥的脱胶蚕丝称取25g放到盛有9.3 M的100 mL溴化锂的烧杯中，并用玻璃棒搅动润湿，锡箔纸封口后。将烧杯放置在60 ℃烘箱中加热4小时以促进脱胶蚕丝溶解。紧接着，将全部溶解后的丝素蛋白、溴化锂共混液倒入截留分子量为3500 Da的透析袋中，并用透析夹固体两端。将装有丝素蛋白、溴化锂共混液的透析袋放入盛有20L去离子水的塑料桶中，使用涡流振动器不断在容器底部振动以加快溴化锂的溶出，透析时间为72小时，总共换水9-10次。待溴化锂去除干净后，将再生丝素蛋白溶液放置于离心机中并在转速为9000rpm和4 ℃低温条件下下反复离心两次，最后得到干净的再生丝素蛋白溶液，放置于4 ℃冰箱保存。
进一步通过称重法测定再生丝素蛋白溶液浓度，即取称重皿称重记为W1，在皿中加入VmL蚕丝蛋白溶液后放入60 ℃烘箱中干燥6小时后再次称重并标记为W2。依据下列公式计算出再生丝素蛋白溶液的浓度（w/v）。
浓度=（W2-W1）/ V×100%，制备2-6w/v%丝素蛋白溶液。
取3-8代的GMSCs，以2*106/皿的密度接种于15cm的细胞培养皿中，加入含10%FBS，1ｘ双抗的DMEMＤ/F12培养基20ml，在37℃，5%CO2的条件下培养；
待培养皿中的细胞汇合率达到75-80%后，弃去培养基，15mlPBS清洗，每皿中加入20ml含10%exosomes-free血清DMEMＤ/F12培养基，继续培养48h后收集培养上清；
将细胞用0.25%的胰酶消化后离心，重悬后按1:4传代，继续培养，收集细胞培养上清；
将收集的细胞培养上清在4℃、2000ｇ的条件下离心，收集离心后的上清并用0.22μm的滤膜过滤；
将过滤后的上清置于超滤离心管中，4℃，5000ｇ的条件下离心20min，收集超滤后的液体；
将qEV-外泌体分离柱固定在铁架台上，柱子下方放置15ml离心管，接收废液或者收集分离出的外泌体；
将收集到的外泌体置于超滤离心管中，在4℃，5000ｇ的条件下离心20min进行浓缩，利用BCA蛋白检测试剂盒测定收集到GMSCs外泌体后，-80℃保存。
1（v/v）%醋酸50mL，壳聚糖浓度为2-6wt%，搅拌均匀后利用水系0.45μm滤膜进行过滤得滤液备用，在 4 ℃条件下保存。
将上述壳聚糖溶液和丝素蛋白溶液体积比2:3，进行混合，搅拌30min，得混合液；
调节混合液的pH到达中性；
将上述溶液注入模具中于-25℃至-18℃冷冻10-15小时，于-75℃至-65℃冷冻4-8小时，再冷冻干燥40-50小时，再真空干燥10-15小时，制得海绵支架，参见图1；
称量外泌体的质量为0.05 g，并用PBS缓冲液0.5mL浸润溶解；
称量上述海绵支架质量为0.169g，加入6中PBS溶解外泌体的体积为0.5mL，加入乙酰基五肽和乙酰基六肽，浸润溶胀后制得凝胶海绵敷料，参见图2，于-80℃保存。
实施例
采用实施例1的方法，按以下配方制备凝胶海绵敷料。
表1 凝胶海绵敷料组分表
经检测凝胶海绵敷料的表面孔径为50-150μm；凝胶海绵敷料的内部横切孔径为200-500μm；凝胶海绵敷料的厚度为0.5-2mm。具体的标号1的凝胶海绵辅料的检测图参见图3、4。
将实施例2制备的编号1-9凝胶海绵敷料进行小鼠实验。
健康雄性SD大鼠，体重280-320ｇ。
高糖高脂喂养10周，禁食12ｈ后，记录体重、血糖。根据体重，以35mg/kg的量给大鼠腹腔注射STZ（STZ用pH4.2，0.1mol／L的柠檬酸钠配置，0.22pｍ
滤膜滤，暗处配置，30min内注射完毕）。１周后再次记录体重血糖值变化，继续注射STZ—次。
连续测量鼠体重、空腹血糖５周，记录体重、血糖值的变化情况，大鼠血糖值高于11mmol／Ｌ且保持稳定即认为造模成功，保留进入后续试验。
采用编号1-9凝胶海绵敷料覆盖于实验鼠和正常饲养鼠的背部皮肤创面；设置空白对照组，采用与编号1-9凝胶海绵敷料相同剂量的PBS，滴加在无菌医用纱布上，覆盖于实验鼠和正常饲养鼠的背部皮肤创面。具体步骤如下：
将所有实验器械、材料、试剂等进行高压、过滤或者辐照灭菌等处理后备用。
将造模成功糖尿病大鼠注射戊巴比妥钠（45mg／kg）进行腹腔麻醉。
麻醉后，剔去大鼠背部毛发，消毒周围皮肤，将大鼠俯卧位固定，在大鼠背部制备直径为1cm的圆形全层皮肤缺损，直至暴露肌肉层，拍照记录每只大鼠的创面，待动物复苏后将其放回笼内继续饲养，术后给予双抗水喂养。每三天按照上述方法给大鼠换药一次。定时观察防止大鼠绷带脱落或被大鼠撕咬、扯掉。在第１周每组各过量麻醉处死大鼠，拍照记录，对创面区域扩大切除取材，固定于4%多聚甲醛中，用于后续检测。
照记录背部皮肤创面的愈合情况，采用IPP6.0软件测量缺损的面积，计算各编号的凝胶海绵敷料在1周后的创面愈合率。具体结果见表2。
表2 一周后大鼠愈合率情况表
参见图5，为编号1凝胶海绵敷料与空白组进行的小鼠实验情况，编号1的效果最好，测定编号1的凝胶海绵敷料的参数如下：
凝胶海绵敷料在去离子水中的溶胀率为2110%，在PBS中的溶胀率为1750%，在SBF中的溶胀率为1556%，在FBS中的溶胀率为1440%。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种凝胶海绵敷料的制备方法，其特征在于，包括：
S100、制备丝素蛋白溶液；
S200、制备壳聚糖溶液；
S300、制备外泌体；
S400、将所述壳聚糖溶液和丝素蛋白溶液体积比2:3，进行混合，得混合液；调节所述混合液的pH至中性；
将所述混合液注入模具中于-25℃至-18℃冷冻10-15小时，于-75℃至-65℃冷冻4-8小时，再冷冻干燥40-50小时，再真空干燥10-15小时，制得海绵支架；
称量外泌体并用PBS缓冲液浸润溶解；
称量所述海绵支架加入PBS溶解的外泌体，再加入乙酰基五肽和乙酰基六肽，浸润溶胀后制得凝胶海绵敷料-80℃保存。
2.根据权利要求1所述凝胶海绵敷料的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的浓度为2w/v%-6w/v%。
3.根据权利要求1所述凝胶海绵敷料的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液采用1v/v%醋酸溶解壳聚糖，所述壳聚糖溶液的浓度为2w/v%-6w/v%。
4.根据权利要求1所述凝胶海绵敷料的制备方法，其特征在于，所述海绵支架的质量与所述外泌体的体积比为0.169g：0.4-0.6ml。
5.根据权利要求1所述凝胶海绵敷料的制备方法，其特征在于，所述乙酰基五肽和乙酰基六肽的总质量与所述海绵支架的质量比为0.05:0.169。
6.根据权利要求1所述凝胶海绵敷料的制备方法，其特征在于，所述外泌体的制备方法包括：
取3-8代的GMSCs，以2*106/皿的密度接种于15cm的细胞培养皿中，加入含10%FBS，1ｘ双抗的DMEMＤ/F12培养基20ml，在37℃，5%CO2的条件下培养；
待培养皿中的细胞汇合率达到75-80%后，弃去培养基，15mlPBS清洗，每皿中加入20ml含10%exosomes-free血清DMEMＤ/F12培养基，继续培养48h后收集培养上清；
将细胞用0.25%的胰酶消化后离心，重悬后按1：４传代，继续培养，收集细胞培养上清；
将收集的细胞培养上清在4℃、2000ｇ的条件下离心，收集离心后的上清并用0.22μm的滤膜过滤；
将过滤后的上清置于超滤离心管中，4℃，5000ｇ的条件下离心20min，收集超滤后的液体；
将qEV-外泌体分离柱固定在铁架台上，柱子下方放置15ml离心管，接收废液或者收集分离出的外泌体。
7.权利要求1-6任一所述凝胶海绵敷料的制备方法所制备的凝胶海绵敷料。
8.根据权利要求7所述凝胶海绵敷料，其特征在于，所述凝胶海绵敷料的表面孔径为50-150μm；所述凝胶海绵敷料的内部横切孔径为200-500μm；所述凝胶海绵敷料的厚度为0.5-2mm；凝胶海绵敷料在去离子水中的溶胀率为2110%，在PBS中的溶胀率为1750%，在SBF中的溶胀率为1556%，在FBS中的溶胀率为1440%。
9.一种制备凝胶海绵敷料的组合物，其特征在于，包括：
169重量份海绵支架；
50重量份的乙酰基五肽和乙酰基六肽；
与重量份对应的400-600体积份的外泌体；
所述海绵支架由以下重量份的组合物制成：
3体积份的2w/v%-6w/v%丝素蛋白溶液；
2体积份的2w/v%-6w/v%壳聚糖溶液。
10.根据权利要求9所述制备凝胶海绵敷料的组合物，其特征在于，所述丝素蛋白溶液浓度为4w/v%；所述壳聚糖溶液浓度为2w/v%；所述乙酰基五肽和乙酰基六肽的质量比为1:1。
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