CN114369262B - 一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架、制备方法及其应用 - Google Patents
一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架、制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114369262B CN114369262B CN202210279508.4A CN202210279508A CN114369262B CN 114369262 B CN114369262 B CN 114369262B CN 202210279508 A CN202210279508 A CN 202210279508A CN 114369262 B CN114369262 B CN 114369262B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- silk fibroin
- solution
- microspheres
- hydrogel
- drug
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 21
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 68
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 45
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 56
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 6
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 4
- 208000024216 Periapical disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014151 Stomatognathic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 2
- 208000018035 Dental disease Diseases 0.000 claims 2
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004262 dental pulp cavity Anatomy 0.000 description 16
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 6
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 2
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004023 minocycline Drugs 0.000 description 2
- DYKFCLLONBREIL-KVUCHLLUSA-N minocycline Chemical compound C([C@H]1C2)C3=C(N(C)C)C=CC(O)=C3C(=O)C1=C(O)[C@@]1(O)[C@@H]2[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C1=O DYKFCLLONBREIL-KVUCHLLUSA-N 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001157 Fourier transform infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000010634 clove oil Substances 0.000 description 1
- 239000000805 composite resin Substances 0.000 description 1
- 230000009519 contusion Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000003566 sealing material Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4164—1,3-Diazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/65—Tetracyclines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/02—Local antiseptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/12—Powdering or granulating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明提供一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架，该支架通过微球嵌入到水凝胶多孔结构中，增加了支架的机械性能，防止了MTA的塌陷，并且该支架可利用不同结构丝素蛋白降解速度的不同来控制不同药物的释放，以此来达到不同时间段各药物的作用。具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域，更为具体地，本发明涉及改良的丝素蛋白水凝胶支架的制备方法及其应用。
背景技术
年轻恒牙根尖周病一直是临床治疗的难点。牙髓血运重建术是近年来年轻恒牙根尖周病治疗的新方法，通过根管冲洗消毒，避免机械预备，通过针刺引导根尖部血液充溢于根管并诱导根尖干细胞进行增殖分化，以此来达到根管内血管样组织的形成，促进牙根继续发育，取得较好的临床疗效。
牙髓血运重建术具体操作步骤如下：
1、根管消毒：橡皮障隔离患牙，常规被动开髓，次氯酸钠与生理盐水交替冲洗，彻底去除根管内感染物。干燥根管后，导入三联抗菌糊剂，玻璃离子暂封。
2、根管消毒两周后，局麻下，去除暂封材料，次氯酸钠、17%EDTA和生理盐水交替冲洗根管内残留坏死牙髓及抗菌糊剂，干燥根管，口腔显微镜下，15号K挫针刺根尖部出血，静待15分钟后血凝块形成，血凝块上放置MTA，氧化锌丁香油暂封闭开髓口。
一周后去除暂封物，探及MTA硬固后，复合树脂永久性充填。
然而在临床实际应用时，存在如下技术弊端：
1、MTA使用过程中容易发生塌陷，因血凝块机械性能不足，可造成血凝块的破坏作用；
2、血凝块不成形：由于根尖部长期炎症的破坏，根尖部组织受到影响；
3、根管残留菌无法去除干净，细菌的残留会致使血凝块不形成、干细胞生长受限以及根管的再次感染；
根管牙本质中保留的生长因子含量较少，促进干细胞增殖、分化的能力有限。
因此，迫切需要对该技术和所用材料进行改良，使之能获得更好的治疗效果。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种具有较好机械性能并能够控制不同药物释放速度的丝素蛋白基水凝胶支架、制备方法及其应用。具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架的制备方法，所述方法包括如下步骤：
A、从蚕茧中提取丝素蛋白原液；
B、丝素蛋白微球制取：
（1）将药物溶于丝素蛋白溶液中，搅拌均匀后，匀速滴加到含 Span-80 的石蜡（油相）中，滴加完后继续恒温恒速下搅拌，而后匀速滴加戊二醛使材料固化成球，而后将含微球的混合相离心，取上层油相混微球层，加入无水乙醇进行离心，弃液体，得到成型微球，微球洗涤后经真空冷冻干燥备用；
（2）将步骤（1）提取的丝素蛋白原液稀释成3%的丝素蛋白溶液，将药物加入到3%丝素蛋白溶液中,配制成的含有药物的3%的丝素蛋白溶液, 超声处理30s, 形成含有药物的丝素蛋白前体溶液,与此同时,将含有药物的微球加入到含有药物的丝素蛋白前体溶液中，紫外灭菌，37oC温箱中静置凝胶，获得丝素蛋白基水凝胶支架。
在一种实施方式中，上述制备方法中步骤A中丝素蛋白原液的提取，是通过将蚕茧碎片在Na2CO3溶液中煮沸获得丝素，经洗涤干燥后，再加入适量LiBr溶液，获得丝素蛋白溴化锂溶液，纯水透析，离心去除杂质，获得丝素蛋白原液。
在一种实施方式中，丝素蛋白原液的浓度可根据如下方法确定：
取100μl的溶液滴在铝箔上，并使其在60oC下干燥，称量干燥后的重量，将铝箔重量记为Wo；滴有丝素蛋白溶液的铝箔重量记为W1；干燥后的铝箔重量记为W2；
丝素蛋白浓度=【（ W2-Wo）/（W1-Wo）】/100μl （单位：g/μl）。
在一种实施方式中，上述制备方法中步骤A中，将制备的丝素蛋白原液用去离子水稀释为浓度为5%的丝素蛋白溶液用于步骤2。
在一种实施方式中，上述制备方法中步骤B（1）中，成型微球经洗涤并离心九次后备用，前六次用无水乙醇，最后三次用 PBS。
在一种实施方式中，上述制备方法中步骤B（1）中，Span-80和液体石蜡的体积比为1：10。
在一种实施方式中，上述制备方法中步骤B（1）中戊二醛和丝素蛋白溶液的体积比为5:1。
在一种实施方式中，上述制备方法中步骤B（2）中，含有药物的微球与含有药物的丝素蛋白前体溶液体积比为1:10。
本发明的第二个方面，提供由上述方法制备获得的丝素蛋白基水凝胶支架，该支架具有增强的机械性能和时序性释放药物的性能。
本发明的第三个方面，提供上述丝素蛋白基水凝胶支架及其制备方法在制备治疗牙科用药物或材料中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下有益的技术效果：
1、载药的丝素蛋白基水凝胶支架具有增强的机械性能，防止了MTA的塌陷；
2、使用本发明制备的丝素蛋白基水凝胶支架中的水凝胶组件装载抗生素，可直接减少根尖部炎症的破坏；
3、当装载的药物为抗生素时，抗生素的释放可以清除残留在根管内的细菌，减少炎症反应；
4、丝素蛋白基水凝胶支架中的组件微球装载促牙髓牙本质再生的药物后，药物释放后可以促进干细胞的增殖、分化；
5、本专利中支架可时序性释放药物，以此来发挥支架不同时期的不同作用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例1中改良型丝素蛋白基水凝胶基支架制作的示意图（图内药物的加入不仅局限于此，仅为举例说明）；
图2为实施例2中支架组件水凝胶，微球及微球嵌入到水凝胶后的扫描电镜图；
图3为本发明制备的水凝胶红外分析图；
图4为本发明制备的微球红外分析图；
图5为β-折叠含量占比分析；
图6为水凝胶及微球降解实验图；
图7为纯水凝胶支架及含有10%微球水凝胶支架图；
图8为水凝胶摇床抖动视频截图（左：纯丝素蛋白水凝胶支架 右：含有10%微球的丝素蛋白水凝胶支架）。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 丝素蛋白基水凝胶支架的合成
一、合成材料/试剂：
二、具体合成步骤如下（示意图如图1所示）：
1、丝素蛋白提取
（1）2L超纯水于2L烧杯中，盖铝箔，加热至沸腾。
（2）将蚕茧用钛剪刀剪成小块，并处理掉蚕虫，称量5g的蚕茧碎片。
（3）称量4.24g的Na2CO3。
（4）将称量的Na2CO3溶于水中，完全溶解（制备0.02M Na2CO3溶液）。
（5）水开始沸腾时，加入茧片，继续沸腾30min，偶尔用玻璃棒搅拌促进丝素分散。
（6）用玻璃棒取出丝素蛋白，用超纯水冲洗冷却，弃掉Na2CO3溶液，把多余的水从丝素中挤出来。
（7）将丝素放入到呈有1L超纯水烧杯中，搅拌。
（8）用水冲洗20min且同时轻轻搅拌。
（9）重复步骤（7）-（8），共3次。
（10）3次洗涤后，取出丝素，充分挤压，将其摊铺在干净的铝箔上。
（11）让丝素蛋白在通风柜中干燥一夜。
（12）称量可用丝素蛋白的量和9.3M的LiBr，比例：20%的溶液为丝素蛋白，80%为LiBr。
丝素蛋白（克）：LiBr（mL）=1:4（1克/4毫升）
即LiBr总体积（V总）=干燥丝素蛋白质量 x 4
（13）制备9.3M LiBr溶液（冰上进行）
LiBr质量=（86.86 g/mol）*（9.3 mol/L）*（1L/1000mL）* V总
（14）将丝素蛋白紧紧压入50mL玻璃烧杯中，并在顶部添加所需量的LiBr溶液。
（15）使用20mL注射器和18号针头，将12mL丝素蛋白的溴化锂溶液注入到3-12mL透析盒中（小心不要刺穿或触摸透析膜。溶液非常粘稠，溶液在加入透析盒保持湿度，尽可能避免剪切溶液，以避免在丝素蛋白诱导β片形成，因此仅在注入丝素时使用针）。
（16）每12mL丝素蛋白溴化锂溶液用1L纯水透析，使用磁性搅拌进行搅拌，1h、4h、当晚、第二天早上、晚上、第三天早上换水（48h换水6次）
（17）用另一个20mL注射器和18号的针头从盒中取出丝素蛋白，将丝素放入到50mL离心管内，如果多余40mL时，等体积分装到两个离心管中。
（18）离心去除杂质，4oC，9000rpm（—12700g），20min。
（19）取出离心管后，将上清液转移至新的离心管内。
（20）重复步骤（18）-（19）。
（21）确定溶液中丝素蛋白的浓度：取100μl的溶液滴在铝箔上，并使其在60oC下干燥，称量干燥后的重量：
铝箔重量为Wo，滴有丝素蛋白溶液的铝箔重量为W1，干燥后的铝箔重量为W2，
丝素蛋白浓度=[（ W2-Wo）/（W1-Wo）]/100μl （单位：g/μl）
2、丝素蛋白微球制取（油包水单乳液法）：
（1）称取适量小分子药物（促牙髓牙本质再生药物）溶于5%丝素蛋白溶液中，置于数显恒温磁力搅拌器中搅拌均匀20min 后备用。
（2）量取25ml的液体石蜡，向其中加入2.5mlSpan-80（乳化剂），作为油相，同样置于数显恒温磁力搅拌器中搅拌均匀 10min 备用（VSpan-80：V液体石蜡=1:10）；
（3）将3ml含有小分子药物的丝素蛋白溶液匀速滴加到含 Span-80 的石蜡（油相）中，滴加完后继续恒温恒速下搅拌 10min，而后匀速滴加15ml戊二醛（V戊二醛：V丝素蛋白溶液=5:1），同样温度及拌速度下，使材料固化成球；
（4）戊二醛滴加完后，同样温度及搅拌速度下继续搅拌 60min，而后将含微球的混合相分装至 50ml 离心管中，置于离心机中离心4200rmp 10min，取上层油相混微球层，加入10ml无水乙醇进行离心10min，弃液体，得到成型微球，而后将得到的微球洗涤并离心三次，前两次用无水乙醇，最后一次用 PBS，最后将洗涤好的微球置于培养皿中，放入真空冷冻干燥机中干燥 24h 后收集备用。
3、丝素蛋白水凝胶支架制备
将提取的丝素蛋白原液稀释成3%的丝素蛋白溶液，将10µg甲硝唑、10µg环丙沙星、2.5µg米诺环素组成的三联抗生素加入到1ml3%丝素蛋白溶液中,配制成的含有10µg/ml甲硝唑、10µg/ml环丙沙星、2.5µg/ml米诺环素三联抗生素的3%的丝素蛋白溶液,在功率为的80w超声设备(SCIENTZ-950E)下超声处理30s,形成含有三联抗生素的丝素蛋白前体溶液,与此同时,将含有促牙髓-牙本质再生小分子药物(促牙髓牙本质再生药物)的微球加入到丝素蛋白溶液中(V微球:V丝素蛋白前体溶液=1:10),紫外灭菌30min，37oC温箱中15min左右凝胶。
4、凝胶后可通过注射器注射到根管内（注入量视根管情况而定），形成牙髓再生支架。
5、通过水凝胶和微球降解速度的不同，控制两种药物的释放。药物释放的预期：第一阶段释放抗生素，第二阶段释放小分子药物促牙髓-牙本质的再生。
通过在超声处理后的水凝胶前体溶液中加入三联抗生素以及载有促牙髓-牙本质再生药物的微球，实现在载药的同时嵌入微球，从而增强支架性能。根据SEM图（图2）可见：A图是制备成水凝胶的横截面图，水凝胶孔隙大小为10-35µm，B图是制备成微球的表面图，微球大小为50-300nm，C图是微球嵌入到水凝胶孔隙图，可看到孔隙表面粗糙，微微球结构，D图是C图的孔隙表面放大图，红色箭头指向微球结构，可看到微球的表面凸起结构，由此可以说明，微球可以嵌入到水凝胶內，以此来达到增强水凝胶支架的机械性能。
实施例2 含有微球和药物的丝素蛋白水凝胶的物理性能验证
图3、图4、图5展示了实施例1制备的水凝胶和微球的红外吸收光谱图及分峰图谱，通过FTIR分析（FTIR图在1600cm-1-1700cm-1丝素蛋白酰胺I吸收峰分峰处理，计算丝素蛋白各二级结构含量占比）可见，酰胺I及酰胺II中，主峰都显示在β-折叠的吸收波长处，表明水凝胶及微球以β-折叠为主，同时通过分峰处理进行分析β-折叠含量占比，丝素蛋白水凝胶中β-折叠含量占比为44%，微球中β-折叠含量占比为55%，说明在水凝胶中β-折叠含量占比要比微球中的β-折叠含量占比高，说明微球相比水凝胶来说更加稳定。
为了进一步说明降解速度与β-折叠含量占比的关系，通过降解实验进行验证。图6中A图展示了水凝胶和微球的降解速度，通过降解比较，水凝胶在5天可降解23%左右，微球降解在10%左右，说明微球降解速度较水凝胶慢，且水凝胶降解速度快于微球，B图是水凝胶和微球药物释放曲线，水凝胶中的药物在5天释放了80%，微球由于本身在凝胶內，且降解速 度缓慢，5天只释放了36%。
此外，我们还验证了微球嵌入对水凝胶支架的机械性能的增强作用：图7展示了纯丝素蛋白水凝胶支架和含有10%微球的丝素蛋白水凝胶支架，从图中可知，嵌入微球后的水凝胶颜色更白，透明度更低，表明微球均匀的嵌入在丝素蛋白凝胶中。将凝胶打出注射器过程中，直立位注射出时，嵌入微球的水凝胶可以维持原有的结构，而纯水凝胶支架形状发生改变，由此可以说明微球的嵌入可以显著增加水凝胶的机械性能。进一步对水凝胶及嵌入微球的水凝胶进行机械性能检测，分析弹性（储存）模量G’和粘性（损失）模量G”，结果表明，各组水凝胶弹性模量强于粘性模量，说明水凝胶具有很好的弹性，在增加微球后，G’和G”增 加，表明机械性能也随着微球的加入进一步提升。图8是水凝胶摇床抖动视频的截图，将纯水凝胶和嵌入微球的水凝胶在摇床上进行抖动比较，相同强度的摇力下，纯水凝胶抖动幅度较嵌入微球的水凝胶抖动幅度大，说明纯水凝胶机械性能较嵌入微球的水凝胶差。
上述实验说明：载药的丝素蛋白基水凝胶支架机械性能较好，通过在水凝胶的多 孔结构中嵌入微球，增强了水凝胶的机械性能，维持了水凝胶多孔的结构，防止其塌陷导致 干细胞生长环境受到破坏。通过水凝胶和微球两种结构进行不同药物的装载，由于两者结 构中丝素蛋白β-折叠含量的不同，降解速度会有所差异，因此可以实现药物的时序性释放。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A. 从蚕茧中提取丝素蛋白原液；
B. 丝素蛋白微球制取：
（1）将药物溶于丝素蛋白溶液中，搅拌均匀后，匀速滴加到含 Span-80 的石蜡中，滴加完后继续恒温恒速下搅拌，而后匀速滴加戊二醛使材料固化成球，而后将含微球的混合相离心，取上层油相混微球层，加入无水乙醇进行离心，弃液体，得到成型微球，微球洗涤后经真空冷冻干燥备用；
（2）将步骤（1）提取的丝素蛋白原液稀释成3%的丝素蛋白溶液，将药物加入到3%丝素蛋白溶液中,配制成的含有药物的3%的丝素蛋白溶液, 超声处理30s, 形成含有药物的丝素蛋白前体溶液,与此同时,将含有药物的微球加入到含有药物的丝素蛋白前体溶液中，紫外灭菌，37oC温箱中静置凝胶，获得丝素蛋白基水凝胶支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中丝素蛋白原液的提取，是通过将蚕茧碎片在Na2CO3溶液中煮沸获得丝素，经洗涤干燥后，再加入适量LiBr溶液，获得丝素蛋白溴化锂溶液，纯水透析，离心去除杂质，获得丝素蛋白原液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，丝素蛋白原液的浓度可根据如下方法确定：
取100μl的溶液滴在铝箔上，并使其在60oC下干燥，称量干燥后的重量，将铝箔重量记为Wo；滴有丝素蛋白溶液的铝箔重量记为W1；干燥后的铝箔重量记为W2；
丝素蛋白浓度=【（ W2-Wo）/（W1-Wo）】/100μl , 浓度单位：g/μl。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，将制备的丝素蛋白原液用去离子水稀释为浓度为5%的丝素蛋白溶液用于步骤2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B（1）中，成型微球经洗涤并离心九次后备用，前六次用无水乙醇，最后三次用 PBS。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B（1）中，Span-80和液体石蜡的体积比为1：10, 戊二醛和丝素蛋白溶液的体积比为5:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B（2）中，含有药物的微球与含有药物的丝素蛋白前体溶液体积比为1:10。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的制备方法制备获得的丝素蛋白基水凝胶支架，其特征在于，该支架具有增强的机械性能和时序性释放药物的性能。
9.一种根据权利要求1-7任一所述的制备方法或根据权利要求8所述的丝素蛋白基水凝胶支架在制备治疗牙科疾病的药物或材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述牙科疾病包括恒牙根尖周病。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210279508.4A CN114369262B (zh) | 2022-03-22 | 2022-03-22 | 一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架、制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210279508.4A CN114369262B (zh) | 2022-03-22 | 2022-03-22 | 一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架、制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114369262A CN114369262A (zh) | 2022-04-19 |
| CN114369262B true CN114369262B (zh) | 2022-05-20 |
Family
ID=81146560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210279508.4A Active CN114369262B (zh) | 2022-03-22 | 2022-03-22 | 一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架、制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114369262B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115671388A (zh) * | 2022-04-29 | 2023-02-03 | 复向丝泰医疗科技(苏州)有限公司 | 一种性能可调控的丝蛋白的可注射微球凝胶及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170218228A1 (en) * | 2014-07-30 | 2017-08-03 | Tufts University | Three Dimensional Printing of Bio-Ink Compositions |
| CN106362208B (zh) * | 2016-09-23 | 2019-07-26 | 武汉纺织大学 | 一种制备丝素-黄原胶水凝胶支架的方法 |
| CN107744601B (zh) * | 2017-09-06 | 2020-09-25 | 盐城工业职业技术学院 | 一种基于蚕丝微球生物墨水的三维打印伤口包覆材料及其制备方法 |
| CN108653741B (zh) * | 2018-05-24 | 2021-06-25 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用 |
| CN113318275B (zh) * | 2021-08-03 | 2021-11-02 | 首都医科大学附属北京口腔医院 | 用于牙髓牙本质再生的可降解水凝胶 |
-
2022
- 2022-03-22 CN CN202210279508.4A patent/CN114369262B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114369262A (zh) | 2022-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6588499B2 (ja) | トロンビン血清の調製、その利用およびその調製機器 | |
| Lorenz et al. | Individualized titanium mesh combined with platelet-rich fibrin and deproteinized bovine bone: a new approach for challenging augmentation | |
| Liu et al. | Biomaterial scaffolds for clinical procedures in endodontic regeneration | |
| EP3672607B1 (fr) | Composition comprenant de la gelee de wharton, procede de preparation et utilisations | |
| JP2003516815A (ja) | 自己血小板ゲルとその膜を調製する方法、およびこの方法を実施するためのキット | |
| CN108066815A (zh) | 一种骨植入材料及其制备方法和应用 | |
| CN108653327B (zh) | 一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法 | |
| CN114369262B (zh) | 一种改良的丝素蛋白基水凝胶支架、制备方法及其应用 | |
| CN105999359B (zh) | 一种外用敷料及其制备方法和应用 | |
| WO2013062495A2 (en) | A tube to produce platelet rich fibrin | |
| CN109437559A (zh) | 生物活性玻璃、生物活性玻璃凝胶及其制备方法和应用 | |
| CA3138899A1 (en) | Tissue derived porous matrices and methods for making and using same | |
| EP4362960A1 (fr) | Materiau biologique impregne d'une solution comprenant des exosomes | |
| CN114316162B (zh) | 光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物及其制备方法与应用 | |
| CN110840655A (zh) | 一种基于自体浓缩生长因子的生物活性敷料及其制备方法 | |
| JP2012006937A (ja) | 液体成分を分離する方法及び装置 | |
| CN115837092A (zh) | 一种凝胶海绵敷料及其制备方法 | |
| CN107412878B (zh) | 复合纤维支架及其制备方法 | |
| CN103169951B (zh) | 一种具有细胞募集性的凝胶微囊及其制备方法 | |
| TW202026416A (zh) | 分離血液的方法 | |
| Migauskaitė et al. | Second generation platelet concentrates in periodontal surgery: a narrative review and clinical perspectives | |
| CN113831453B (zh) | 一种温度响应性透明质酸、水凝胶及其制备方法与应用 | |
| CN111467576B (zh) | 仿真胆囊壁合成材料及其制备方法和应用以及仿真胆囊壁 | |
| US20240216433A1 (en) | Methods and systems for preparation of mononuclear-platelet rich fibrin matrix, and compounds thereof | |
| Pradhan et al. | Platelet Rich Fibrin: Role as a Regenerative Material in Developing Countries |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |