CN117618658A

CN117618658A - 一种外泌体富集支架的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN117618658A
Application number: CN202311678517.1A
Authority: CN
Inventors: 袁记方; 李美蓉; 侯倩; 付小兵
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2023-12-08
Filing date: 2023-12-08
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本发明公开了一种外泌体富集支架的制备方法及其应用，本发明公开了一种外泌体富集支架的制备方法，并提供了根据此制备方法制备出的外泌体富集支架。本发明还提供了一种富集外泌体的方法，以及一种外泌体保存运输的方法。本发明还提供了一种使用前面所述的制备方法、富集方法及支架产品在制备产品中的应用，所述制备产品可包括创口修复、脑损伤治疗、组织再生、组织重建、抑制炎症、免疫调节、旁分泌调控、毛囊再生、促进细胞增殖、促进细胞迁移、促进细胞管状结构形成、促进血管化多个方面，具有极为广阔的市场应用前景。

Description

一种外泌体富集支架的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种外泌体富集支架的制备方法及其应用。

背景技术

皮肤创面的再生修复仍然是一个挑战。伤口愈合是一个复杂的生物学过程，包括出血、炎症、增殖和重塑，受到各种细胞、细胞因子和细胞外基质(ECM)的影响。大量研究表明，人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)具有促进组织修复的潜力，包括皮肤、肌肉和骨骼。旁分泌效应已成为这些细胞生物活性的主流理论，它是通过外泌体(exosomes)介导的，外泌体是一种由脂质双层膜包裹的亚细胞结构，大小从40nm到160nm，由大多数细胞类型释放。这些外泌体由多种生物分子组成，如蛋白质、脂质、DNA、mRNA和miRNA，对细胞分化、增殖、血管生成、应激反应和免疫信号传导至关重要。越来越多的证据表明，间充质干细胞来源的外泌体具有加速伤口愈合的再生潜力。这些外泌体通过诱导表观遗传改变影响受体细胞，正向调节其生理状态，促进增殖或抑制凋亡，从而导致组织修复和再生。然而，由于外泌体在体内的快速清除导致生物活性降低，且分离方法复杂，成本高且耗时，因此其临床应用仍然具有挑战性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，提供了以下的技术方案：

本发明提供了一种外泌体富集支架的制备方法，所述制备方法包括对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架。

进一步，所述制备方法包括如下步骤：

1)壳聚糖溶于弱酸中，混匀，使其充分溶解；

2)-20℃冷冻3小时，通过-80℃下冷冻干燥24小时，得到壳聚糖-海绵复合多孔支架；

3)对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架。

术语“热改性”是指使用环境温度对复合支架进行改造的过程，特指的，环境温度为高于常温的温度，“热改性”后支架的表面性质发生改变。

在一些实施方案中，所述恒温干燥热改性的过程持续10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min。在一些实施方案中，所述恒温温度的范围包括160℃、161℃、162℃、163℃、164℃、165℃、166℃、167℃、168℃、169℃、170℃、171℃、172℃、173℃、174℃、175℃、176℃、177℃、178℃、179℃、180℃。

进一步，所述步骤1)中弱酸包括乙酸、碳酸、亚硝酸、次氯酸。

进一步，所述步骤1)中弱酸为乙酸。

进一步，所述步骤1)中乙酸为1％v/v。

进一步，所述步骤1)中壳聚糖溶液终浓度为1％-3％。

在一些实施方案中，所述壳聚糖溶液终浓度为1％、1.5％、2％、2.5％、3％。

进一步，所述步骤1)中混匀包括搅拌混匀、震荡混匀，所述混匀时间为3h。

进一步，所述步骤3)中干燥包括鼓风干燥。

进一步，所述外泌体包括干细胞外泌体。

进一步，所述外泌体包括间充质干细胞外泌体。

进一步，所述外泌体包括细菌产生的外泌体。

进一步，所述外泌体包括体细胞产生的外泌体。

术语“外泌体”是指由体内几乎所有细胞类型分泌的内吞衍生的纳米囊泡。外泌体或外泌体样囊泡包括蛋白质、核酸(尤其是miRNA)和脂质。在实践中，可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法，或由其改进的方法，分离和/或纯化外泌体或外泌体样囊泡。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为干细胞，更具体地，所述细胞为间充质干细胞。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为体细胞。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为细菌。

术语“支架”是指可用于将目标载荷或任何其它化合物(例如，ASO)在EV(细胞外囊泡，例如，外泌体)的腔表面上或外表面上锚定至EV的分子。在某些方面中，支架包含合成分子。在一些方面中，支架包含非多肽部分。在其它方面中，支架包含天然存在于EV中的脂质、碳水化合物或蛋白质。在一些方面中，支架包含不天然存在于EV中的脂质、碳水化合物或蛋白质。可用于实施例中的其它支架的非限制性实例包括：氨基肽酶N(CD13)；脑啡肽酶，AKA膜金属内肽酶(MME)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)；神经纤毛蛋白-1(NRP1)；CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素(MFGE8)、LAMP2和LAMP2B。

术语“壳聚糖”是指由氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和N-乙酰葡糖胺(乙酰单位)随机分布，并透过β-(1-4)糖苷键组合而成的线性多糖。壳聚糖通过壳多糖的脱乙酰化来制备。术语“壳聚糖”涉及壳聚糖、壳聚糖衍生物以及壳聚糖与壳聚糖衍生物的混合物。

本发明提供了一种根据前面所述的制备方法制备的外泌体富集支架。

在一些实施方案中，所述富集是指从大量母体物质中搜集欲测定的痕量元素至一较小体积，从而提高其含量至测定下限以上的这一操作步骤。试样中含量少于0.01％的痕量物质，如果它的含量低于分析方法的测定下限，就必须采用预富集的方法。在一个具体的实施方案中，所述富集的目的物为外泌体。

本发明提供了一种富集外泌体的方法，所述方法如下的步骤：

1)将外泌体溶液与MES缓冲液以1:4的比例进行混合，调整pH值，然后添加前面所述的外泌体富集支架，冰上混匀，得到结合到外泌体富集支架上的外泌体；2)使用碱性溶液洗涤释放外泌体富集支架上的外泌体，得到外泌体富集产物。

进一步，所述pH值包括5.8-6.2。

在一些具体的实施方案中，所述pH值调整到5.8、5.85、5.9、5.95、6.0、6.05、6.1、6.15、6.2。

进一步，所述冰上混匀时间为30min，混匀方式为震荡混匀。

进一步，所述碱性溶液包括磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸铵、磷酸二氢铵、和/或磷酸氢二铵配制的溶液。

进一步，所述碱性溶液为NaHCO₃溶液。

进一步，所述NaHCO₃溶液pH值包括8.0-10.6。

在一些实施方案中，所述碱性溶液NaHCO₃溶液pH值包括8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6。

进一步，所述MES缓冲液pH值为6.0。

进一步，所述MES缓冲液浓度为100mM。

进一步，所述外泌体溶液还包括初步除杂的步骤。

进一步，所述初步除杂的步骤包括：对外泌体溶液使用过滤器去除死细胞与细胞碎片。

进一步，过滤器包括直径为0.2μm的过滤器。

术语“过滤器”是指在过滤过程中能够通过外泌体，但阻挡死细胞或细胞碎片或其他大体积物质的过滤器。

进一步，所述富集外泌体的方法的步骤可不断重复进行。

在一些实施方案中，所述富集外泌体的方法可在同一含有外泌体溶液中不断富集外泌体，也可将多份不同来源的外泌体溶液中的外泌体富集到一起。在一个具体的实施方案中，所述富集外泌体的方法包括如下步骤：1)对外泌体溶液使用过滤器去除死细胞与细胞碎片。2)将过滤溶液与MES缓冲液(pH＝6.0)按1:4的比例混合，将pH值调整为5.8-6.2。然后将T-CS支架加入混合物中，放在冰上摇晃30min。3)将与外泌体结合的T-CS直接用于动物实验、分析、冷冻干燥或经NaHCO₃(pH＝8.0-10.6)洗涤后释放的外泌体收集。

术语“碱性溶液”意味着在常温状态下pH大于7.0的溶液，也可理解为溶液中氢氧根浓度大于氢离子浓度。术语“酸性溶液”意味着在常温状态下pH小于7.0的溶液，也可理解为溶液中氢离子浓度大于氢氧根浓度。

本发明提供了一种外泌体保存运输的方法，所述方法将前面所述富集外泌体的方法中步骤1)结合到外泌体富集支架上的外泌体整体进行冻干，然后直接室温下运输和/或储存。

进一步，所述冻干状态下的外泌体在室温下运输和/或储存均不损害其分子完整性。

术语“冻干”是指“冷冻干燥”过程，其包含使水从冷冻状态转化为气态而不经过液态。冷冻干燥过程去除含水材料中的水分，同时材料保持冷冻状态。冻干的基本过程包含以下步骤：冷冻、初级干燥(升华)和二级干燥(脱附)。首先，将溶解和/或悬浮物质在低温(例如，-60℃)下冷冻。缓慢冷冻产生更大的晶体，使升华物质逸出。一些产物形成玻璃状材料，并且在冷冻过程中可能需要退火。退火是指首先降低温度，再提高温度，然后再次降低温度，将成分锁定于原位，然后使晶体生长。冷冻时间可在1小时至24小时的范围内，具体取决于应用。在步骤2(初级干燥)中，然后经由真空提取水或稀释剂，从而产生多孔的干燥的“饼状物”。升华在真空下发生，产物温度低于其临界温度。这通常是耗时最长的过程。在初级干燥循环结束时，产物将具有3％至5％的水分含量。采用最终干燥步骤(二级干燥)来去除残留的未冷冻的水分子。该过程通过加热产物来完成。二级干燥可导致水分含量为约0.5％。

本发明提供了一种前面所述富集外泌体的方法制备的组合物，所述组合物包括外泌体富集支架及结合到其上的外泌体，和/或收集到的外泌体。

术语“组合物”是指富集到的外泌体和结合其的外泌体富集支架的组合物。组合物的物理形式不受限制。例如，术语“组合物”涵盖并公开了一种粉末，其中所述列举的物质各自以粉末形式存在。作为另一示例，术语“组合物”还涵盖并公开了一种液体溶液，其中所述列举的物质各自以可溶性形式存在。作为另一示例，术语“组合物”还涵盖并公开了一种乳液，其中存在列举的物质。作为另一示例，术语“组合物”还涵盖并公开了一种悬浮液，其中存在列举的物质。

本发明提供了前面所述的制备方法在制备外泌体富集支架中的应用。

如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中涉及的“约”某值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。

本发明提供了前面所述的制备方法、前面所述的外泌体富集支架、前面所述富集外泌体的方法、前面所述的组合物在制备产品中的应用。

进一步，所述产品包括创口修复产品、脑损伤治疗产品、组织再生产品、组织重建产品、抑制炎症产品、免疫调节产品、旁分泌调控产品、毛囊再生产品、促进细胞增殖产品、促进细胞迁移产品、促进细胞管状结构形成产品、促进血管化产品。

如本文使用的术语“一个”、“一种”和“该”包括单数指代和复数指代，除非上下文另外明确指明。术语“基本上由......组成”用于定义包括所列举要素但排除其他要素的脂质组合物，即，该术语脂质组合物用于限定基本上仅由脂质组成的组合物。“由......组成”因而意指排除其他要素的超过痕量的要素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案在本发明的范围内。

本发明提供了前面所述的制备方法、前面所述的外泌体富集支架、前面所述富集外泌体的方法在制备富集外泌体的系统或装置中的应用。

本发明中所使用的术语“系统”指具有将多台计算机、多个硬件、装置等经由例如网络等通信介质(包括以一对一的方式建立的通信连接)彼此相连的构造的系统，或指由一台计算机、一个硬件、一个装置等来实现的系统。另外，术语“系统”不限于多个组件或特定实施例。例如，一种系统可以在一个或多个印刷电路板或其他基板上实现，并且可以具有可移动或静态的组件。尽管以下描述和示例使用术语“系统”来描述本发明的各个方面，但是术语“系统”不限于对象的特定配置，类型或数量。

本发明提供了一种外泌体富集的系统或装置，所述系统包括前面所述的制备方法、前面所述富集外泌体的方法，所述制备方法或方法由计算机存储程序自动执行。

进一步，所述计算机存储程序自动执行通过操作装置进行，所述操作装置包括存储器和处理器。

进一步，所述存储器中存储有计算机程序。

术语“存储器”指代任何类型的长期、短期、易失性、非易失性或其它存储器，且不应限于任何特定类型的存储器或任何特定数目的存储器或存储存储器的媒体的类型。术语“存储器”可以是任何合适的存储器元件(例如，随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程ROM(EPROM)、电可擦除可编程ROM(EEPROM)、专用集成电路(ASIC)等)、软件、硬件、固件、或者在适当的情况下并基于特定需要的任何其他合适的组件、设备、元件或对象。

术语“处理器”是指任何类型的处理器，诸如微处理器、嵌入式处理器、数字信号处理器(DSP)、网络处理器、或用于执行代码的其他设备，可以包括多于一个处理器，例如多核设计或每个处理器具有多核设计的多个处理器。处理器可以被配置成执行计算机程序指令的序列，例如存储在存储器中的那些指令的序列，以执行根据本发明的内容的示例性实施方式的各种操作、处理和方法。

在本说明书和所附权利要求书全文中，除非上下文另外要求，否则词语“包含”以及变化形式如“包含的”应理解为暗示包括陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。例如，包括一系列元素的组合物、混合物、过程、方法、物品或装置不一定仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出的或这样的组合物、混合物、过程、方法、物品装置固有的其他元素。

本发明的优点和有益效果：

本发明建立了一种简单有效的利用壳聚糖在不同pH值下富集外泌体的方法。开发的方法允许通过生物活性海绵支架自动捕获和释放外泌体。体外和体内研究表明，外泌体通过促进细胞增殖、迁移和管状结构形成，抑制炎症，促进血管化和促进毛囊再生来促进再生愈合。

附图说明

图1是T-CS的表征图，A为不同变性温度下CS的SEM图像(比例尺＝100μm)；B为CS、CS-T120、CS-T140、CS-T160、CS-T180的体积变化率；C为CS、CS-T120、CS-T140、CS-T160、CS-T180的FTIR光谱；D为吸附时间，所有结果显示为平均值±标准差，n＝3，**p<0.01，NS:无统计学意义；

图2是外泌体的特征图，A为Exo(T-CS)的TEM图，B为洗脱前后T-CS吸附外泌体的SEM图，C为外泌体标志物CD81和CD9在Exo(UC)和Exo(T-CS)中的表达图，D为冻干T-CS-E的SEM图；

图3是外泌体的直径(A)和相对疗效(B)图；

图4是外泌体的迁移与增殖结果图，A为负载有外泌体的T-CS支架敷料的释放特征图；B为CCK-8法检测HUVECs增殖图；C为HUVECs划痕实验图(比例尺：400μm)，D为伤口闭合分析图，E为共培养6h后的管形成结果图(比例尺：200μm)，F为管形成分析图；

图5是ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-10的浓度结果图；

图6是体内伤口愈合实验图，A为第0、4、7、14天各组创面代表性图，B为伤口动态愈合过程示意图，C为伤口面积随时间的变化图，D为第7天、14天H&E染色图，E为7天的舌表皮长度图，F为Masson染色图；

图7是免疫组化检测结果图，A为术后第7天小鼠皮肤创面TNF-α、IL-1β、IL-10的免疫组化分析图，B为TNF-α，IL-1β和IL-10的定量表达图，C为术后第4天小鼠皮肤创面IL-1β和IL-10蛋白印迹分析图，数字1代表对照组，数字2代表T-CS-E，D为IL-1β和IL-10的定量表达图；

图8是Ki67组化结果图，A为治疗组第7天创面切片Ki67免疫组化代表性图，B为第7天各处理组Ki67阳性细胞分析图；

图9是检测血管化结果图，A为治疗组第7天和第14天创面切片CD31免疫组织化学代表性图，B为第7天各治疗组的微血管密度分析图，C为第14天各治疗组微血管密度分析图；

图10是各种创面新生血管形成结果图，A为7天创面α-SMA免疫化学染色图，B为各组第7天新生血管数量统计图；

图11是烧伤皮肤愈合结果图，A为第0、9和17天皮肤创面图，B为定量分析创面收缩面积百分比图，C为第17天创面皮肤组织he染色、Masson三色染色图，D为定量分析肉芽组织厚度及胶原占面积百分比图，E为第17天观察创面愈合情况图。

具体实施方式

实施例1支架制备与外泌体分离富集

1、材料与方法

1)壳聚糖支架的制备

根据现有方法制备壳聚糖-海绵复合多孔支架。简而言之，壳聚糖(脱乙酰度≥95％，200-400mPa；s，阿拉丁，中国)溶解于1％乙酸(v/v)中并用磁力搅拌器搅拌3小时。随后，将所得化合物均匀分成48孔板并在-20℃冷冻3小时。-80℃冷冻干燥24h获得壳聚糖海绵复合多孔支架(CS)。然后采用恒温风干箱在特定温度下对支架进行10min-30min的热改性，得到酸不溶性支架(T-CS)。

2)细胞培养和外泌体分离

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)通过消化和离心方法从新鲜人脐带中分离，如前所述用含10％ FBS和1％青霉素-链霉素溶液(Gibco，美国)的α-MEM培养基培养，传代6次前用于实验。HUVEC细胞系(c-12,206,Promo cell，德国)在含10％ FBS和1％青霉素-链霉素溶液(Gibco，美国)的DMEM培养基中培养。对这两种细胞进行了细菌、真菌、支原体和病毒污染的检测，发现没有这些污染物。

采用传统的超离心法(ultra-centrifugation,UC)[26]和改良的支架分离法分离外泌体hUC-MSCs在37℃无外泌体培养基中培养48h，收集培养液(CCM)，室温下300×g离心10min分离细胞，获得外泌体。UC法将死细胞2000×g于4℃下颗粒化10min，外泌体16500×g颗粒化20min，然后以10万×g(WX100+，Thermo Fisher Scientific,USA)超速离心70min。丢弃上清液后，用PBS洗涤外泌体颗粒，以10万×g超速离心70min，去除全部液体。最后用200μL 1×PBS重悬外泌体。为了在T-CS上吸附外泌体，将CCM通过直径为0.2μm的过滤器过滤，去除死细胞和细胞碎片，然后与MES缓冲液(pH＝6.0)按1:4的比例混合，将pH值调整为5.8-6.2，然后将T-CS支架加入混合物中，放在冰上摇晃30min。将与外泌体结合的T-CS直接用于动物实验、分析、冷冻干燥或经NaHCO₃(pH＝8.0-10.6)洗涤后释放的外泌体收集。

3)T-CS和外泌体的特征

采用5.0kV扫描电镜(ZEISS Gemini SEM 300)观察T-CS及其结合的外泌体的形态。为了获得电导率，应用了一层厚的金金属。采用Nicolet iS20分光光度计(ThermoScientific,USA)在400～4000cm^-1范围内进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析CS和T-CS的结构。

测量CS或T-CS支架的体积(V1)，然后将其浸泡在MES缓冲液(pH＝6.0)中约2h直至饱和。测定饱和支架并标记为V0。支架体积变化率计算公式如下：

体积变化率＝(V0-V1)/V1×100％

使用Beyotime(上海，中国)的Bicinchoninic Acid(BCA)微量定量试剂盒测定外泌体悬液中蛋白含量采用日本日立HT-7700常规透射电子显微镜(TEM)、配备520nm激光的Particle Metrix 纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)和Western blot分析hUC-MSC来源的外泌体的形态、大小和标志物CD9、CD81的表达。抗CD9(ab223052)和抗CD81(ab155760)的一抗购自Abcam。外泌体储存在-80℃或用于实验。

2、实验结果

1)T-CS的制备及表征

将壳聚糖支架在不同温度(120℃、140℃、160℃、180℃)下进行变性。经鉴定分别为CS-T120、CS-T140、CS-T160、CS-T180。扫描电子显微镜(SEM)观察支架多孔形态；随着变性温度的升高，多孔层状结构在支架内部逐渐融合。在160℃和180℃时，支架的孔隙有变大的趋势，但仍保持多孔，结果如图1所示。支架在酸性环境中的扩展性决定了其结构稳定性和对伤口愈合敷料的适用性。因此，检测各支架在pH 6.0的MES缓冲液中的膨胀情况。如图1B所示，未经处理的CS在酸性溶液中的膨胀率最高，约为原始尺寸的66.5％。CS-T120的膨胀率约为40％，而CS-T160和CS-T180的最小膨胀率约为20％。此外，未经处理的CS在pH 6.0的MES缓冲液中冷冻干燥前恢复为凝胶状态。相比之下，CS-T160和CS-T180在酸性环境中保持多孔海绵超过14天。因此，CS-T160和CS-T180经热变形后，在酸性环境中保持多孔形态，力学性能增强，是理想的皮肤修复生物材料。

通过FTIR检测器对CS、CS-T120、CS-T140、CS-T160和CS-T180进行分析，成功保留了-NH2的峰特性。在所有样品的FTIR光谱中，在3500～3100cm^-1和1640～1550cm^-1处观察到的宽峰是由N-H和O-H拉伸引起的，表明这些支架携带正电荷。由于外泌体磷脂双层膜的磷酸基带负电荷，因此具有正电荷基团的壳聚糖可以在酸性溶液中通过静电吸附有效捕获外泌体、核酸、蛋白质和生物活性物质。

通过测量蛋白浓度间接反映了T-CS在不同时间点捕获外泌体的能力，结果如图1D所示，30min时蛋白浓度约为1000μg/ml,60min时蛋白浓度与30min时无明显差异，提示30min时已达到外泌体吸附极限。结果表明，160～180℃的高温处理可以改善壳聚糖支架的不溶性和在酸性溶液中的低膨胀率。因此，成功构建了酸性环境下可捕获外泌体的T-CS多孔海绵支架。

2)T-CS分离的外泌体的制备及表征

分析并鉴定T-CS吸附的外泌体，透射电子显微镜(TEM)图像显示了Exo(T-CS)的形态，其具有“碟状”外泌体结构(图2A)。图2B显示了外泌体(箭头表示外泌体)洗脱前(左面板)和0.1mM NaHCO3溶液洗脱后(右面板)T-CS的SEM图像。采用NTA法分析Exo(UC)和Exo(T-CS)获得的外泌体的粒径。Exo(UC)和Exo(T-CS)的平均粒径分别为(141.2±54nm)和(131.7±56nm)。两种方法获得的外泌体直径相对相似。然后，通过微生物二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒检测两种方法提取的外泌体的蛋白浓度，评估两种方法的外泌体提取效率。T-CS吸附的外泌体产率约为UC的1.5倍。hUC-MSC来源的外泌体具有特异性表面蛋白标志物CD9和CD81，可被特异性抗体识别。通过蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测T-CS和UC外泌体的蛋白标志物，主要蛋白包括CD9和CD81均存在于Exo(T-CS)和Exo(UC)中(图2C)。细胞外囊泡在室温下的储存是外泌体应用的障碍，如SEM成像所示(图2D)，将外泌体结合T-CS冻干后，可以方便地在室温下运输和储存，而不会损害外泌体的分子完整性。

目前分离外泌体最常用的方法是差速离心法，其次是超速离心法。然而，这种方法被认为是费时和低效的鉴于外泌体的广泛生物学效应，开发高产、高质量的分离方法至关重要。结果表明，T-CS能够吸附并释放MSC来源的外泌体。离心法有利于大粒径颗粒的分离，静电吸附法更适合小粒径颗粒。由于静电吸附和离心吸附的原理不同，T-CS吸附的外泌体体积略小于UC分离的外泌体。用NaHCO3溶液洗脱后，在T-CS表面观察到少量外泌体，证实了其有效释放外泌体的能力(图3)。冻干支架(F-T-CS-E)表明，被T-CS吸附的外泌体可以牢固地附着在T-CS表面，从而有利于保存和运输。由于外泌体在T-CS上的吸附依赖于静电相互作用，因此T-CS可对所有带负电荷的细胞外囊泡(包括EVs、sEVs、凋亡小体等)产生捕获作用。此外，与UC获得的外泌体相比，T-CS吸附的外泌体具有相似的碟状形状、蛋白表面标记、略小的平均直径和更高的蛋白质获取率。

实施例2功能验证

1、实验方法

1)外泌体释放分析

根据之前的研究，使用BCA蛋白检测试剂盒评估T-CS支架的外泌体释放在预定的时间点，将100μg外泌体溶液(约100μl)加入到T-CS支架中，在4℃下进行剧烈振荡，然后在37℃孵育1h。接下来，将T-CS支架(含100μg外泌体)和PBS(pH＝7.4)分别添加到24孔板中Transwell插件的上下室中。采用BCA法检测T-CS支架的外泌体释放情况。在特定的时间点(第3、6、9、12、15、18和21天)，从下室收集PBS并替换为新鲜PBS。测量支架释放的外泌体，并计算释放曲线，以随时间释放的百分比表示。

2)细胞增殖、迁移、小管形成实验和炎症实验

增殖实验中，采用Transwell系统(康宁8μm)检测T-CS来源的外泌体对HUVEC增殖的影响；将培养孔分为3组进行分析：1)Exo(UC)组:100μg/ml的hUC-MSC来源的外泌体；2)Exo(T-CS)组:T-CS-E释放hUC-MSC来源的外泌体100μg/ml；3)PBS组:1％ PBS。将HUVECs置于Transwell系统的下室中，在上室中加入3种干预物质。接种后第1、2、3、4、5天，在培养基中加入CCK-8试剂，37℃孵育1h后分析结果。

细胞迁移通过划痕实验进行评估，1.2×10⁵个HUVECs细胞接种在6孔板中并培养至100％融合。共分为3组:1)Exo(UC)组:100μg/ml的hUC-MSC来源的外泌体；2)Exo(T-CS)组:T-CS-E释放的hUC-MSC来源的外泌体为100μg/ml；3)PBS组:1％ PBS。用改良的黄色移液管尖端在每孔中做3个平行划痕，然后用PBS洗涤3次。测量每一次划痕的宽度作为基线值。将细胞分别置于5％ CO₂培养箱中培养0h、12h、24h。应用ImageJ软件模拟划痕实验，将划痕宽度可视化。

采用Matrigel法测量管腔形成。将250μl还原生长因子Matrigel(康宁，美国)添加到24孔板的每孔中并置于细胞培养箱中30min以使凝胶凝固。首先将HUVECs与外泌体(来自UC或T-CS-E)或PBS共培养48h，然后将含有75,000个重悬HUVECs的约300μl条件培养基接种在预包被的孔中培养6h。在光学显微镜下观察形成的管，并根据厂家说明书进行管数的统计和计算。

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子和抗炎因子水平。RAW264.7细胞培养于24孔板中，分别用PBS、LPS、LPS+Exo(UC)、LPS+Exo(T-CS)处理24h。收集产生的上清液，分别使用IL-1βELISA试剂盒，TNF-αELISA试剂盒和IL-10ELISA试剂盒分析IL-1β，TNF-α和IL-10的水平，制造商来自Neobioscience,quantiyto。

3)体内实验

所有实验动物均获得解放军总医院机构动物保护与使用委员会(IACUC)批准，按照美国国立卫生研究院实验动物保护与使用指南进行。选用体重在18～22g的雄性C57BL/c小鼠(Vital River，中国)。全身麻醉下剃去背部毛发，用脱毛膏去除背部毛发，用直径为7mm的真皮活检打孔器在背部皮肤上制作全层创面。将小鼠分为5组:对照组(创面仅覆盖无菌纱布)、T-CS组(创面覆盖T-CS支架和无菌纱布)、T-CS-E组(创面覆盖T-CS自载外泌体)、T-CS+Exo组(T-CS支架含UC分离的100μg外泌体)、F-T-CS-E组(冻干T-CS-E支架室温保存30d以上)。所有小鼠均饲养在光照/黑暗周期为12小时、温度和湿度稳定(25℃)的房间内。术后第4、7、14天各组小鼠拍照并注射致死剂量戊巴比妥钠处死，评价皮肤修复情况。对于皮肤烧伤模型，麻醉并用碘伏消毒背部后，将直径10mm、重量51g的实心铝棒置于小鼠背部15s，铝棒置于沸水中10min加热至100℃。术后第0、9、17天拍摄创面照片，根据创面愈合情况，于术后第17天处死小鼠。

4)组织学分析

将愈合的皮肤组织样本用10％福尔马林固定，用酒精脱水，并包埋在石蜡中。对厚度为5μm的切片进行苏木精-伊红(H&E)染色、Masson三色染色和免疫组织化学染色。在脱蜡和内源性过氧化物酶失活后，切片进行抗原修复、封闭，并在4℃下与抗CD31(ab181595,Abcam,Cambridge,UK)α-SMA(BM0002)、Ki67(ab15580,Abcam,Cambridge,UK)、IL-1β(26048-1-AP)、TNF-α(17590-1-AP)和IL-10(60269-1-Ig)的抗体孵育过夜。然后在37℃下应用二抗30min，随后与二氨基联苯胺(DAB)反应并使用苏木精进行复染。采用Image ProPlus软件定量CD31的表达，计算血管密度。

5)Western Blot分析炎症因子

伤后第4天取材的组织迅速浸于液氮中，然后在-80℃冷冻直至匀浆。通过将蛋白酶抑制剂Cocktail添加到RIPA蛋白溶解缓冲液中实现均质化，然后使用IKA T10 basicULTRA-TURRAX(德国)均质器将组织样本(100mg)均质化。随后对样品实施1分钟超声处理并且在4℃下以5,000rpm离心10分钟。BCA法检测蛋白浓度。将等量的蛋白样品(50μg)装载于SDS-PAGE凝胶并分离，然后转移到孔径为0.22μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5％的脱脂牛奶封闭膜，用特异性抗体(包括IL-1β(1:2000)，IL-10(1:2000)和GAPDH(1:2000))孵育过夜(均来自Proteintech)。次日，在室温下与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育2小时。采用Image-J软件定量分析IL-1β、IL-10和GAPDH的表达强度。

6)统计分析

所有实验数据采用IBM SPSS Statistics 27程序和GraphPad Prism 7软件进行分析。两组间比较采用独立样本T检验，多组间比较采用单因素方差分析。所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示。p<0.05为差异有统计学意义。

2、实验结果

1)释放T-CS外泌体促进迁移和增殖

采用BCA蛋白检测试剂盒检测碱性溶液中T-CS-E支架释放的外泌体。如图4A所示，在pH＝7.4溶液中释放时间超过21天。pH值的变化允许外泌体在碱性溶液中受控释放，用于后续粒径分析或其他目的。因此，负载外泌体的T-CS支架在碱性环境中表现出对外泌体的缓释作用。外泌体是磷脂双层结构，具有带负电荷的磷酸基。外泌体可以通过改变壳聚糖表面电荷极性来捕获和释放。利用环境中的pH来调节壳聚糖的电荷极性似乎是一种极其简单可行的操作方法。

T-CS支架释放外泌体的生物学效应在内皮细胞的体外研究中得到进一步验证。CCK-8实验显示，第4天和第5天，Exo(T-CS)和Exo(UC)处理组内皮细胞增殖优于对照组，且Exo(T-CS)和Exo(UC)处理组之间无统计学差异，说明T-CS和UC分离的外泌体保持了促进细胞增殖的生物活性(图4B)。此外，细胞迁移实验结果也证实了Exo(T-CS)可以显著增强内皮细胞的迁移能力。如图4C-4D所示，Exo(UC)和Exo(T-CS)处理组在24h表现出更大的细胞迁移，且Exo(UC)和Exo(T-CS)处理组内皮细胞的迁移能力相似。

炎症是导致伤口慢性、难治性愈合的关键因素，因此抗炎药物在促进伤口愈合中起着关键作用。大量研究表明，间充质干细胞来源的外泌体在创面修复过程中具有显著的抗炎作用。评估了通过吸附获得的外泌体的抗炎特性，其中促炎的M1表型被诱导为抗炎的M2表型。由图5可知，通过T-CS吸附获得的外泌体和UC分离得到的外泌体均显著抑制了LPS诱导的TNF-α和IL-1β水平，同时也促进了IL-10水平。两种类型的外泌体差异无统计学意义。基于这些发现，我们认为T-CS吸附的外泌体与通过UC获得的外泌体具有相似的抗炎作用。

2)体内伤口愈合

图6A显示了各组术后第0、4、7、14天的代表性创面面积图像。第4天，各组创面愈合情况无显著差异。然而，在第7天和第14天，T-CS+Exo、T-CS-E和F-T-CS-E处理组的伤口闭合速度比对照组和T-CS处理组快(图6C)。第7天，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组创面肉芽组织较多，表皮舌较长(图6D)。第14天，各组创面中心均可见新生毛囊，表皮闭合完整，与真皮层紧密连接，新生真皮中胶原排列有序。第7天，与对照组和T-CS组相比，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组的表皮舌长度显著更长(图6E)。图6F为不同处理方式下创面新生胶原沉积情况。Masson三色染色显示，与对照组和T-CS组相比，T-CS-E组、T-CS+Exo组和F-T-CS-E组胶原纤维断裂明显减少。

基于热修饰壳聚糖的外泌体吸附支架，利用外泌体在不同pH环境下的电荷差异捕获和释放外泌体，从而实现可控的外泌体释放。结果表明，T-CS-E持续释放外泌体超过21d，可克服外泌体的快速清除，确保其参与创面的整个修复过程。此外，T-CS-E经冻干后可在室温下长期保存，进一步证明了该复合支架的优异性能。

3)T-CS-E体内抗炎作用

炎症反应阻碍伤口愈合过程，干细胞来源的外泌体具有抗炎特性。术后第7天，我们采用免疫组化法检测两种促炎因子(TNF-α、IL-1β)和一种抗炎因子(IL-10)在不同治疗组新生组织中的表达。与对照组比较，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组TNF-α表达量分别为0.55±0.01、0.56±0.01和0.58±0.11。IL-1β相对表达量分别为0.78±0.08、0.73±0.08、0.87±0.03。IL-10的表达分别是对照组的2.8±0.31、2.88±0.29和2.6±0.29倍(图7)。因此，我们认为，在术后第7天，T-CS-E通过抑制TNF-α和IL-1β而促进IL-10的表达，从而发挥促愈合作用。

在术后第4天，我们进一步对创面样本进行Western Blot检测，以评估IL-1β和IL-10的状态。图7显示T-CS-E组促炎因子IL-1β的表达比对照组减少了0.73±0.16倍(p＝0.047)，而IL-10的表达比对照组增加了1.5±0.31倍(p＝0.045)。因此，T-CS-E似乎通过促进IL-10的表达而抑制IL-1β的表达来发挥其抗炎作用，这两者都是外泌体抗炎作用的关键。

4)T-CS-E在体内促进细胞增殖和血管生成

术后第7天检测创面标本中细胞增殖标志物Ki67，如图8所示。各组中，T-CS-E组Ki67阳性细胞数最高，其次为T-CS+Exo组和F-T-CS-E组，显著高于T-CS组和对照组。创面大量细胞增殖间接反映了外泌体治疗后创面肉芽组织快速形成。

新血管形成的过程，称为血管生成，是伤口愈合所必需的，因为它为愈合细胞提供氧气和营养，并支持新形成的肉芽组织。CD31是一种内皮细胞标志物，可用于确定组织血管化程度。在图9中可以明显看到，治疗7d和14d后，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组的血管数量明显高于T-CS组和对照组。第7天，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组MVD密度明显高于其他组。

在第7天对创面样本中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)进行免疫荧光染色，以研究体内血管生成反应的激活。结果如图10所示，对照组和T-CS组的α-SMA阳性染色很少，而T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组的α-SMA阳性表达最强。还对新形成的血管的数量进行了量化，其中T-CS+Exo、T-CS-E和F-T-CS-E支架处理的创面每视野血管数均>40个，明显多于PBS和T-CS支架处理的创面每视野血管数<20个。这些结果表明，T-CS+Exo、T-CS-E和F-T-CS-E支架敷料能有效激活创面愈合过程中的血管生成过程。

5)T-CS-E可在体内加速烧伤皮肤损伤创面愈合

鉴于T-CS-E具有强大的抗炎特性，我们还研究了它对烧伤皮肤损伤愈合的影响，烧伤皮肤损伤以严重炎症为特征。建立小鼠皮肤烧伤模型，不同时间点皮肤创面的代表性照片见图11。我们观察到，9天后，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组的愈合速度最快，到第17天，这些组的伤口几乎完全闭合。因此，我们在术后第17天处死所有小鼠。

通过H&E染色评估烫伤创面形态，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组小鼠创面完全愈合，表皮组织较厚。对照组和T-CS组创面愈合较差，表皮层相对较薄。值得注意的是，烫伤创面被一层表皮完全覆盖，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组肉芽组织厚度均高于对照组和T-CS组。我们还进行了Masson染色，结果显示T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组的胶原沉积比对照组和T-CS组更明显。这些结果表明，T-CS+Exo组、T-CS-E组和F-T-CS-E组对烧伤皮肤创面愈合的有效作用是由于它们能够有效促进皮肤中胶原纤维的分泌和沉积。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种外泌体富集支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架；

优选地，所述制备方法包括如下步骤：

1)壳聚糖溶于弱酸中，混匀，使其充分溶解；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中弱酸包括乙酸、碳酸、亚硝酸、次氯酸；

优选地，所述步骤1)中弱酸为乙酸；

优选地，所述步骤1)中乙酸为1％v/v；

优选地，所述步骤1)中壳聚糖溶液终浓度为1％-3％；

优选地，所述步骤1)中混匀包括搅拌混匀、震荡混匀，所述混匀时间为3h；

优选地，所述步骤3)中干燥包括鼓风干燥；

优选地，所述外泌体包括干细胞外泌体；

优选地，所述外泌体包括间充质干细胞外泌体；

优选地，所述外泌体包括细菌产生的外泌体；

优选地，所述外泌体包括体细胞外泌体。

3.一种根据权利要求1或2所述的制备方法制备的外泌体富集支架。

4.一种富集外泌体的方法，其特征在于，所述方法如下的步骤：

1)将外泌体溶液与MES缓冲液以1:4的比例进行混合，调整pH值，然后添加权利要求3所述的外泌体富集支架，冰上混匀，得到结合到外泌体富集支架上的外泌体；2)使用碱性溶液洗涤释放外泌体富集支架上的外泌体，得到外泌体富集产物；

优选地，所述pH值包括5.8-6.2；

优选地，所述MES缓冲液浓度为100mM；

优选地，所述冰上混匀时间为30min，混匀方式为震荡混匀；

优选地，所述碱性溶液包括磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸铵、磷酸二氢铵、和/或磷酸氢二铵配制的溶液；

优选地，所述碱性溶液为NaHCO₃溶液；

优选地，所述NaHCO₃溶液pH值包括8.0-10.6；

优选地，所述NaHCO₃溶液浓度为10mM；

优选地，所述外泌体溶液还包括初步除杂的步骤；

优选地，所述初步除杂的步骤包括：对外泌体溶液使用过滤器去除死细胞与细胞碎片；

优选地，所述富集外泌体的方法的步骤可不断重复进行。

5.一种外泌体保存运输的方法，其特征在于，所述方法将权利要求4中步骤1)结合到外泌体富集支架上的外泌体整体进行冻干，然后直接室温下运输和/或储存；

优选地，所述冻干状态下的外泌体在室温下运输和/或储存均不损害其分子完整性。

6.一种权利要求4的方法制备的组合物，其特征在于，所述组合物包括结合到外泌体富集支架上的外泌体，和/或收集到的外泌体。

7.权利要求1或2所述的制备方法在制备外泌体富集支架中的应用。

8.权利要求1或2所述的制备方法、权利要求3所述的外泌体富集支架、权利要求4所述的方法、权利要求6所述的组合物在制备产品中的应用；

优选地，所述产品包括创口修复产品、脑损伤治疗产品、组织再生产品、组织重建产品、抑制炎症产品、免疫调节产品、旁分泌调控产品、毛囊再生产品、促进细胞增殖产品、促进细胞迁移产品、促进细胞管状结构形成产品、促进血管化产品。

9.权利要求1或2所述的制备方法、权利要求3所述的外泌体富集支架、权利要求4所述的方法在制备富集外泌体的系统或装置中的应用。

10.一种外泌体富集的系统或装置，其特征在于，所述系统包括权利要求1或2所述的制备方法、权利要求4所述的方法，所述制备方法或方法由计算机存储程序自动执行。