CN115812877A - 玫瑰苹果汁液用于制备改善肌肤状况的组合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玫瑰苹果汁液用于制备改善肌肤状况的组合物的用途。其中，玫瑰苹果汁液是将玫瑰苹果(Malus pumila)以水于95℃浸提1小时所制得。
Description
技术领域
本发明系关于一种玫瑰苹果汁液的用途，特别是涉及一种以玫瑰苹果(Maluspumila)制成的玫瑰苹果汁液，其具有改善肌肤状况的功效。
背景技术
随着时代变迁，人们追求完美的外表，从外在看到的外观轮廓、肤质、肌肤弹性、肌肤纹理姿态到内在的胶原蛋白含量，都有很高的要求。健康的肌肤及其肤色是维持亮丽外表的一大因素，因此，人们越来越注重肌肤的保健及调养，从内到外都维持在最佳的状态。
为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出解决上述问题的机能性食品，以造福有此需求的广大族群。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种以玫瑰苹果(Malus pumila)制成的玫瑰苹果汁液，其具有改善肌肤状况的功能。
在一些实施例中，一种玫瑰苹果汁液用于制备改善肌肤状况的组合物的用途，其中玫瑰苹果汁液是将玫瑰苹果(Malus pumila)以水于95℃浸提1小时所制得。
在一些实施例中，前述改善肌肤状况为减少皱纹、减少肌肤纹理、使肌肤红润有光泽、或其组合。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有至少129.1ppm的绿原酸。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升弹力蛋白合成相关基因表现量的能力。
在一些实施例中，前述弹力蛋白合成相关基因包括FBN1基因。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升肌肤弹力蛋白含量的能力。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升肌肤保湿相关基因表现量的能力。
在一些实施例中，前述肌肤保湿相关基因包括Keratin 14基因、GBA基因及HAS基因。
在一些实施例中，组合物的使用量为至少0.6克/日的玫瑰苹果汁液。
在一些实施例中，组合物的使用量为至少0.3克/日的固态玫瑰苹果粉(以玫瑰苹果汁液干燥所得)。
综上所述，任一实施例的玫瑰苹果汁液是将玫瑰苹果(Malus pumila)以水于95℃浸提1小时所制得，其可用以制备改善肌肤状况的组合物。在一些实施例中，前述改善肌肤状况为减少皱纹、减少肌肤纹理、使肌肤红润有光泽、或其组合。在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升弹力蛋白合成相关基因(例如FBN1基因)的表现量、提升肌肤弹力蛋白含量、提升肌肤保湿相关基因(例如Keratin 14基因、GBA基因及HAS基因等)的表现量等功能，进而有效地改善肌肤状况(例如减少皱纹、减少肌肤纹理、使肌肤红润有光泽等功能)。
附图说明
图1是玫瑰苹果汁液的绿原酸含量数据分析图；
图2是弹力蛋白合成相关基因的相对表现量的数据分析图；
图3是弹力蛋白的相对分泌量的数据分析图；
图4是肌肤保湿相关基因的相对表现量的数据分析图；
图5是受试者在第0周及第4周的皱纹平均检测量的数据分析图；
图6是受试者之一在第0周及第4周的皱纹的分析照片；
图7是受试者在第0周及第4周的肌肤纹理平均检测量的数据分析图；
图8是受试者之一在第0周及第4周的肌肤纹理的分析照片；以及
图9是二位受试者在第0周及第4周的肌肤肤况的照片。
其中，附图标记：
WK0:皱纹
WK4:皱纹
具体实施方式
以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。
本文中使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student’s t-test)进行分析。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
本文中所使用实验数据的数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。
本文中的「wt％」系指重量百分比，而「vol％」系指体积百分比。
术语「汁液」系指通过浸提作用所制备的产物。汁液可以溶于溶剂中的溶液形式呈现，或汁液可为不含或大体上不含溶剂的浓缩物或精华呈现，亦可以将其再干燥后以粉体呈现。
玫瑰苹果(Redlove apple)，学名为Malus pumila，俗称红心苹果，并以其红色果肉、红色果皮和红色花朵而闻名，产地多见于澳洲，如澳洲Lenswood农场。玫瑰苹果是由一种红肉植物的花粉与抗疮植物接种而成，故而并非基因改造的新品种。并且，玫瑰苹果接触空气可长时间不变色，经过烹饪或榨汁色彩仍保持鲜红，其营养价值高于一般苹果。在一些实施例中，玫瑰苹果的同种异名包括Malus niedzwetzkyana Dieck、Malus pumilavar.niedzwetzkyana Schneid、Malus domestica‘Redlove Group’等。在一些实施例中，玫瑰苹果(Redlove apple)的品种为LUBA11706。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液是以将玫瑰苹果(Malus pumila)的红肉果实粉碎过滤，并与浸提溶剂以一定重量比混合后，于特定温度下进行浸提以得到含有固体的初浸提液，接着将初浸提液过滤去除细微固体杂质后，接着将过滤后的初浸提液进行浓缩以得到浓缩液。接着，将浓缩液杀菌，即可得到杀菌后的液态玫瑰苹果汁液。而将浓缩液以喷雾干燥的方式干燥为粉末，则可得固态玫瑰苹果汁液。于此，特定比例的浸提溶剂与待萃物(如，粉碎后的果实)或特定的浸提时间可明显提升浸提效率；且特定的浸提时间可避免浸提时间过长造成汁液中的有效成分可能产生降解。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液是以将玫瑰苹果(Malus pumila)的红肉果实粉碎并进行过滤，以去除过大颗粒后取得玫瑰苹果粉。接着，将水与玫瑰苹果粉以10-30:1-3的重量比混合，并于80℃至90℃浸提45分钟至75分钟所制得。举例来说，玫瑰苹果汁液是将粉碎后的玫瑰苹果的果实粉与水以1:20的重量比混合，并于85℃±5℃下浸提约60分钟所制得。
在一些实施例中，前述玫瑰苹果粉是将玫瑰苹果经粉碎后并以30目数(mesh)的筛网将其过筛，去除过大颗粒后取得玫瑰苹果粉。
在一些实施例中，将玫瑰苹果粉与水以1-3:10-30的重量比混合并于80℃至90℃浸提45分钟至75分钟后以得到初萃液，以400目数的滤网进行过滤，以去除细微固体。并将过滤后的初萃液在50℃-82℃下进行减压浓缩至初萃液的白利糖度值(Degrees Brix)为12.0±0.5时停止浓缩，即得到玫瑰苹果汁液。举例来说，减压浓缩的温度可为60℃±5℃。
在一些实施例中，玫瑰苹果的果实包含果皮、果肉及种子。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有至少129.1ppm的绿原酸(Chlorogenicacid)。并且，相较于其他苹果品种，玫瑰苹果(Malus pumila)与其它白肉苹果的品种(例如Malus domestica Borkh.)相比所含有的绿原酸含量较多。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有改善肌肤状况的功能。举例来说，改善肌肤状况为减少皱纹、减少肌肤纹理、使肌肤红润有光泽、或其组合。换言之，受体服用玫瑰苹果汁液后可有效地减少其皱纹、减少其肌肤纹理、及/或使其肌肤红润有光泽。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升弹力蛋白合成相关基因表现量的能力。举例来说，弹力蛋白合成相关基因包括FBN1基因。FBN1基因编码的蛋白质是微纤维(microfibrils)的主要结构，而微纤维主要提供水晶体悬韧带、弹力蛋白与其他结缔组织连结。换言之，当受体服用玫瑰苹果汁液后，可使受体的肌肤像弹簧一样保有弹性。在一示范例中，玫瑰苹果汁液有效提升1.7倍的FBN1基因表现量。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升肌肤弹力蛋白含量的能力。具体而言，弹力蛋白由皮肤纤维母细胞所合成，其为组成皮肤弹力纤维的重要元素之一，并与皮肤的弹性息息相关。换言之，当受体服用玫瑰苹果汁液后，可提升受体的弹力蛋白含量，进而提升肌肤弹性、减少皮肤塌陷与皱纹显现进而延缓肌肤老化。在一示范例中，玫瑰苹果汁液有效提升肌肤弹力蛋白含量1.93倍。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升肌肤保湿基因表现量的能力。举例来说，弹力蛋白合成相关基因包括Keratin 14基因、GBA基因及HAS基因。具体而言，Keratin(Krt)基因可调控皮肤外层的角蛋白合成，其为皮肤的主要构成物。Glucocerebrosidase(GBA)基因编码的GBA蛋白是合成神经酰胺的酵素，故可调控肌肤合成神经酰胺，以补充皮肤角质层的细胞间隙，并加强肌肤的锁水能力。Hyaluronan synthase(HAS)基因可参与肌肤不同分子量大小玻尿酸的合成。换言之，当受体服用玫瑰苹果汁液后，可有效提升角质细胞保湿相关基因如Keratin(Krt)基因(如，Keratin 14基因)、GBA基因与HAS基因(如，HAS2基因)的表现，以强化皮肤结构、减少细胞间隙，并提供肌肤最佳保湿因子，使肌肤更水嫩。
在一些实施例中，玫瑰苹果汁液可有效地抚平细纹、降低肌肤粗糙度、使肌肤红润有光泽或其组合。具体而言，玫瑰苹果汁液可减少肌肤皱纹并抚平细纹、减少肌肤纹理并降低肌肤粗糙度、及/或使肌肤红润有光泽，进而改善肌肤状况。
在一些实施例中，前述受体为人。
在一些实施例中，前述的任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的玫瑰苹果汁液。
在一些实施例中，前述的医药品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于经肠道地、非经肠道地(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。
在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠道地或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用的载剂的种类与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。
在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用产品。换言之，食用产品包含特定含量的玫瑰苹果汁液。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品或膳食补充品。
在一些实施例中，前述之食用产品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，前述之一般食品可为食用产品本身。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)或调味料。
在一些实施例中，所得的玫瑰苹果汁液可进一步作为食品添加物(foodadditive)，以制得含有玫瑰苹果汁液的食品组合物。于此，能通过现有技术方法于原料制备时添加任一实施例的玫瑰苹果汁液，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的玫瑰苹果汁液，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品(即食品组合物)。
在一些实施例中，前述含有玫瑰苹果汁液的组合物，所含有的玫瑰苹果汁液可为液态或将其干燥后呈现固态。举例来说，固态可为粉末或锭型。
在一些实施例中，组合物的使用量为至少0.6克/日的玫瑰苹果汁液。
在一些实施例中，组合物的使用量为至少0.3克/日的玫瑰苹果粉(以玫瑰苹果汁液干燥所得)。
例1：玫瑰苹果汁液的制备
首先，准备玫瑰苹果(Malus pumila)的红肉果实(产地：澳洲，Lenswood农场)，并以30速搅拌机(30speed blender；品牌：Osterizer)进行粉碎。接着将粉碎后的玫瑰苹果果实以30目数(mesh)的筛网将其过筛以去除过大颗粒，进而可得到玫瑰苹果粉。接着，将水与玫瑰苹果粉以20：1的重量比混合，并于85±5℃浸提60分钟以形成一含有固体的初萃液。
接着，以400目数(mesh)的滤网将含有固体的初萃液进行过滤，以去除初萃液中的细微固体。将过滤后的初萃液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)，在60℃±5℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为12.0±0.5时停止浓缩，以得到液态的玫瑰苹果汁液。
例2：绿原酸含量分析
于此，将例1所制备的液态的玫瑰苹果汁液与品种为Malus domestica Borkh的苹果汁(购自AGRANA Juice；产品为100％苹果果汁)进行绿原酸定量分析。其中，液态的玫瑰苹果汁液作为实验组，而苹果汁则作为控制组且亦为白肉苹果(Malus domestica Borkh)的汁液的代表。
首先，将例1所制备的液态的玫瑰苹果汁液及苹果汁先以0.22μm的PVDF过滤膜(聚偏氟乙烯过滤薄膜；Polyvinylidene fluoride membrane filters,PVDF,Millipore,USA)进行过滤，并分别取10μl的过滤后的玫瑰苹果汁液及市售苹果汁作为实验组和控制组的样品。
以绿原酸(品牌：默克，中国台湾)与去离子水分别配置浓度为10μg/m、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的绿原酸溶液，作为绿原酸标准溶液。
接着，以高效能液相层析仪(High Performance Liquid Chromatography,HPLC,Hitachi,Tokyo,Japan)分析二组的绿原酸含量。将实验组的样品、前述5组不同浓度的绿原酸标准溶液各取10μl注入高效能液相层析仪进行液相层析，并就实验组的样品与绿原酸标准溶液所得波峰的滞留时间及吸收图谱比较鉴别之。于此，以5组不同浓度的绿原酸标准溶液所检测呈线性的正相关的UV波长吸光值制作检量线后，对实验组的绿原酸含量进行定量分析。控制组的实验步骤如前述所示，将对照组的样品、前述5组不同浓度的绿原酸标准溶液各取10μl透过高效能液相层析仪进行分析及计算控制组的绿原酸含量。分析结果如图1所示。
其中，所使用的高效能液相层析仪是Hitachi chromaster 5260系列；所使用的HPLC分析管柱为Mightysil RP-18GP 250(250x4.6 mm,5μm,Kanto,Tokyo,Japan)；所使用的冲提溶剂输送是Hitachi chromaster 5110；所使用的管柱恒温装置Hitachichromaster 5310；所使用的光二极管阵列检测器(Diode Array Detector,DAD)系Hitachichromaster 5430，且所使用的检测波长为190nm-800nm。
并且，所设定的冲提条件为：流速为1mL/min，柱温度为40℃，样品注射量为10μl。于0分钟时A溶液与B溶液的体积比为2:98、于10分钟时A溶液与B溶液的体积比为2:98、于40分钟时A溶液与B溶液的体积比为70:30、于50分钟时A溶液与B溶液的体积比为100:0，且于60分钟时A溶液与B溶液的体积比为100:0。
其中，所使用A溶液为甲醇(methanol,HPLC级；购自默克，中国台湾)并额外添加0.1％的甲酸(Formica acid，ACS级；购自默克，中国台湾)。所使用的B溶液为水并额外添加0.1％的甲酸，且水是取自Millipore 
制水系统(Millipore,USA)的超纯水(18.2MΩ)。
请参阅图1，控制组的绿原酸含量为7.3ppm，而实验组的绿原酸含量为129.1ppm。也就是说，玫瑰苹果汁液所含有的绿原酸含量为市售苹果汁所含有的绿原酸含量的至少17倍，代表玫瑰苹果汁液的绿原酸含量显著地高于一般白肉苹果汁液的绿原酸含量。
例3：弹力蛋白合成相关基因的分析实验
于此，所使用培养基为含有10vol％的胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate,90％；品牌：Gibco)、0.1mM的非必需胺基酸(Non-Essential Amino Acids；品牌：Gibco)及1.5g/L的碳酸氢钠(sodium bicarbonate；品牌：Gibco)的Eagle’s最低限度基本培养基(以下称MEM培养基)。所使用的细胞株为人类肌肤成纤维细胞(CCD-966Sk cell，品牌：
CRL-1881)，以下称CCD-966Sk细胞。所分析的弹力蛋白合成相关基因为Fibrillin-1(FBN1)基因(GeneID:2200)。
将CCD-996SK细胞以每孔1.5×105个的数量接种于每孔含2毫升MEM培养基的6孔培养盘中，并于37℃下培养24小时，并分为实验组及控制组。接着，更换MEM培养基为实验培养基，并培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.125mg/mL的例1所制备的玫瑰苹果汁液的MEM培养基。控制组的实验培养基为单纯的MEM培养基(即不含玫瑰苹果汁液的MEM培养基)。
接着，以RNA萃取套组(RNA extraction kit；品牌Genemark)萃取以各组经实验培养基培养过的CCD-996SK细胞的RNA。每组取1000纳克(ng)所萃取出的RNA为模板，并以cDNA合成试剂(购自Geneaid公司，中国台湾)及
III反转录酶将各组RNA转译成cDNA。接着，使用KAPA CYBR FAST qPCR套组(KAPA Biosystems)及ABI Step One Plus实时PCR系统仪器(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system)配合FBN1-F(SEQID NO:1)引子及FBN1-R(SEQID NO:2)引子(如表1所示)进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以对目标基因进行定量分析，分析结果如图2所示。其中，定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应23秒，60℃反应30秒，总共40个循环；FBN1基因的cDNA PCR大小为166bp。需要特别说明的是，图2中的基因表现是以相对倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是通过学生t-试验来统计分析。在图2中，「**」代表在与控制组比较下其p值小于0.01。
表1
请参阅图2。将控制组的FBN1基因的表现量视为1，代表将未经玫瑰苹果汁液处理的CCD-996SK细胞内的FBN1基因的表现量视为100％。基此，实验组的FBN1基因的表现量为1.7。换言之，经玫瑰苹果汁液处理的CCD-996SK细胞内的FBN1基因提升1.7倍。
基此，玫瑰苹果汁液具有提升FBN1基因的表现量的作用。换言之，服用玫瑰苹果汁液可用以提升受体体内的FBN1基因的表现量，进而生成FBN1蛋白，而FBN1蛋白作为微纤维的主要结构之一，可使肌肤像弹簧一样保有弹性。
例4：弹力蛋白含量检测
于此，所使用的培养基为含有90体积％最低限度基本培养基(Minimum essentialmedium；品牌Gibco)、10体积％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，品牌：Gibco)的细胞培养基(以下称MEM培养基)。所使用的细胞株为人类肌肤成纤维细胞(CCD-966Sk cell，品牌：
CRL-1881)，以下称CCD-966Sk细胞。
将CCD-966Sk细胞以每孔1×105个的数量接种于每孔含2毫升MEM培养基的6孔培养盘中，并于37℃下培养24小时，并分为实验组、对照组及控制组。接着，更换MEM培养基为实验培养基，并将实验组及对照组于37℃下培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25mg/mL的例1所制备的玫瑰苹果汁液的MEM培养基。控制组的实验培养基为单纯MEM培养基(即，不含玫瑰苹果汁液的MEM培养基)。
接着，以弹性蛋白检测套组(FastinTM Elastin Assay kit，品牌：Biocolor)处理各组CCD-966Sk细胞后，并以全光谱光学分析仪(品牌：BioTek，Epoch)检测二组CCD-966Sk细胞的弹力蛋白生成量，如图3所示。其中，将未以实验培养基培养24小时的控制组量测到的弹力蛋白相对分泌量视为100％。需要特别说明的是，各组之间的统计学显著差异是通过学生t-试验(student t-test)来统计分析，且在图3中，「**」代表在与控制组比较下其p值小于0.01。
请参阅图3，相较于控制组，实验组的弹力蛋白相对分泌量为193.0％。换言之，实验组的弹力蛋白相对分泌量相较于控制组明显提高1.93倍，代表以玫瑰苹果汁液处理24小时后的CCD-966Sk细胞可显著分泌出更多的弹力蛋白。由此可知，玫瑰苹果汁液具有促进细胞合成弹力蛋白的功能，进而可减少肌肤塌陷及减少皱纹显现。
基此，具有促进细胞合成弹力蛋白的功能。当受体服用后，能促进受体的肌肤细胞生成弹力蛋白，进而提升肌肤弹性、减少皮肤塌陷与皱纹，延缓肌肤老化。
例5：角质细胞保湿相关基因的分析实验
于此，所使用培养基为角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM(1X)；购自Thermo，产品编号17005042)(以下称细胞培养基)。所使用的细胞株为人原发性表皮角质形成细胞(human primary epidermal keratinocytes HPEK-50，品牌：CELLnTEC)，以下称HPEK-50细胞。所分析的角质细胞保湿相关基因为Keratin 14(Krt14)基因(GeneID:3861)、Glucocerebrosidase(GBA)基因(GeneID:2629)及Hyaluronan synthase 2(HAS2)基因(GeneID:3037)。
将HPEK-50细胞以每孔1.5×105个的数量接种于每孔含2毫升细胞培养基的6孔培养盘中，并于37℃下培养24小时，并分为实验组及控制组。接着，更换细胞培养基为实验培养基，并培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.125mg/mL的例1所制备的玫瑰苹果汁液的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含玫瑰苹果汁液的细胞培养基)。
接着，以RNA萃取套组(RNA extraction kit；品牌Genemark)萃取以各组经实验培养基培养过的HPEK-50细胞的RNA。每组取1000纳克(ng)所萃取出的RNA为模板，并以cDNA合成试剂(购自Geneaid公司，中国台湾)及
III反转录酶将各组RNA转译成cDNA后。接着，使用KAPA CYBR FAST qPCR套组(KAPA Biosystems)及ABI Step One Plus实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system)仪器配合组合引子(如表2所示)进行量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction)，以对目标基因进行定量分析，分析结果如图4所示。其中，定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应23秒，60℃反应30秒，总共40个循环；Krt14基因的cDNA PCR大小为189b、GBA基因的cDNA PCR大小为247bp，且HAS2基因的cDNA PCR大小为216bp。需要特别说明的是，图4中的基因表现是以相对倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是通过学生t-试验来统计分析。
表2
请参阅图4。将控制组各基因的表现量视为1，代表将未经玫瑰苹果汁液处理的HPEK-50细胞内的角质细胞保湿相关基因的表现量视为100％。基此，实验组的Keratin 14基因的表现量为1.62、GBA基因的表现量为1.29、HAS2基因的表现量为1.38。换言之，经玫瑰苹果汁液处理的HPEK-50细胞内的Keratin 14基因提升1.62倍、GBA基因提升1.29倍且HAS2基因提升1.38倍。
基此，玫瑰苹果汁液具有提升Keratin 14基因、GBA基因及HAS2基因的表现量的作用。换言之，服用玫瑰苹果汁液可用以提升受体体内的Keratin 14基因、GBA基因及HAS2基因的表现量，进而强化肌肤结构、减少细胞间隙，并提供肌肤最佳保湿因子，让肌肤保有水分并使肌肤更水嫩。
例6：人体试验
于此，采自身对照方式进行，比较8位受试者服用含有玫瑰苹果汁液的组合物前后的肤况变化。其中，所使用的组合物为每瓶50mL的玫瑰苹果饮，且每瓶玫瑰苹果饮含有0.6克的玫瑰苹果汁液。
测试方式：8位受试者每日服用一瓶玫瑰苹果饮，连续服用4周，并于服用前(第0周)、服用4周后(第4周)进行皮肤皱纹、纹理及整体肤况检测。所使用的检测仪器为全脸仪(VISIA Complexion Analysis System(Canfield scientific,USA))。
皱纹检测：以VISIA Complexion Analysis System(Canfield scientific,USA)的可见光(白光)拍摄高分辨率的肌肤图像，并以内建软件根据皱纹的长度与深度进行分析计算。当所检测得的数值越高，表示受试者的皱纹状况越严重。
肌肤纹理检测：以VISIA Complexion Analysis System(Canfield scientific,USA)的可见光(白光)拍摄高分辨率的肌肤图像，并以内建软件根据皮肤的凹陷与凸起进行粗糙度分析。当所检测得的数值越高，说明受试者的肌肤越粗糙。
需要特别说明的是，第0周及第4周的量测结果之间的统计学显著差异是通过学生t-试验来统计分析。
于改善皱纹方面，8位受试者有6位受试者对于减少皱纹有感，代表改善人数比例达75％。请参阅图5。将8位受试者于第0周量测到的皱纹的平均数值视为100％。相较于第0周，第4周量测到的皱纹的平均数值为85.6％。换言之，在连续服用4周的含有玫瑰苹果汁液的玫瑰苹果饮后，8位受试者的皱纹平均下降14.4％。请参阅图6，8位受试者之一于第0周量测到的眼下皱纹WK0较多，而在连续服用4周的玫瑰苹果饮后，受试者眼下皱纹WK4变少。由此可知，服用含有玫瑰苹果汁液的组合物可减少受体的皱纹，并有效抚平细纹。
于改善肌肤纹理方面，8位受试者有7位受试者对于降低肌肤纹理有感，代表改善人数比例达87.5％。请参阅图7。将8位受试者于第0周量测到的肌肤纹理的平均数值视为100％。相较于第0周，第4周量测到的肌肤纹理的平均数值为86.0％。换言之，在连续服用4周的含有玫瑰苹果汁液的玫瑰苹果饮后，8位受试者的皱纹平均下降14％。请参阅图8，8位受试者之一于第0周量测到的肌肤纹理较多且分布密集，而在连续服用4周的玫瑰苹果饮后，受试者肌肤纹理降低。由此可知，服用含有玫瑰苹果汁液的组合物可降低受体肌肤粗糙度。
请参阅图9，8位受试者之二于第0周及第4周分别以全脸仪检测肌肤肤况。在连续服用4周的玫瑰苹果饮后，二位受试者肌肤肤况变得较为红润有光泽。由此可知，服用含有玫瑰苹果汁液的组合物可有效改善肌肤肤况。
综上所述，根据本发明任一实施例的玫瑰苹果汁液可用以改善肌肤状况(例如减少皱纹、减少肌肤纹理、使肌肤红润有光泽、或其组合)。其中，玫瑰苹果汁液是将玫瑰苹果(Malus pumila)以水于95℃浸提1小时所制得。在一些实施例中，玫瑰苹果汁液具有提升弹力蛋白合成相关基因(例如FBN1基因)的表现量、提升肌肤弹力蛋白含量、提升肌肤保湿相关基因(例如Keratin 14基因、GBA基因及HAS基因等)的表现量等功能，进而有效地改善肌肤状况(例如减少细纹、减少肌肤粗糙度、使肌肤细腻、使肌肤红润有光泽等)。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种玫瑰苹果汁液用于制备改善肌肤状况的组合物的用途，其特征在于，所述玫瑰苹果汁液是将玫瑰苹果(Malus pumila)以水于80℃至90℃浸提45分钟至75分钟所制得。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述玫瑰苹果汁液是将所述玫瑰苹果以所述水于85℃浸提60分钟所制得。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述改善肌肤状况为减少皱纹、减少肌肤纹理、使肌肤红润有光泽、或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述玫瑰苹果汁液具有至少129.1ppm的绿原酸。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述玫瑰苹果汁液具有提升弹力蛋白合成相关基因表现量的能力。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述弹力蛋白合成相关基因包括FBN1基因。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述玫瑰苹果汁液具有提升肌肤弹力蛋白含量的能力。
8.如权利要求1所述的用途，其中所述玫瑰苹果汁液具有提升肌肤保湿相关基因表现量的能力。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述肌肤保湿相关基因包括Keratin14基因、GBA基因及HAS基因。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物的使用量为至少0.6克/日的所述玫瑰苹果汁液。
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