JP6283763B2 - 植物発酵ペーストの製造方法 - Google Patents
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Description
前記植物エキスを第一の発酵温度で発酵させて第一の植物発酵液を調製する第一の発酵工程と、
前記第一の植物発酵液を第二の発酵温度で発酵させて第二の植物発酵液を調製する第二の発酵工程と、
前記第二の植物発酵液中の水分含有量を低減させる水分蒸発工程と、
をこの順で含み、
前記植物原材料が、
にんにく、たまねぎ、茶葉、トマト、メロンおよびグレープフルーツからなる群より選択される少なくとも4種以上と、
ブロッコリー、ジャガイモ、キャベツ、ショウガ、カリフラワー、なす、緑ピーマン、レモン、キュウリ、大豆モヤシ、ローズマリー、バジル、オレガノおよびセージからなる群より選択される少なくとも3種以上と、
バナナ、レンコン、しどけ、ホウレンソウ、ニンジン、ニラ、アスパラガス、シイタケ、ゴボウ、こごみ、マイタケ、ミョウガおよび緑豆モヤシからなる群より選択される少なくとも3種以上と、
を含み、
前記植物エキスを抽出する工程、前記第一の発酵工程、前記第二の発酵工程および前記水分蒸発工程を実施する環境温度は、常時、50℃以下となるように保持されており、
前記植物エキスを抽出する抽出温度が、4℃以上30℃以下であり、
前記第一の発酵温度が10℃以上50℃以下であり、
前記第二の発酵温度が、前記第一の発酵温度よりも低い温度であり、
前記第一の発酵工程の前段階において、前記植物エキス中に乳酸菌または酵母を混入させ、
前記第二の発酵工程および前記水分蒸発工程が、抗菌作用を有する第二の容器内で行われる、植物発酵ペーストの製造方法が提供される。
本発明に係る植物発酵ペースト(以下、本ペーストともいう。)は、植物原材料に由来する発酵エキスを含むものである。また、本発明において上記発酵エキスは、にんにく、たまねぎ、茶葉、トマト、メロンおよびグレープフルーツからなる群より選択される少なくとも4種以上と、ブロッコリー、ジャガイモ、キャベツ、ショウガ、カリフラワー、なす、緑ピーマン、レモン、キュウリ、大豆モヤシ、ローズマリー、バジル、オレガノおよびセージからなる群より選択される少なくとも3種以上と、バナナ、レンコン、しどけ、ホウレンソウ、ニンジン、ニラ、アスパラガス、シイタケ、ゴボウ、こごみ、マイタケ、ミョウガおよび緑豆モヤシからなる群より選択される少なくとも3種以上と、を含む植物原材料に由来するものである。
一方で、人体の機能を正常な状態に保持する目的や、人体の機能に異変が生じることを予防する目的で摂取されることが多い健康食品中に含まれている植物エキスの多くは、各種植物原材料に由来する食物酵素をバランスよく含有させる観点において調製されたものであった。すなわち、従来の植物エキスの多くは、各種植物原材料に由来する食物酵素をバランスよく含有させる観点で選択された複数種の植物原材料を用いて調製されたものであった。
こうした事情に鑑みて、本発明者は、活性酸素種による酸化ストレスが人体の機能に及ぼす影響を軽減させるという観点から、従来の植物エキスが各種植物原材料に由来する抗酸化成分をバランスよく十分に含んでいない可能性があることを見出した。
くわえて、本発明者は、摂取の簡便性という観点から、従来の健康食品の形態についても改善の余地があることを見出した。
第1の群は、にんにく、たまねぎ、茶葉、トマト、メロンおよびグレープフルーツからなる4種以上。
第2の群は、ブロッコリー、ジャガイモ、キャベツ、ショウガ、カリフラワー、なす、緑ピーマン、レモン、キュウリ、大豆モヤシ、ローズマリー、バジル、オレガノおよびセージからなる3種以上。
第3の群は、バナナ、レンコン、しどけ、ホウレンソウ、ニンジン、ニラ、アスパラガス、シイタケ、ゴボウ、こごみ、マイタケ、ミョウガおよび緑豆モヤシからなる3種以上。
上記第1の群は、非特許文献2に記載されているデザイナーズフーズピラミッド中に挙げられている37種に含まれており、かつXYZ系微弱発光法による活性酸素消去能について報告されている非特許文献3中の図2に活性酸素の消去物質として例示されている39種に含まれていることを基準としている。
上記第2の群は、非特許文献2に記載されているデザイナーズフーズピラミッド中に挙げられている37種に含まれているものの、XYZ系微弱発光法による活性酸素消去能について報告されている非特許文献3中の図2に活性酸素の消去物質として例示されている39種には含まれていないことを基準としている。
上記第3の群は、非特許文献2に記載されているデザイナーズフーズピラミッド中に挙げられている37種には含まれていないものの、XYZ系微弱発光法による活性酸素消去能について報告されている非特許文献3中の図2に活性酸素の消去物質として例示されている39種に含まれていることを基準としている。
そして、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンA、カロテノイド、アントシアニン、カテキンを含むポリフェノール等の抗酸化成分については、一般に、50℃程度の熱履歴が加わった場合においても変性しにくい物質であるとされている。この点を踏まえると、本ペーストは、使用した植物原材料に由来する各種抗酸化成分をバランスよく含んだものであるともいえる。
本発明に係る植物発酵ペーストの製造方法(以下、本ペーストの製造方法ともいう。)は、以下に挙げる4つの工程を、この順で含むものである。
第1の工程は、非加熱状態にある植物原材料を、糖とともに第一の容器内に導入し、上記植物原材料から植物エキスを抽出する工程である。
第2の工程は、上記第1の工程により得られた植物エキスを第一の発酵温度で発酵させて第一の植物発酵液を調製する第一の発酵工程である。
第3の工程は、上記第2の工程により得られた第一の植物発酵液を第二の発酵温度で発酵させて第二の植物発酵液を調製する第二の発酵工程である。
第4の工程は、上記第3の工程により得られた第二の植物発酵液中の水分含有量を低減させる水分蒸発工程である。
そして、本ペーストの製造方法において、上記植物エキスを抽出する工程、上記第一の発酵工程、上記第二の発酵工程および上記水分蒸発工程における処理温度は、常時、50℃以下となるように保持する必要がある。また、本ペーストの製造方法における第一の発酵温度は10℃以上50℃以下であり、第二の発酵温度は上記第一の発酵温度よりも低い温度である。さらに、本ペーストの製造方法においては、上記第一の発酵工程の前段階で、上記植物エキス中に乳酸菌または酵母を混入させている。
また、本ペーストの製造方法において使用する植物原材料は、下記3つの群からそれぞれ選択された合計10種以上の食材を含むことを前提としている。
第1の群は、にんにく、たまねぎ、茶葉、トマト、メロンおよびグレープフルーツからなる4種以上。
第2の群は、ブロッコリー、ジャガイモ、キャベツ、ショウガ、カリフラワー、なす、ピーマン、レモン、キュウリ、大豆モヤシ、ローズマリー、バジル、オレガノおよびセージからなる3種以上。
第3の群は、バナナ、レンコン、しどけ、ホウレンソウ、ニンジン、ニラ、アスパラガス、シイタケ、ゴボウ、こごみ、マイタケ、ミョウガおよび緑豆モヤシからなる3種以上。
こうすることで、本ペーストの製造方法によれば、抗酸化力の高い植物原材料に由来する発酵エキスをバランス良く含むペースト状の植物発酵食品を得ることができる。
本ペーストの製造方法に係る植物エキスを抽出する工程(以下、本抽出工程とも示す。)においては、非加熱状態にある植物原材料を、糖とともに第一の容器内に導入し、上記植物原材料から植物エキスを抽出する。特に、本ペーストの製造方法においては、非加熱状態にある植物原材料を使用することが重要である。こうすることで、仕込み段階において植物原材料中に含まれている各種成分が熱変性してしまうことを防ぐことができる。なお、本ペーストの製造方法における「非加熱状態にある植物原材料」とは、50℃より高い温度となるような加熱処理を施していない植物原材料のことを指す。
そして、本ペーストの製造方法に使用する植物原材料の形態は、非加熱状態にあるものであれば、収穫直後の状態、すなわち生の状態であっても、収穫直後の植物原材料を切り刻んだ状態であってもよいし、乾燥状態であってもよい。
第1の群は、にんにく、たまねぎ、茶葉、トマト、メロンおよびグレープフルーツからなる4種以上。
第2の群は、ブロッコリー、ジャガイモ、キャベツ、ショウガ、カリフラワー、なす、ピーマン、レモン、キュウリ、大豆モヤシ、ローズマリー、バジル、オレガノおよびセージからなる3種以上。
第3の群は、バナナ、レンコン、しどけ、ホウレンソウ、ニンジン、ニラ、アスパラガス、シイタケ、ゴボウ、こごみ、マイタケ、ミョウガおよび緑豆モヤシからなる3種以上。
本ペーストの製造方法に係る第一の発酵工程においては、植物エキスを第一の発酵温度で発酵させて第一の植物発酵液を調製する。こうすることで、系内に存在している植物原材料に由来する抗酸化成分量を増大させることができる。ここで、第一の発酵工程においては、系内(植物エキス)に対して、別途、乳酸菌または酵母を添加しないことが好ましい。こうすることで、菌体あたりの発酵量を増大させつつ、自然界の流れに沿った本来の発酵処理を実施することができる。また、第一の発酵工程において系内(植物エキス)に乳酸菌または酵母を添加しなかった場合、植物原材料に由来しない成分が系外から系内に混入することを防ぐことができる。
他方、本ペーストの製造コストを削減する観点においては、第一の発酵工程を実施している最中に、系内(植物エキス)に対して、別途、乳酸菌または酵母を添加することが好ましい。こうすることで、単位時間当たりの発酵量を増大させること、すなわち、系全体の発酵速度を促進させることができるため、本ペーストの生産効率を向上させることができる。
また、第一の発酵処理については、たとえば、植物エキスの抽出に使用したヒノキ樽以外の容器であればどのような容器を使用しても問題ない。
本ペーストの製造方法における第二の発酵工程においては、上述した第一の発酵工程により得られた第一の植物発酵液を、第一の発酵温度よりも低い温度の第二の発酵温度で発酵させて第二の植物発酵液を調製する。こうすることで、系内に存在している乳酸菌または酵母とは異なる種類の雑菌の増殖を最小限に抑えた状態で、乳酸菌または酵母の細胞内に存在する酵素による影響を最大限に活かすこと可能となる。これにより、系内に存在している植物原材料に由来する抗酸化成分量を飛躍的に増大させることができる。
以上のように、第二の発酵工程においては、系内に存在している乳酸菌または酵母とは異なる種類の雑菌の増殖を最小限に抑えた状態で発酵処理を施すことが重要である。そのため、第二の発酵処理については、たとえば、ステンレス製等の抗菌作用を有する容器(第二の容器)を用いて行うことが好ましい。こうすることで、系内に存在している乳酸菌または酵母とは異なる種類の雑菌の増殖をより一層高度に抑制することが可能となる。
他方、本ペーストの製造コストを削減する観点においては、第二の発酵工程を実施している最中に、系内(第一の植物発酵液)に対して、別途、乳酸菌または酵母を添加することが好ましい。こうすることで、単位時間当たりの発酵量を増大させること、すなわち、系全体の発酵速度を促進させることができるため、本ペーストの生産効率を向上させることができる。
本ペーストの製造方法に係る水分蒸発工程においては、上述した第二の発酵工程により得られた第二の植物発酵液中の水分含有量を低減させる。こうすることで、第二の植物発酵液を濃縮することが可能であり、結果として、かかる第二の植物発酵液中に含まれている各種成分の濃度を向上させることができる。
本ペーストの製造方法においては、上記水分蒸発工程を実施した後、かかる工程により濃縮された第二の植物発酵液を、食用粉体と混合する工程を含む。こうすることで、第二の植物発酵液の粘性を向上させることができる。かかる食用粉体は、人間が食すことができる粉末であれば特に限定されず、公知のものを使用することができる。中でも、食用粉体は、第二の植物発酵液中に残存している水分を吸収させる観点から、多孔質の粉体、すなわち多孔質体であることが好ましい。そして、上記多孔質体としては、最終的に得られる本ペーストに消化促進効果や、腸内環境改善効果等の種々の体質改善乃至健康維持効果を付与する観点から、粉末状であり、かつ多孔質体である難消化性デキストリンを好適に使用することができる。
前記植物原材料が、
にんにく、たまねぎ、茶葉、トマト、メロンおよびグレープフルーツからなる群より選択される少なくとも4種以上と、
ブロッコリー、ジャガイモ、キャベツ、ショウガ、カリフラワー、なす、緑ピーマン、レモン、キュウリ、大豆モヤシ、ローズマリー、バジル、オレガノおよびセージからなる群より選択される少なくとも3種以上と、
バナナ、レンコン、しどけ、ホウレンソウ、ニンジン、ニラ、アスパラガス、シイタケ、ゴボウ、こごみ、マイタケ、ミョウガおよび緑豆モヤシからなる群より選択される少なくとも3種以上と、を含む、組成物。
2.当該組成物が、表皮細胞における酸化および紫外線ストレスに対する抗酸化作用を有する抗酸化組成物である、1.に記載の組成物。
3.当該組成物が、老化防止作用を有する老化防止用組成物である、1.に記載の組成物。
4.当該組成物が、活性酸素による酸化ストレスを低減する作用を有する酸化ストレス低減用組成物である、1.に記載の組成物。
5.当該組成物が、化粧のノリ、肌の弾力、肌の潤い、肌のべとつき、肌のきめ、はだのくすみ、肌のたるみ、顔のクマおよびくすみから選択される少なくとも1つの症状を改善する作用を有する肌質改善作用を有する肌質改善用組成物である、1.に記載の組成物。
6.当該組成物が、身体の代謝、体が疲れやすい、寝てもつかれがとれない、むくみやすい、倦怠感がある、体調不良に陥りやすい、口内炎ができやすい、または頭がすっきりしない等の症状を改善する作用を有する体質改善用組成物である、1.に記載の組成物。
7.当該組成物が、眼下のシワおよび目じりのシワを含む顔のシワの低減する効果を有するシワ改善用組成物である、1.に記載の組成物。
8.当該組成物が、肌の色素沈着を改善する作用を有する色素沈着改善用組成物である、1.に記載の組成物。
9.当該組成物が、肌のキメを改善する作用を有する肌キメ改善用組成物である、1.に記載の組成物。
10.当該組成物が、ペースト、粉末、液体、顆粒、タブレット、またはカプセルの形態を有する、1.〜9.のいずれかに記載の組成物。
まず、酵母および乳酸菌が棲みついたヒノキ樽に、以下に示す非加熱状態にある植物原材料125種と、粗糖とを充填した後、25℃(環境温度)の条件で15日間静置した。その後、ヒノキ樽から植物原材料を取り出し、樽内に残存している溶液を植物エキスとした。
また、実施例1の植物発酵ペーストは、植物原材料が発現する抗酸化力に着目し、適切に選択された合計126種の植物原材料を用いて作製したものである。そして、一般に、植物原材料に由来する抗酸化成分は、熱などによる影響を受けにくい成分であることを踏まえると、実施例1の植物発酵ペーストは、合計126種の植物原材料に由来する抗酸化成分をバランスよく含んだものであるといえる。そのため、実施例1の植物発酵ペーストは、従来品と比べて、結果として、抗酸化力の高い植物発酵食品であると考えられる。
・マグネシウム:19.2mg/100g(ICP発光分析法により定量)
・鉄:0.51mg/100g(ICP発光分析法により定量)
・カリウム:323mg/100g(ICP発光分析法により定量)
・カルシウム:17.9mg/100g(原子吸光光度法により定量)
ステンレス製の容器中の第二の植物発酵液を、室温(環境温度)が30℃となるように制御された部屋内で1か月間保存することなく、該第二の植物発酵液と、プルーンエキスと、多孔質体である難消化性デキストリン粉末とを混合した点以外は、実施例と同様の方法で、比較例1の植物発酵ペーストを作製した。かかる比較例1の植物発酵ペーストは、水分量が多いために、十分にペースト化されていないことが確認された。そのため、比較例1の植物発酵ペーストは、ペースト品として市場に流通させるには実用上問題があることが確認された。また、比較例1の植物発酵ペーストは、上述したように、水分量が多いため、呈味の嗜好性という点においても改善の余地があるものであった。
第一の植物発酵液を調製した温度と同一温度、すなわち、40℃(環境温度)の温度条件で第二の植物発酵液を調製した点以外は、実施例と同様の方法で、比較例2の植物発酵ペーストを作製した。かかる比較例2の植物発酵ペーストは、使用した植物原材料本来の呈味とは異なる雑味が感じられるものであった。そのため、比較例2の植物発酵ペーストは、呈味の嗜好性という点において、改善の余地を有するものであった。
非加熱状態にある植物原材料125種と、粗糖とを充填したヒノキ樽を40℃(環境温度)で15日間静置することにより植物エキスを調製した点、すなわち、25℃(環境温度)ではなく、第一の植物発酵液を調製した温度と同一の40℃(環境温度)で植物エキスを調製した点以外は、実施例と同様の方法で、比較例3の植物発酵ペーストを作製した。かかる比較例3の植物発酵ペーストは、使用した植物原材料本来の呈味とは異なる雑味が感じられるものであった。そのため、比較例3の植物発酵ペーストは、呈味の嗜好性という点において、改善の余地を有するものであった。
得られた第一の植物発酵液をステンレス製の容器に移すことなく、上記第一の植物発酵液を撹拌しながら、25℃(環境温度)の条件で1週間保存し、第二の植物発酵液を調製した点以外は、実施例と同様の方法で、比較例4の植物発酵ペーストを作製した。かかる比較例4の植物発酵ペーストは、使用した植物原材料本来の呈味とは異なる雑味が感じられるものであった。そのため、比較例4の植物発酵ペーストは、呈味の嗜好性という点において、改善の余地を有するものであった。
ステンレス製の容器中の第二の植物発酵液を、室温(環境温度)が30℃となるように制御された部屋内で1か月間保存することなく、該第二の植物発酵液を多孔質体である難消化性デキストリン粉末に吸着させた点以外は、実施例と同様の方法で、ペースト状ではなく、粉末状である参考例の植物発酵粉末を作製した。かかる参考例の植物発酵粉末中の各種栄養成分含有量は、以下の通りであった。
・マグネシウム:1.7mg/100g(ICP発光分析法により定量)
・鉄:未検出(ICP発光分析法により定量、定量下限値:0.1mg/mg)
・カリウム:5.7mg/100g(ICP発光分析法により定量)
・カルシウム:9.3mg/100g(原子吸光光度法により定量)
本実施例では、実施例1の植物発酵ペーストの抗酸化能を検証するとともに、表皮細胞を用いて酸化ストレスに対する効果を調査した。また、活性酸素を多量に産生するミトコンドリアに対しても植物発酵ペーストが及ぼす影響を調査した。
(1.細胞毒性試験)
細胞毒性試験では次に記述した細胞および試薬を用いた。
正常ヒト表皮細胞[クラボウ、NHEK(AD)、Cat.No.KK−4109]、ラット褐色脂肪細胞(コスモバイオ、褐色脂肪細胞培養キットF−8)、骨格筋細胞(L6)(ATCC、Cat.No.CRL−1458)、ヒト単球系細胞THP−1(ATCC、ATCC TIB−202)、HuMedia−KG2(クラボウ、KK−2150S)、褐色脂肪細胞培養キット付属専用培地(分化誘導培地、細胞維持培地、増殖用培地)、MEM培地(nacalai tesque,Cat.No.21442−25)、FETAL BOVINE SERUM(FBS)(Cell Culture Bioscience, Cat.No.171012)、RPMI−1640培地(SIGMA,R8758)、FBS(Invitrogen,Cat.No.10091−148)、生細胞数測定試薬SF(nacalai tesque,Cat.No.07553)。
抗酸化試験では次に記述した試薬を用いた。
SOD Assay Kit−WST (同仁化学研究所、Cat.No.S311)、OxiSelect Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity(HORAC)、Activity assay(Cell Biolabs, Inc.,STA−346)、OxiSelect Catalase Activity Assay Kit、Colorimetric(Cell Biolabs,Inc.,STA−341)、2,2−Diphenyl−1−picrylhydrazyl(DPPH)(SIGMA,Cat.No.D9132−1G)、L−Ascorbic acid Phosphate Magnesium Salt n−Hydrate(Wako,Cat.No.013−19641)、Ethanol(99.5%)(Wako,Cat.No.057−00456)、Acetic acid(Wako.Cat.No.012−00245)、Sodium Acetate Trihydrate (Wako,Cat.No.198−01055)。
SOD様活性値=[(blank1−blank3)−(sample−blank2)]/(blank1−blank3)×100
(3.1. 細胞および試薬)
ミトコンドリア賦活試験では次に記述した細胞および試薬を用いた。
ラット褐色脂肪細胞 (コスモバイオ、キットF−8)、骨格筋細胞(L6)(ATCC,Cat.No.CRL−1458)、褐色脂肪細胞培養キット付属専用培地(分化誘導培地、細胞維持培地、増殖用培地)、MEM培地(nacalai tesque, Cat.No. 21442−25)、FETAL BOVINE SERUM(FBS)(Cell Culture Bioscience,Cat.No.171012)、Penicillin−streptomycin solution(nacalai tesque,Cat.No.26253−84)、0.25% trypsin−EDTA solution(nacalai tesque,Cat.No.32777−44)、Albumin,from Bovine Serum, Fatty Acid Free (Wako,Cat.No.011−15144)、生細胞数測定試薬SF(nacalai tesque,Cat.No. 07553−44)、Dulbecco's PBS (日水製薬株式会社、Code No.05913)、MitoTracker Mitochondrion−Selective Probes(Invitrogen,M7512)、Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide(SIGMA,M5655−1G)、Sodium Dodecyl sulfate(SDS)(Wako,Cat.No.191−07145)、2mol/L Hydrochloric acid(SIGMA, Cat.No.13−1690)、Hoechist 33342 solution(DOJINDO,Cat.No.346−07951)、Resveratrol(SIGMA,Cat.No.R5010−100MG)。
酸化・紫外線ストレス試験では次に記述した細胞および試薬を用いた。
正常ヒト表皮細胞[クラボウ、NHEK(AD),Cat.No.KK−4109]、HuMedia−KG2(クラボウ、KK−2150S)、Hyaluronic acid sodium salt from Streptococcus equi(SIGMA,53747−1G)、2.5g/l−Trypsin/1mmol/l−EDTA Solution(nacalai tesque、Cat.No.32777−44)、生細胞数測定試薬SF(nacalai tesque,Cat. No.07553−44)、L−Ascorbic acid phosphate magnesium salt n−hydrate(ビタミンC)(Wako,013−19641)、Hydrogen Peroxide(Wako,Cat.No.081−04215)。
植物発酵ペーストを1%(10mg/mL)となるように表皮細胞専用培地に溶解し、十分撹拌した後に濾過滅菌し、使用した。なお、各試験区の陽性対照には0.1mMアスコルビン酸を用いた。
成長因子発現解析試験では次に記述した細胞および試薬を用いた。
正常ヒト表皮細胞[クラボウ、NHEK(AD),Cat.No.KK−4109]、ヒト単球系細胞THP−1(ATCC社製、ATCC TIB−202)、HuMedia−KG2(クラボウ、KK−2150S)、RPMI−1640培地(SIGMA,R8758)、FBS(Invitrogen,Cat.No.10091−148)、Penicillin−streptmycin solution(nacalai tesque,Cat.No.26253−84)、生細胞数測定試薬SF(nacalai tesque,Cat.No.07553)、Phorbol 12−Myristate 13−Acetate(Wako,Cat.No.162−23591)、FastLane Cell cDNA for use in real−time RT−PCR(QIAGEN,Cat.No.215011)、SYBER Premix Ex Taq 5mL(Takara,RR041L)、Oligo nucleotides(primers)(FASMAC)。
各値にて、平均値および標準誤差を算出した。また、比較試験区間では有意差検定を実施した。検定はStudent t検定として行いP<0.05を有意差ありと判断した。
(1.細胞毒性試験)
各細胞種の植物発酵ペースト存在下での生細胞数の結果を図1に示す。正常ヒト表皮細胞および褐色脂肪細胞、マクロファージは10%濃度において細胞毒性を示した。骨格筋細胞1%以上の濃度において毒性を示した。なお図中における「植物発酵ペーストAO」は、実施例1で作製した植物発酵ペーストを指す。
抗過酸化水素試験(カタラーゼ様活性試験)では、事前に濃度検討試験を実施し植物発酵ペーストの最高濃度を10%とした。その結果、10%濃度において約14%の過酸化水素阻害を示した。陽性対照であるカタラーゼは25U/mLの濃度において約50%の過酸化水素阻害を示した(図2A)。
褐色脂肪細胞では植物発酵ペーストの3日間処理において1%植物発酵ペースト処理でミトコンドリア量(MitoTracker染色測定)およびミトコンドリア活性(MTT測定)(いずれも生細胞数において補正した場合)に有意に増大していた(図3A)。一方、陽性対照であるレスベラトロールは培養3日間において、いずれにおいても有意な増加は認められなかった。さらに植物発酵ペーストを7日間処理した場合、植物発酵ペーストのミトコンドリア量および活性に及ぼす促進効果は顕著であった(図3B)。処理培養期間が3日間から7日間にかけて未処理細胞においてミトコンドリア量は経時的な減少はあまり認められなかった(図3A)。しかし、ミトコンドリア活性では未処理細胞において顕著な経時的減少が認められた(図3B)。これは時間経過とともにミトコンドリア活性が減少する「劣化」と考えられる。植物発酵ペースト処理細胞において、この経時的ミトコンドリア劣化が顕著に抑制されていた(図3B)。
酸化ストレス試験を実施するにあたり、至適過酸化水素濃度を決定した。その結果、無刺激の約50%の生細胞数を示す0.25mM 過酸化水素濃度が適していると判断した(データ表示なし)。紫外線ストレス試験を実施するにあたり、至適紫外線ストレス強度を検証した。その結果、UV−Bを52秒間(83.2mJ/cm2)照射することで約50%の細胞障害率を示した(データ表示なし)。
表皮細胞に植物発酵ペーストを含む培地を処理し、処理後2、10、24時間後の細胞からトータルRNAを抽出しFGF−1、FGF−2遺伝子発現解析を実施した。FGF−1遺伝子発現では培地置換後2時間でFGF−1の発現が上昇していたが(図6A)、植物発酵ペースト含有培地でも同じ傾向にあったことから新鮮な培地への置換により発現が上昇していると思われる。FGF−1遺伝子発現においては植物発酵ペーストによる発現誘導は認められてなかった。FGF−2遺伝子発現において培地置換後2時間、10時間において発現上昇を示し、植物発酵ペースト含有培地において置換2時間後に未処理細胞と比較して顕著に発現の上昇を示した(図6B)。一方、置換10、24時間後において未処理細胞と発現差異はなくなっていた。これらの結果から植物発酵ペーストにFGF−2発現促進作用があることが考えられる。
活性酸素とは、酸素分子が紫外線や電子供与などの外部刺激により活性化した状態を指す。一般に細胞内では酸素を大量に消費するミトコンドリアや代謝過程で生じる。まず、酸素が紫外線などで励起した状態が一重酸素であり、これに電子が供与されるとスーパーオキシドアニオンラジカルとなる。スーパーオキシドアニオンラジカルが2分子重合すると過酸化水素となり、過酸化水素が均等分裂した状態がヒドロキシラジカルとなる。一重酸素およびスーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカルの分子種が活性酸素と呼ばれる一方で、他の分子種がこれらの活性酸素により電子(ラジカル)転移を受けて活性化した分子をフリーラジカルと呼ぶ。本研究では、植物発酵ペーストによるスーパーオキシドラジカルおよび過酸化水素、ヒドロキシラジカル、フリーラジカルの消去能を評価した結果、いずれの活性酸素ならびにフリーラジカルに対しても消去能を示した。なかでも、スーパーオキシドラジカルおよびヒドロキシラジカル、フリーラジカル消去能において優れた効果を示した。しかし、過酸化水素については消去能を示すものの、その効果は強力ではないと考えられる。
植物発酵ペーストの抗酸化能によりミトコンドリアの賦活性がもたらされた。また、ミトコンドリア賦活によって細胞機能が促進し、皮膚におけるFGFやEGFの産生促進がもたらされ、肌機能の維持または向上に繋がることが示唆された。
本実施例では、日ごろ疲れやすいと自覚している健常な日本人成人女性を対象に、植物発酵物を含む植物発酵ペーストの抗酸化作用および肌の状態に与える影響を検証した。
(1.研究デザイン)
本研究は、非盲検試験で実施した。試験実施計画書は、医療法人社団盛心会タカラクリニック(東京都品川区)の倫理委員会にて2016年6月13日に承認(1606−1605−YK01−02−TC)を得た後、UMIN臨床試験登録システム(UMIN−CTR)に登録した(UMIN000022761)。また、ヘルシンキ宣言(2013)および人を対象とする医学系研究に関する倫理指針の趣旨に則り、医学倫理に十分配慮し実施した。試験参加者の募集は、株式会社オルトメディコ(東京都文京区)が運営するモニター募集サイトGO106(http://monitor−touroku.jp/)で2016年6月18日から8月13日まで行い、試験参加を希望する者に、試験内容を十分に説明した上でインフォームドコンセントを書面にて取得した。本研究の実施期間は、2016年8月15日から11月19日であった。
本研究は、登録基準として健常な日本人成人女性で、日ごろ疲れやすいと自覚している者を対象とした。また、試験参加にあたり次の条件を除外基準とした。(a)悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞の治療の既往歴がある者、(b)疾患等による除外(心房細動、肝障害、腎障害、脳血管障害、リウマチ、糖尿病、脂質異常症、高血圧、過敏性腸症候群、その他の慢性疾患)、(c)医薬品(漢方薬を含む)・サプリメント・特定保健用食品、機能性表示食品を常用している者、(d)アレルギー(大豆、りんご、バナナ、もも、キウイフルーツ、やまいも、ごま、医薬品・試験食品関連食品)がある者、(e)妊娠中、授乳中、あるいは試験期間中に妊娠する意思のある者、(f)3ヶ月以内に他の臨床試験に参加した者、(g)その他、試験責任医師が本試験の対象として不適切と判断した者。
試験食品は1包あたり5gの植物発酵ペーストであり、含有成分として植物発酵液が含まれる。試験参加者には、上記の植物発酵ペーストを朝食前に1日1包摂取させた。介入期間は8週間であった。
主要アウトカム:酸化ストレスマーカー(尿中8−OHdG、尿中PRL、尿中HEL、血中PAO)
摂取前、摂取8週間後の検査日に、尿中8−OHdGと尿中PRL、尿中HEL、血中PAOを測定した。採尿および血液採集は広尾皮フ科クリニック(東京都渋谷区)において行われた。尿中8−OHdGと血中PAOの検査は日研ザイル株式会社(静岡県袋井市)に委託され、全自動マイクロプレートEIA分析装置AP−960および臨床化学自動分析装置7020(協和メデックス株式会社、東京都中央区)を用いて行われた。尿中PRLと尿中HELの検査は株式会社ヘルスケアシステムズ(愛知県名古屋市)に委託され、化学発光検出解析装置Lumi Vision (アイシン精機株式会社、愛知県刈谷市)を用いて行われた。
摂取前、摂取8週間後に簡易酸化ストレスプロファイルを評価した。簡易酸化ストレスプロファイルは、体内の酸化損傷度と抗酸化能のバランス(酸化ストレス)の検査で、老化や疾病の原因となる酸化ストレスの状態を調べることができる。簡易酸化ストレスプロファイルは、日研ザイル株式会社にて摂取前、摂取8週間後に採集した尿と血清から、その成分のバランスを分析することで酸化ストレスプロファイル(総合評価、酸化ストレスの状態、抗酸化能の状態)が評価された。総合評価では、「危険ゾーン(酸化ストレスが高く、抗酸化能が低い状態)」を1、「警告ゾーン(抗酸化能が高いが、酸化ストレスも高い状態)」を2、「低活性ゾーン(抗酸化能は低いが、酸化ストレスも低い状態)」を3、「良好ゾーン(酸化ストレスは少なく、抗酸化能が高い状態)」を4と得点化して評価した。また、酸化ストレスの状態および抗酸化能の状態は、「低い」を1、「平均的」を2、「高い」を3と得点化して評価した。
摂取前、摂取8週間後の検査日に肌評価を行った。試験参加者の顔面画像を撮影した後、画像解析を行い、シミ、シワしみ、シワ、肌のきめ、うるおい、赤味等を数値化し評価した。項目は色素沈着数、色素沈着総面積、シワ総長さ、シワ総面積、赤味数、赤味総面積、水分値、油分値、きめであった。測定はロボスキンアナライザーCS50(株式会社インフォワード、東京都渋谷区)を用い、広尾皮フ科クリニックにおいて行われた。
摂取前、摂取8週間後の検査日に、肌弾力性を定量的に測定し、年齢別の平均データと比較した数値として測定した。測定部位は左右の3箇所(目尻、頬、顎)であった。測定はトリプルセンス(株式会社モリテックス、埼玉県朝霞市)を用い、広尾皮フ科クリニックにおいて行われた。
摂取前、摂取8週間後の検査日に、リッカートスケール法を用い、自覚症状を評価した。調査項目は「化粧のノリが悪い」「肌に弾力がない」「肌に潤いがない」「肌がべとついている」「肌のキメが悪い」「肌がくすんでいる」「肌がたるんでいる」「よく冷えを感じる」「クマ、くすみが気になる」「代謝が悪い」「体が疲れやすい」「寝ても疲れがとれない」「むくみやすい」「倦怠感がある」「体調不良に陥りやすい」「口内炎ができやすい」「頭がすっきりしない」であった。選択肢は、1.「まったくあてはまらない」、2.「ほとんどあてはまらない」、3.「あまりあてはまらない」、4.「少しあてはまる」、5.「かなりあてはまる」、6.「非常によくあてはまる」であり、選択肢番号を得点化して評価した。測定は広尾皮フ科クリニックにおいて行われた。
身体測定・理学検査では、身長、体重、BMI、体脂肪率、収縮期血圧、拡張期血圧、心拍数を測定した。身長のみ、事前説明会終了後に測定した。そのほかは摂取前、摂取8週間後の検査日に測定した。身長は手動身長計(HP−I、TTM、東京)、体重と体脂肪率はInner Scan 50 BC−309−PR(株式会社タニタ、東京都板橋区)、血圧と心拍数は電子血圧計ES−P370(テルモ株式会社、東京都渋谷区)を使用して測定した。またBMIは体重(kg)を身長(m)の二乗で除して求めた。測定は株式会社オルトメディコおよび広尾皮フ科クリニックにて実施した。
酸化ストレスマーカーおよび肌測定、肌弾力測定、身体測定・理学検査、末梢血液検査については、摂取前ならびに摂取8週間後の測定値を対応のあるt検定を用いて比較した。簡易ストレスプロファイルおよび自覚症状の評価については、摂取前ならびに摂取8週間後の測定値をWilcoxonの符号付き順位検定を用いて比較した。尿検査については、摂取前ならびに摂取8週間後の測定値をMcNemar検定を用いて比較した。なお、多項目の検定に対する多重性の補正は行わなかった。全ての統計解析は両側検定で行い、有意水準は5%に設定した。対応のあるt検定はMicrosoft Excel 2013(日本マイクロソフト株式会社、東京都港区)、Wilcoxonの符号付き順位検定およびMcNemar検定はIBM SPSS ver23.0(日本アイ・ビー・エム、東京都中央区)を用いた。また、摂取率が90%に満たないなど遵守事項が守れなかった者は解析から除外した。
(1.分析対象)
図7に試験参加者の追跡フローチャートを示した。本試験は日ごろ疲れやすいと自覚している健常な日本人成人女性を対象とした。試験参加に同意した39名のうち試験責任医師の問診や選抜基準により12名を除外し、27名を本試験に組み入れた。試験食品の摂取率が90%を下回る者はおらず、解析対象者は計27名(51.1±9.8歳)であった。
酸化ストレスおよび抗酸化関連の平均値と標準偏差、中央値と四分位範囲の統計解析の結果を表2と表3に示した。
肌測定の平均値と標準偏差、統計解析の結果を表4に示した。
試験参加者全体で解析を行ったところ、摂取前と比較して摂取8週間後に有意に低下した項目は、目尻のシワの総長さ(P=0.015)、目尻のシワの総面積(P=0.041)であった。また有意に上昇した項目は、赤味数(合計)(P=0.005)、赤味数(平均)(P=0.005)、赤味面積(合計)(P=0.002)、赤味面積(平均)(P=0.002)であった。
簡易肌弾力測定の平均値と標準偏差、統計解析の結果を表5に示した。
摂取前と比較して摂取8週間後に有意に低下した項目は、目尻(左右平均)(P=0.006)、頬(左右平均)(P<0.001)、顎(左右平均)(P=0.033)であった。
自覚症状(リッカートスケール法)の中央値と四分位範囲、統計解析の結果を表6に示した。
摂取前と比較して摂取8週間後に有意に低下した項目は、「化粧のノリが悪い」(P=0.012)、「肌に弾力がない」(P=0.021)、「肌がべとついている」(P<0.001)、「肌のキメが悪い」(P=0.001)、「肌がくすんでいる」(P=0.003)、「肌がたるんでいる」(P<0.001)、「クマ、くすみが気になる」(P=0.005)、「体が疲れやすい」(P=0.001)、「寝ても疲れがとれない」(P=0.002)、「むくみやすい」(P=0.025)、「倦怠感がある」(P=0.001)、「体調不良に陥りやすい」(P=0.008)、「口内炎ができやすい」(P<0.001)、「頭がすっきりしない」(P=0.018)であった。
身体測定・理学検査、尿検査、末梢血液検査の平均値と標準偏差、統計解析の結果を表7−1〜表7−3に示した。
本試験では、植物発酵ペーストの継続摂取が日ごろ疲れやすいと自覚している健常な日本人成人女性に及ぼす影響を検討した。主要アウトカムとして、酸化ストレスマーカーとして尿中の8−OHdG、PRL、HEL、血中PAOを測定し、酸化ストレスと抗酸化能のバランスを簡易酸化ストレスプロファイルについても評価した。副次アウトカムとして、自覚症状(リッカートスケール法)および肌の弾力、肌の状態について評価した。
本研究の結果から、植物発酵ペーストの継続摂取は体内の酸化ストレスおよび抗酸化能のバランスを改善し、シワやシミを減少させるとともに肌や疲労に関する自覚症状を改善することが示唆された。
Claims (10)
- 非加熱状態にある植物原材料を、糖とともに第一の容器内に導入し、前記植物原材料から植物エキスを抽出する工程と、
前記植物エキスを第一の発酵温度で発酵させて第一の植物発酵液を調製する第一の発酵工程と、
前記第一の植物発酵液を第二の発酵温度で発酵させて第二の植物発酵液を調製する第二の発酵工程と、
前記第二の植物発酵液中の水分含有量を低減させる水分蒸発工程と、
をこの順で含み、
前記植物原材料が、
にんにく、たまねぎ、茶葉、トマト、メロンおよびグレープフルーツからなる群より選択される少なくとも4種以上と、
ブロッコリー、ジャガイモ、キャベツ、ショウガ、カリフラワー、なす、緑ピーマン、レモン、キュウリ、大豆モヤシ、ローズマリー、バジル、オレガノおよびセージからなる群より選択される少なくとも3種以上と、
バナナ、レンコン、しどけ、ホウレンソウ、ニンジン、ニラ、アスパラガス、シイタケ、ゴボウ、こごみ、マイタケ、ミョウガおよび緑豆モヤシからなる群より選択される少なくとも3種以上と、
を含み、
前記植物エキスを抽出する工程、前記第一の発酵工程、前記第二の発酵工程および前記水分蒸発工程を実施する環境温度は、常時、50℃以下となるように保持されており、
前記植物エキスを抽出する抽出温度が、4℃以上30℃以下であり、
前記第一の発酵温度が10℃以上50℃以下であり、
前記第二の発酵温度が、前記第一の発酵温度よりも低い温度であり、
前記第一の発酵工程の前段階において、前記植物エキス中に乳酸菌または酵母を混入させ、
前記第二の発酵工程および前記水分蒸発工程が、抗菌作用を有する第二の容器内で行われる、植物発酵ペーストの製造方法。 - 前記第一の発酵工程においては、前記植物エキスに対して、乳酸菌または酵母を添加しない、請求項1に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記第二の発酵工程においては、前記第一の植物発酵液に対して、乳酸菌または酵母を添加しない、請求項1または2に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記第一の容器が、乳酸菌または酵母が付着した容器である、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記糖が、粗糖、上白糖、白糖、甜菜糖、希少糖、オリゴ糖、和三盆糖および黒糖からなる群より選択される1種または2種以上である、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記第一の発酵温度が、30℃以上50℃以下である、請求項1乃至5のいずれか一項に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記第二の発酵温度が、4℃以上30℃未満である、請求項1乃至6のいずれか一項に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記水分蒸発工程を実施する環境温度が5℃以上40℃以下である、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記水分蒸発工程の後、前記第二の植物発酵液を食用粉体と混合する工程をさらに含む、請求項1乃至8のいずれか一項に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
- 前記食用粉体が多孔質体である、請求項9に記載の植物発酵ペーストの製造方法。
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