CN115786517A - 一种肠癌患癌、癌前筛查组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测表观遗传变异，即Septin9基因甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液和聚合酶，所述PCR反应液由dNTP、引物、探针和溶剂组成，本发明还提供了一种通过检测Septin9基因中的甲基化的应用，利用本发明的试剂盒和检测方法可实现消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病等的早期发现，尤其对内窥镜或影像学有排斥或因特殊原因无法进行内窥镜、影像学检查的消化道癌症高危人群，可以使用本发明提供的试剂盒进行筛查检测。

Description

一种肠癌患癌、癌前筛查组合物及其用途

本申请是中国申请号为201910999215.1、发明名称为“一种健康表观基因组学的组合物及其用途”且申请日为2019年10月21日的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种检测表观遗传变异，即Septin9基因甲基化的试剂盒，及其检测方法和在筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病中的应用。

背景技术

食管癌是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内食管癌的发病率在恶性肿瘤中居第8位，死亡率为第6位。我国是食管癌最高发的国家之一，每年食管癌新发病例超过22万例，死亡约20万例。提高我国食管癌诊疗水平是艰巨而紧迫的医学研究难题。目前，超过90％的食管癌患者确诊时已进展至中晚期，生活质量低，总体5年生存率不足20％。而仅累及黏膜层和黏膜下浅层的早期食管癌通常经内镜下微创治疗即可根治，取得与外科手术相当的疗效，且具有创伤小、痛苦少、恢复快的优势，患者5年生存率可超过95％。《中国癌症预防与控制规划纲要(2004—2010)》明确指出，癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低死亡率并提高生存率的主要策略。在提高早期病变检出率和诊断率的基础上进行内镜下早期治疗，是改善食管癌患者预后、节约国家医疗资源、减轻家庭和社会负担的有效途径。《中国早期食管癌筛查及内镜诊治专家共识意见(2014年，北京)》中指出慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎、各种原因导致的食管良性狭窄等，是与食管癌相关并有一定癌变率的良性疾病，统称为食管癌前疾病(precancerous diseases)。因此除了早期检测食管癌外，还需要对上述癌前疾病进行早期检测和干预。

胃癌(Gastric Carcinoma)是指原发于胃的上皮源性恶性肿瘤。在我国胃癌发病率仅次于肺癌居第二位，死亡率排第三位。全球每年新发胃癌病例约120万，中国约占其中的40％。我国早期胃癌占比很低，仅约20％，大多数发现时已是进展期，总体5年生存率不足50％。早期胃癌患者常无特异的症状，随着病情的进展可出现类似胃炎、溃疡病的症状，主要有：1)上腹饱胀不适或隐痛，以饭后为重；2)食欲减退、嗳气、返酸、恶心、呕吐、黑便等。进展期胃癌除上述症状外，常出现：1)体重减轻、贫血、乏力；2)胃部疼痛，如疼痛持续加重且向腰背放射，则提示可能存在胰腺和腹腔神经丛受侵，胃癌一旦穿孔，可出现剧烈腹痛的胃穿孔症状；3)恶心、呕吐，常为肿瘤引起梗阻或胃功能紊乱所致，贲门部癌可出现进行性加重的吞咽困难及反流症状，胃窦部癌引起幽门梗阻时可呕吐宿食；4)出血和黑便，肿瘤侵犯血管，可引起消化道出血，小量出血时仅有大便潜血阳性，当出血量较大时可表现为呕血及黑便；5)其他症状如腹泻(患者因胃酸缺乏、胃排空加快而引起的)、转移灶的症状等。晚期患者可出现严重消瘦、贫血、水肿、发热、黄疸和恶病质。虽然胃癌的症状与其他胃部疾病极其相似，但临床上普遍认为胃癌的发生过程经历了浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生、低级别内瘤变、高级别内瘤变、胃癌6个阶段，因此对于胃癌的预防，癌前疾病(如萎缩性胃炎、肠化生)的早期发现和干预尤为重要。目前常用的胃部疾病的有效检测方法几乎全部依赖胃镜，但胃镜的依从性较低，且我国是胃癌大国，胃镜资源和临床技师数量无法满足需要，因此仍需要行之有效的筛查方法。

大肠癌是常见恶性肿瘤，全世界每年约90万人发病，是最常见的消化道恶性肿瘤之一。大肠恶性肿瘤起源于粘膜上皮或粘膜下间叶组织。其中由大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性肿瘤统称为大肠癌。大肠癌发生部位为盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠，为结肠癌和直肠癌的总称，也称大肠癌。大肠癌是一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，世界范围内的流行病学调查资料表明，大肠癌在各类恶性肿瘤中的发病率居第3位，是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第2位。结直肠癌发病率仅次于胃和食管癌。早期结直肠癌可无明显症状，病情发展到一定程度可出现下列症状：排便习惯改变、大便性状改变(如变细、血便、黏液便等)、腹痛或腹部不适、腹部肿块、肠梗阻相关症状、贫血及全身症状(如消瘦、乏力、低热等)。大肠癌发病可能与以下疾病相关：溃疡性结肠炎、大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病、血吸虫病等，应详细询问患者相关病史。因此除了提高早期大肠癌的早诊率外，肠道其他疾病，尤其是息肉、腺瘤的早期检测，在结直肠癌的预防中作用尤为重要。数据显示，一次肠镜可使17年内肠癌风险降低30％，虽然肠镜可在早期发现息肉、腺瘤、结直肠癌，但因为肠镜的侵入性，在临床上的依从性相对较低，目前仍无法在临床上广泛推广，用于结直肠癌和癌前疾病的筛查。因此，市场迫切需要简单、灵敏性高、依从性高的试剂盒，用于结直肠癌癌前疾病的早期检测。

原发性肝癌是全球三大肿瘤死因之一，2000年约54.86万人死于肝癌。原发性肝癌的预后很差，平均生存时间从诊断起不到6个月。因此，死亡率和发生率相仿。我国是肝癌的高发国家，占全球肝癌的50％以上。自20世纪90年代起，肝癌在我国肿瘤死亡率中顺位第二，我国目前大约80％的肝癌与乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染有关。在肝癌高发地区大多数HBV感染者起自围产期或幼儿期。安全有效的乙肝疫苗出现，并在新生儿中常规接种，有望经三四十年后能明显地降低由于HBV引起的肝癌发病。近年来丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝癌的关系受到广泛的重视，而目前尚缺乏有效的措施控制HCV的感染，从而预防肝癌的发生。而通过筛查，早期发现、早期诊断、早期治疗肝癌，即肝癌的二级预防可望降低肝癌的死亡率。《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》指出对肝癌高危人群的筛查，有助于早期发现、早期诊断、早期治疗，是提高肝癌疗效的关键。在我国，肝癌的高危人群主要包括：具有乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)和/或丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染、长期酗酒、非酒精脂肪性肝炎、食用被黄曲霉毒素污染食物、多种原因引起的肝硬化、以及有肝癌家族史等的人群，尤其是年龄40岁以上的男性风险更大。因此，对于除了B超外，如果有更简单的方法实现肝硬化的检测，更有助于肝癌的早期预防。

胰腺癌是一种恶性程度高，检测和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。我国胰腺癌发病率为7.28例/10⁵人，死亡率为6.61例/10⁵人。胰腺癌患者的五年存活率仅为5％，堪称癌症中的“绝症”。此外，新发胰腺癌病例逐年增加：我国胰腺癌新发病例在2003-2009年期间增加30％以上。导致胰腺癌死亡率高、治愈率低的一个重要因素是早期胰腺癌的确诊率显著低于其他癌症。由于早期胰腺癌缺乏明显的、特异的症状，绝大部分患者确诊时已进入癌症晚期，此时病灶多已发生转移，无法采用治愈性手段进行治疗。近年的临床研究显示治愈胰腺癌的机会仍存在：由于从胰腺癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要2-3年，这为发现早期胰腺癌、提高早期胰腺癌的确诊率提供了一个有效的窗口期；充分利用这个窗口期，有望提高胰腺癌治疗效果、降低胰腺癌死亡率。胰腺癌的高危因素包括吸烟、肥胖、酗酒、慢性胰腺炎等，接触萘胺及苯类化合物者罹患胰腺癌的风险显著增加。糖尿病是胰腺癌的风险因素之一，特别是老年、低体重指数、无糖尿病家族史的病人，新发Ⅱ型糖尿病时应注意随访并警惕胰腺癌的可能。同时，胰腺癌具有遗传易感性，约10％的胰腺癌病人具有遗传背景，患有遗传性胰腺炎、Peutz-Jeghers综合征、家族性恶性黑色素瘤及其他遗传性肿瘤疾患的病人，胰腺癌的风险显著增加。因此，胰腺癌的预防，也应该在早期实现对上述疾病的早期发现和干预。

综上所述，虽然影像学、内窥镜是目前筛查癌症以及癌前病变和癌前疾病的有效方法之一，但因为依从性低，以及国内的资源、专业技师有限，目前仍不适于全民筛查。因此，相对于影像学、内窥镜，依从性更高、灵敏性高的检测方法，是解决目前消化道癌前病变和消化道癌前疾病提前预防和早期干预的行之有效的方法。

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容，其在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤发生的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，导致基因组不稳定从而诱发细胞癌变。DNA甲基化实质是：当细胞内出现异常事件时，DNA甲基化转移酶表达升高，使得DNA中的胞嘧啶的第五位碳原子上连接的氢原子被甲基取代(如图2所示)。DNA的构象发生改变后，RNA聚合酶不能通过发生了甲基化的DNA区域，导致甲基化下游的基因不能表达，最终出现细胞功能的紊乱，发生肿瘤。研究发现，DNA甲基化发生在癌前疾病阶段，随着甲基化水平的不断升高，疾病不断发展，最终演变为癌症(如图3所示)。

在表观遗传学水平上发生的变异比基因突变上要频繁，因此利用表观遗传上的变异去诊断癌前疾病比在基因突变水平检测具有更高的灵敏度和更好的特异性。

Septin9基因作为生物标记物是基于Septin9基因的启动子区域的一段特定DNA序列的甲基化状态。Septin9是Septin基因家族的一个成员，该基因家族至少有13个基因组成，它们编码保守的鸟苷三磷酸酶(GTPase)结构域，可以结合细胞骨架相关的蛋白质，这些蛋白质与肿瘤发生相关。Septin基因家族蛋白质的主要功能是胞质分裂、膜泡运输、膜融合、胞外分泌、细胞凋亡。

截至目前，Septin9的研究报道仅限于食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和胰腺癌的检测，尚没有用于食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和胰腺癌的患癌风险、癌前病变和癌前疾病的检测的报道。

发明内容

本发明涉及一种通过检测DNA甲基化程度来对个体中消化道患癌风险、消化道癌前病变和癌前疾病进行检测的基因组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法。

具体地，本发明涉及如下内容：

1.一种用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的组合物，其特征在于，所述组合物包含用于检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；

其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14中的连续的至少15个碱基长度的片段，所述片段的长度为60bp以上，优选为60～90bp；

所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。

2.根据第1项所述的组合物，其特征在于，所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：可扩增甲基化的所述靶区域，而不能扩增非甲基化的所述靶区域。

3.根据第2项所述的组合物，其特征在于，

所述引物的长度为15bp以上，优选18～24bp；和

所述探针的长度为15bp以上，优选18～30bp。

4.根据第2或3项所述的组合物，其特征在于，检测Septin9基因的引物和探针为组合物1、2、3和4中的任何一种或多种；

组合物1：

正向引物SEQ ID No.1：5'-TGTTTGTTAGTCGCGTGCG-3'

反向引物SEQ ID No.2：5'-AAATTCTCTATCACCGCCGC-3'

探针SEQ ID No.3：5'-CGCGCGCTCTACGCCTACAA-3'；

组合物2：

正向引物SEQ ID No.4：5'-GTCGCGTTTTTCGTCGTT-3'

反向引物SEQ ID No.5：5'-CTAAACACACGACCGAAACG-3'

探针SEQ ID No.6：5'-CCCGCCTAACCCGCGCCC-3'；

组合物3:

正向引物SEQ ID No.7：5'-CGGGCGGAGTAGTTAGTGC-3'

反向引物SEQ ID No.8：5'-CTCCCGAACGAATCAAATTCC-3'

探针SEQ ID No.9：5'-CGCACCCGCACCGACCTCC-3'；和

组合物4:

正向引物SEQ ID No.10：5'-TTCGTTGAGAGCGTCGCG-3'

反向引物SEQ ID No.11：5'-GCGCAAAATCTACGCGAATAC-3'

探针SEQ ID No.12：5'-CCCACGTAAACGACGCGAACACG-3'。

5.一种用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含第1至4项中任一项所述的组合物。

6.根据第5项所述的试剂盒，其特征在于，所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。

7.根据第6项所述的试剂盒，其特征在于，所述食管癌癌前病变和癌前疾病包括：慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎。

8.根据第6项所述的试剂盒，其特征在于，所述胃癌癌前病变和癌前疾病包括：萎缩性胃炎、息肉、胃溃疡、黄色素瘤、肠化生。

9.根据第6项所述的试剂盒，其特征在于，所述肠癌癌前病变和癌前疾病包括：溃疡性结肠炎、大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病。

10.根据第6项所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌癌前病变和癌前疾病包括：肝硬化。

11.根据第6项所述的试剂盒，其特征在于，所述胰腺癌癌前病变和癌前疾病包括：粘液性囊腺瘤、胰腺炎、假囊肿、胰岛素瘤。

12.一种第5-11项中任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)采集人源样本；

b)从所述人源样本中提取游离DNA；

c)将所述DNA用亚硫酸氢盐转化；

d)进行PCR反应；

f)对所述PCR反应的产物进行结果判读。

13.根据第12项所述的方法，其特征在于，所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种。

14.根据第12项所述的方法，其特征在于，所述人源样本为自静脉中抽取的静脉血及血浆。

15.根据第1至4项中任一项所述的组合物在制备用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的试剂盒中的用途。

16.根据第15项所述的用途，其特征在于，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。

17.根据第16项所述的用途，其特征在于，所述食管癌癌前病变和癌前疾病包括：慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎。

18.根据第16项所述的用途，其特征在于，所述胃癌癌前病变和癌前疾病包括：萎缩性胃炎、息肉、胃溃疡、黄色素瘤、肠化生。

19.根据第16项所述的用途，其特征在于，所述肠癌癌前病变和癌前疾病包括：溃疡性结肠炎、大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病。

20.根据第16项所述的用途，其特征在于，所述肝癌癌前病变和癌前疾病包括：肝硬化。

21.根据第16项所述的用途，其特征在于，所述胰腺癌癌前病变和癌前疾病包括：粘液性囊腺瘤、胰腺炎、假囊肿、胰岛素瘤。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和下文中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。

发明效果

虽然影像学、内窥镜是目前筛查消化道癌前疾病的有效方法之一，但因为依从性低，且国内的医疗资源和专业技师数量有限，目前无法满足大规模人群。传统的肿瘤标志物，是目前除了影像学和内窥镜以外使用较多的癌症筛查方法，但是针对早期癌症的检出率普遍在10～20％左右，对于癌前病变和癌前疾病的检出率则会更低。因此，相对于影像学、内窥镜和传统肿瘤标志物，需要开发一种高效灵敏、简单、依从性高的检测方法，用于消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的早期筛查。

本发明利用在表观遗传变异水平检测消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病比在基因突变水平检测具有更高的灵敏度和更好的特异性的特点，开发了一种利用检测Septin9基因甲基化来检测消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的方法以及相应的组合物、试剂盒以及核酸序列，从而以非侵入性的方式、在早期高效灵敏地诊断和检测消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病，很大程度地提高了消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的检出率，对于排斥内窥镜、影像学检查或因特殊原因无法进行内窥镜、影像学检查的人群，是一个非常有效的补充辅助检测手段。

附图说明

图1显示出使用甲基化DNA和非甲基化作为模板，检测Septin9，扩增效果。

图2显示出CpG岛的甲基化。

图3显示出Septin9甲基化在肠癌发生过程中的状态变化。

具体实施方式

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与多种相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书中的定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

本发明的其他特点和优势将在以下详细的描述。

定义

消化道是指一条起自口腔延续为咽、食管、胃、小肠、大肠、终于肛门的很长的肌性管道，包括口腔、咽、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)和大肠(盲肠、结肠、直肠)等部。消化腺有小消化腺和大消化腺两种。小消化腺散在于消化管各部的管壁内，大消化腺有三对唾液腺、肝和胰，它们均借导管，将分泌物排入消化管内。

癌前病变是指癌症在发生发展过程中的一个阶段，继续发展下去具有癌变可能的某些病变。机体的正常细胞在不同致癌因素的长期作用下，首先表现为细胞数量增加，但细胞形态尚未发生改变，病理上称这个变化为“单纯性增生”。以后，在数量增加的同时，细胞形态与起源组织的细胞形态差异(又称异型性)逐渐加重，但尚未发展为癌，这个阶段属于癌的前驱阶段，称为“癌前病变”。癌前病变时，虽然增生的细胞已有向癌细胞转变的倾向，但尚未成为典型癌变。而且不是所有的癌前病变都发展为癌，大部分癌前病变在此消退复原。只有相当小的一部分癌前病变继续发展，最终演变为癌。

癌前疾病某些疾病虽然本身不是恶性肿瘤，但具有发展为恶性肿瘤的潜能，患者发生相应恶性肿瘤的风险增加。这些疾病称为癌前疾病。癌前疾病是一个临床学概念是一类疾病包括病因病理、临床症状、体征和辅助检查的异常改变，实际上细胞癌变过程是分阶段发展和逐渐演变的从致癌因子攻击正常组织细胞到产生癌症。一般需要10年以上甚至更长的时间，当然也有进展迅速的，在这个漫长的过程中，癌前疾病是通过癌前蹭发展成癌症的。

Septin9基因是指Septin基因家族的一个成员，该基因家族至少有13个基因组成，它们编码保守的鸟苷三磷酸酶(GTPase)结构域，可以结合细胞骨架相关的蛋白质，这些蛋白质与肿瘤发生相关。Septin基因家族的成员与从膜泡运输到胞质分裂的多种细胞功能相关，例如胞质分裂、膜泡运输、膜融合、胞外分泌、细胞凋亡。破坏Septin9的作用将导致不完全的细胞分裂，Septin9和其它的蛋白已显示为原癌基因MLL的融合伴侣分子(fusionpartner)，这表明了在肿瘤发生中的作用。

靶区域是指基因的靶区域，又称为靶基因，即目的基因。在分子遗传中，它不仅要具有识别结合功能，还应该具有与位点结合后能表达所需要的相应功能的作用。

甲基化是指DNA甲基化(DNA methylation)，为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

核酸是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用

寡核苷酸是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸)，寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。

引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，用特殊示踪剂(如同位素、酶或有色基团)进行标记；在适当的pH值、温度和离子强度下，DNA探针利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。

正向引物是指处于DNA双链上游的引物，是沿着负链进行不间断延长的。负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。

反向引物是指处于DNA双链下游的引物，是沿着正链进行不间断延长的。正链即有义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5‘——3’。

游离DNA(cfDNA)是指循环游离DNA或者细胞游离DNA，是释放到血浆中的降解的DNA片段。肿瘤来源的cfDNA，可以发现肿瘤相关的突变、杂合子缺失(LOH)、基因扩增、癌病毒DNA、抑癌基因启动子区的超甲基化，因此可以实现在无创条件下研究肿瘤DNA。

本发明涉及物医药技术领域，具体地，涉及一种用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的组合物。在本发明中，利用所述组合物检测Septin9基因甲基化的程度来检测消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病，从而对消化道癌前疾病进行早期预防和干预。

在本发明的一个具体的实施方案中，一种组合物包含用于检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14中的连续的至少15个碱基长度的片段，所述片段的长度为60bp以上，优选为60～90bp；所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。

在本发明的一个具体的实施方案中，一种组合物包含用于检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14中的连续的至少15个碱基长度的片段，所述片段的长度为60bp以上，优选为60～90bp；所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：可扩增甲基化的所述靶区域，而不能扩增非甲基化的所述靶区域。

在本发明的一个具体的实施方案中，一种组合物包含用于检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14中的连续的至少15个碱基长度的片段，所述片段的长度为60bp以上，优选为60～90bp；所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：可扩增甲基化的所述靶区域，而不能扩增非甲基化的所述靶区域。所述引物的长度为15bp以上，优选18～24bp；和所述探针的长度为15bp以上，优选18～30bp。

在本发明的一个具体的实施方案中，一种组合物包含用于检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14中的连续的至少15个碱基长度的片段，所述片段的长度为60bp以上，优选为60～90bp；所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：可扩增甲基化的所述靶区域，而不能扩增非甲基化的所述靶区域。所述引物和探针为组合物1、2、3和4中的任何一种或多种：

组合物1：

正向引物SEQ ID No.1：5'-TGTTTGTTAGTCGCGTGCG-3'

反向引物SEQ ID No.2：5'-AAATTCTCTATCACCGCCGC-3'

探针SEQ ID No.3：5'-CGCGCGCTCTACGCCTACAA-3'；

组合物2：

正向引物SEQ ID No.4：5'-GTCGCGTTTTTCGTCGTT-3'

反向引物SEQ ID No.5：5'-CTAAACACACGACCGAAACG-3'

探针SEQ ID No.6：5'-CCCGCCTAACCCGCGCCC-3'；

组合物3:

正向引物SEQ ID No.7：5'-CGGGCGGAGTAGTTAGTGC-3'

反向引物SEQ ID No.8：5'-CTCCCGAACGAATCAAATTCC-3'

探针SEQ ID No.9：5'-CGCACCCGCACCGACCTCC-3'；和

组合物4:

正向引物SEQ ID No.10：5'-TTCGTTGAGAGCGTCGCG-3'

反向引物SEQ ID No.11：5'-GCGCAAAATCTACGCGAATAC-3'

探针SEQ ID No.12：5'-CCCACGTAAACGACGCGAACACG-3'。

在本发明的一个具体的实施方案中，一种组合物包含用于检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14中的连续的至少15个碱基长度的片段，所述片段的长度为60bp以上，优选为60～90bp；所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：可扩增甲基化的所述靶区域，而不能扩增非甲基化的所述靶区域。所述引物的长度为15bp以上，优选18～24bp；和所述探针的长度为15bp以上，优选18～30bp。所述引物和探针为组合物1、2、3和4中的任何一种或多种：

组合物1：

正向引物SEQ ID No.1：5'-TGTTTGTTAGTCGCGTGCG-3'

反向引物SEQ ID No.2：5'-AAATTCTCTATCACCGCCGC-3'

探针SEQ ID No.3：5'-CGCGCGCTCTACGCCTACAA-3'；

组合物2：

正向引物SEQ ID No.4：5'-GTCGCGTTTTTCGTCGTT-3'

反向引物SEQ ID No.5：5'-CTAAACACACGACCGAAACG-3'

探针SEQ ID No.6：5'-CCCGCCTAACCCGCGCCC-3'；

组合物3:

正向引物SEQ ID No.7：5'-CGGGCGGAGTAGTTAGTGC-3'

反向引物SEQ ID No.8：5'-CTCCCGAACGAATCAAATTCC-3'

探针SEQ ID No.9：5'-CGCACCCGCACCGACCTCC-3'；和

组合物4:

正向引物SEQ ID No.10：5'-TTCGTTGAGAGCGTCGCG-3'

反向引物SEQ ID No.11：5'-GCGCAAAATCTACGCGAATAC-3'

探针SEQ ID No.12：5'-CCCACGTAAACGACGCGAACACG-3'。

在本发明中，所述核酸包括Septin9的至少15个寡核苷酸长片段，其中所述寡核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列。优选地，所述Septin9的寡核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14或其变体中的至少15个核苷酸及其互补序列。更优选地，所述Septin9的寡核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID No.：1至SEQ ID No.：12的序列及其互补序列。用于检测Septin9基因及其寡核苷酸长片段中至少一个靶区域内是否存在甲基化的核酸序列包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO.：13或SEQ ID No.：14及其变体的连续序列的至少9个碱基长的片段。

SEQ ID No.：13序列如下所示：

GAGGCGTCGCCCGTCCCTGGCTTCTCTGACAGCCGTGTTCCATCCCCGCCCTGTGCCCCTTCTCCCGGACAGTGCCTTCTCCAGGGCTCACCCAGGAGGGTGCAGCGGTGGCCCCCGGGGCGGTGGTCGTGGTGGGGGTGTTAGCTGCAGGGGTGCCCTCGGTGGGTGGGAGTTGGTGGCCTCTCGCTGGTGCCATGGGACTCGCATGTTCGCCCTGCGCCCCTCGGCTCTTGAGCCCACAGGCCGGGATCCTGCCTGCCAGCCGCGTGCGCTGCCGTTTAACCCTTGCAGGCGCAGAGCGCGCGGCGGCGGTGACAGAGAACTTTGTTTGGCTGCCCAAATACAGCCTCCTGCAGAAGGACCCTGCGCCCGGGGAAGGGGAGGAATCTCTTCCCCTCTGGGCGCCCGCCCTCCTCGCCATGGCCCGGCCTCCACATCCGCCCACATCTGGCCGCAGCGGGGCGCCCGGGGGGAGGGGCTGAGGCCGCGTCTCTCGCCGTCCCCTGGGCGCGGGCCAGGCGGGGAGGAGGGGGGCGCTCCGGTCGTGTGCCCAGGACTGTCCCCCAGCGGCCACTCGGGCCCCAGCCCCCCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGCCCGGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCCATTCATTCAGCTGAGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGACCCCTAATCCAGGCGCCCTCCCGCTGAGAGCGCCGCGCGCCCCCGGCCCCGTGCCCGCGCCGCCTACGTGGGGGACCCTGTTAGGGGCACCCGCGTAGACCCTGCGCGCCCTCACAGGACCCTGTGCTCGTTCTGCGCACTGCCGCCTGGGTTTCCTTCCTTTTATTGTTGTTTGTGTTTGCCAAGCGACAGCGACCTCCTCGAGGGCTCGCGAGGCTGCCTCGGAACTCTCCAGGACGCACAGTTTCACTCTGGGAAATCCATCGGTCCCCTCCCTTTGGCTCTCCCCGGCGGCTCTCGGGCCCCGCTTGGACCCGGCAACGGGATAGGGAGGTCGTTCCTCACCTCCGACTGAGTGGACAGCCGCGTCCTGCTCGGGTGGACAGCCCTCCCCTCCCCCACGCCAGTTTCGGGGCCGCCAAGTTGTGCAGCCCGTGGGCCGGGAGCACCGAACGGACACAGCCCAGGTCGT

进一步优选的SEQ ID No.：14序列如下所示：

CGCCCTGCGCCCCTCGGCTCTTGAGCCCACAGGCCGGGATCCTGCCTGCCAGCCGCGTGCGCTGCCGTTTAACCCTTGCAGGCGCAGAGCGCGCGGCGGCGGTGACAGAGAACTTTGTTTGGCTGCCCAAATACAGCCTCCTGCAGAAGGACCCTGCGCCCGGGGAAGGGGAGGAATCTCTTCCCCTCTGGGCGCCCGCCCTCCTCGCCATGGCCCGGCCTCCACATCCGCCCACATCTGGCCGCAGCGGGGCGCCCGGGGGGAGGGGCTGAGGCCGCGTCTCTCGCCGTCCCCTGGGCGCGGGCCAGGCGGGGAGGAGGGGGGCGCTCCGGTCGTGTGCCCAGGACTGTCCCCCAGCGGCCACTCGGGCCCCAGCCCCCCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGCCCGGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCCATTCATTCAGCTGAGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGACCCCTAATCCAGGCGCCCTCCCGCTGAGAGCGCCGCGCGCCCCCGGCCCCGTGCCCGCGCCGCCTACGTGGGGGACCCTGTTAGGGGCACCCGCGTAGACCCTGCGCGCCCTCACAGGACCCTGTGCTCGTTCTGCGCACTGCCG

在本发明中，所述组合物可特异性检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度，该组合物的优点在于对消化道癌症有较高的检出率，同时对于癌前病变、癌前疾病也有较高的检出率，但对于消化道无病变的人群，假阳性可以控制在5％以内。

本发明还涉及一种用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的试剂盒。患癌风险是指用本申请的检测体系检测出其基因甲基化异常的无癌前疾病或癌前病变或癌症群体在以后患有癌前疾病或癌前病变或者进一步患有癌症的可能性。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒包含上述实施方案中任一个所述的组合物。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒筛查所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒筛查所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述食管癌癌前病变和癌前疾病包括：慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒筛查所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述胃癌癌前病变和癌前疾病包括：萎缩性胃炎、息肉、胃溃疡、黄色素瘤、肠化生。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒筛查所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述肠癌癌前病变和癌前疾病包括：溃疡性结肠炎、大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒筛查所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述肝癌癌前病变和癌前疾病包括：肝硬化。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒筛查所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述胰腺癌癌前病变和癌前疾病包括：粘液性囊腺瘤、胰腺炎、假囊肿、胰岛素瘤。

在本发明中，所述消化道癌前病变和癌前疾病，包括但不限于，慢性食管炎、食管鳞状上皮不典型增生、Barrett食管、萎缩性胃炎、胃溃疡、胃息肉、肠息肉、肠腺瘤、肝硬化、胰腺炎等。

根据中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南(2014.北京)所示，结直肠癌的危险因素之一便是炎症性肠病。该病是结直肠癌明确的危险因素。有研究认为约20％的炎症性肠病患者可在发病10年内发生结直肠癌，是正常人群风险的2-4倍。另有Meta分析表明，溃疡性结肠炎患者平均随访14年后汇总标准化发病比为2.4。此外，指南中明确指出低级别上皮内瘤变相当于原来的轻、中度异型增生，是癌前病变，而高级别上皮内瘤变则包括重度异型增生、原位癌、原位癌可以浸润及黏膜内癌，已经是明确的结直肠癌。结直肠腺瘤，可分为管状腺瘤、管状绒毛状腺瘤及绒毛状腺瘤，以绒毛状腺瘤癌变率最高，管状腺瘤最低。大多数结直肠癌经由腺瘤——腺癌途径形成。该指南建议的结直肠癌筛查对象包括但不限于以下人群：(1)既往患有结直肠腺瘤性息肉、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn's disease)等癌前疾病。

胃癌的发生过程一般为以下过程：正常胃粘膜→浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→异型增生→胃癌，美国消化内镜协会ASGE《内镜下胃癌及癌前病变的处理》中年指出癌前疾病包括胃息肉、肠化生和异型增生。《中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见(2014年，长沙)》，确定年龄≥40岁，且既往患有慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃息肉、手术后残胃、肥厚性胃炎、恶性贫血等胃的癌前疾病人群均为胃癌筛查的高危人群。

《中国早期食管癌筛查及内镜诊治专家共识意见(2014年,北京)》中指出，食管癌前疾病指与食管癌相关并有一定癌变率的良性疾病，包括慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎、各种原因导致的食管良性狭窄等。癌前病变指已证实与食管癌发生密切相关的病理变化，食管鳞状上皮异型增生与鳞癌发生密切相关，属癌前病变，Barrett食管相关异型增生则是腺癌的癌前病变。指南中指出，年龄超过40岁且患有食管癌前疾病或癌前病变者是食管癌的高危人群。

我国肝癌的主要高危因素有：乙型/丙型肝炎或酒精性肝硬化、黄曲霉素接触史、饮水污染史者是肝癌的高危人群。NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology(2017)指出，肝硬化人群为有肝癌风险人群，应定期做超声或AFP检查。

《重视对胰腺癌癌前病变的认识和处理》(外科理论与实践2009年第14期第5卷)和《胰腺癌前病变诊断和治疗》(中华消化杂志2008年9月第28卷第9期)同时指出，胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，5年生存率仅为3％，中为生存时间<6个月。胰腺癌起病隐匿，早期症状不典型且进展快，多数病人就诊时已属晚期。早期诊断和综合治疗已成为改善胰腺癌治疗效果的关键所在。癌前病变是恶性肿瘤发展的起始阶段，是启动治疗、阻断恶变的最佳时机。胰腺癌癌前病变包括胰腺上皮内瘤变、慢性胰腺炎、导管内乳头状粘液性肿瘤和粘液性囊性肿瘤等。

在本发明中，所述试剂盒具有更高的灵敏度和更好的特异性，并且可以以非侵入性的方式、在早期高效灵敏地诊断和检测消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病，很大程度地提高了消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的检出率。对于排斥内窥镜、影像学检查或因特殊原因无法进行内窥镜、影像学检查的人群，是一个非常有效的补充辅助检测手段。

本发明还涉及一种上述实施方案中的试剂盒的检测方法。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)采集人源样本；b)从所述人源样本中提取游离DNA；c)将所述DNA用亚硫酸氢盐转化；d)进行PCR反应；e)对所述PCR反应的产物进行结果判读。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：：a)采集人源样本；b)从所述人源样本中提取游离DNA；c)将所述DNA用亚硫酸氢盐转化；d)进行PCR反应；e)对所述PCR反应的产物进行结果判读。所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：：a)采集人源样本；b)从所述人源样本中提取游离DNA；c)将所述DNA用亚硫酸氢盐转化；d)进行PCR反应；e)对所述PCR反应的产物进行结果判读。所述人源样本为自静脉中抽取的静脉血及血浆。

在本发明中，所述方法还包括确定分离自所述个体的生物样品中Septin9基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度，通过Septin9的甲基化检测结果来对个体中消化道癌前疾病进行检测。所述方法还包括使用试剂(例如，亚硫酸氢盐)以将所述DNA的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基；使所述经试剂处理的Septin9或其片段与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因或片段被扩增以产生扩增产物或不被扩增；用探针检测扩增产物；以及基于所述扩增物是否存在，确定Septin9的基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化程度。所述Septin9基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定的。

在本发明中，利用所述试剂盒对个体中消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病进行检测的方法具有灵敏度高和特异性好的特点。所述方法为非侵入式方法，尤其对内窥镜或影像学有排斥或因特殊原因无法进行内窥镜、影像学检查的消化道患癌高危人群，可以使用本发明的方法进行筛查检测。

本发明还涉及一种上述实施方案中的组合物在制备用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的试剂盒中的用途。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述食管癌癌前病变和癌前疾病包括：慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述胃癌癌前病变和癌前疾病包括：萎缩性胃炎、息肉、胃溃疡、黄色素瘤、肠化生。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述肠癌癌前病变和癌前疾病包括：溃疡性结肠炎、大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述肝癌癌前病变和癌前疾病包括：肝硬化。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。所述胰腺癌癌前病变和癌前疾病包括：粘液性囊腺瘤、胰腺炎、假囊肿、胰岛素瘤。

在本发明中，所述消化道癌前病变和癌前疾病，包括但不限于，慢性食管炎、食管鳞状上皮不典型增生、Barrett食管、萎缩性胃炎、胃溃疡、胃息肉、肠息肉、肠腺瘤、肝硬化、胰腺炎等。

下述为本申请的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

实施例1：Septin9基因甲基化检测方法

本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物(使用组合物1：正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2)、225nM探针(使用组合物1：探针SEQ IDNo.3)、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

使用人造甲基化寡核苷酸模板和人造非甲基化寡核苷酸模板进行PCR检测，如图1所示，人造甲基化寡核苷酸模板有扩增，人造非甲基化寡核苷酸模板没有扩增，表明引物和探针是正确的，可以用于甲基化Septin9的检测。

实施例2：食管癌癌前病变和癌前疾病的检测

食管癌癌前病变和癌前疾病的发现，目前仍主要依赖食管镜，然而食管镜的依从性各地普遍较低，限制了食管癌高危人群的早期筛查。

共计完成了1150例无症状人群的Septin9检测，该1150例无症状人群经问卷调查全部对内窥镜或影像学有不同程度的抵触情绪。其中检测样本为血浆(1.2～3.5mL)，提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂。

然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂进行的。

然后，上述经过预处理的1150例无症状人群的DNA样本中加入上述实施例1的检测体系，检测Septin9基因。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物(使用组合物2：正向引物SEQ ID No.4和反向引物SEQ ID No.5)、225nM探针(使用组合物2：探针SEQID No.6)、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对1150例无症状人群进行结果判读，其中Septin9甲基化阳性52例，阳性率为4.35％，阳性的52例受检者通过进一步心理疏导和医学科普，有41例受检者进一步完成了内窥镜检查，其中内窥镜检查结果阳性40例，整体阳性率为97.60％，而其中食管部位发生病变的样本数量为12例，疾病种类如下表1所示，胃镜和肠镜结果详见实施例3和4的进一步阐述。

表1.1150例无症状受检者Septin9阳性食管镜结果。

通过1150例无症状人群的Septin9筛查，对于排斥内窥镜检查的食管癌高危人群，Septin9甲基化检测提供了一种安全无创的食管癌癌前病变和癌前疾病早期筛查的辅助诊断方法。1150例无症状人群，通过Septin9检测，其中12例受检者通过提前干预，可有效降低食管癌癌变的风险。如没有该检测，对于排斥内窥镜检查的食管癌高危人群则没有机会提前对癌前疾病进行有效干预。

实施例3：胃癌癌前病变和癌前疾病的检测

胃癌癌前病变和癌前疾病的发现，目前仍主要依赖胃镜，然而胃镜的依从性各地普遍较低，限制了胃镜高危人群的早期筛查。

共计完成了1150例无症状人群的Septin9检测，该1150例无症状人群经问卷调查全部对内窥镜或影像学有不同程度的抵触情绪。其中检测样本为血浆(1.2～3.5mL)，提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂。

然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂进行的。

然后，上述经过预处理的1150例无症状人群的DNA样本中加入上述实施例1的检测体系，检测Septin9基因。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物(使用组合物3：正向引物SEQ ID No.7和反向引物SEQ ID No.8)、225nM探针(使用组合物3：探针SEQID No.9)、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对1150例无症状人群进行结果判读，其中Septin9甲基化阳性52例，阳性率为4.35％，阳性的52例受检者通过进一步心理疏导和医学科普，有41例受检者进一步完成了内窥镜检查，其中内窥镜检查结果阳性40例，整体阳性率为97.60％，而其中胃部发生病变的样本数量为36例，疾病种类如下表2所示。

表2.1150例无症状受检者Septin9阳性胃镜结果。

通过1150例无症状人群的Septin9筛查，对于排斥内窥镜检查的胃癌高危人群，Septin9甲基化检测提供了一种安全无创的胃癌癌前病变和癌前疾病早期筛查的辅助诊断方法。1150例无症状人群，通过Septin9检测，其中36例受检者通过提前干预，可有效降低胃癌癌变的风险。如没有该检测，对于排斥内窥镜检查的胃癌高危人群则没有机会提前对癌前疾病进行有效干预。

实施例4：结直肠癌癌前病变和癌前疾病的检测

结直肠癌癌前病变和癌前疾病的发现，目前仍主要依赖肠镜，然而肠镜的依从性各地普遍较低，限制了结直肠癌高危人群的早期筛查。

共计完成了1150例无症状人群的Septin9检测，该1150例无症状人群经问卷调查全部对内窥镜或影像学有不同程度的抵触情绪。其中检测样本为血浆(1.2～3.5mL)，提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂。

然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂进行的。

然后，上述经过预处理的1150例无症状人群的DNA样本中加入上述实施例1的检测体系，检测Septin9基因。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物(使用组合物4：正向引物SEQ ID No.10和反向引物SEQ ID No.11)、225nM探针(使用组合物4：探针SEQ ID No.12)、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对1150例无症状人群进行结果判读，其中Septin9甲基化阳性52例，阳性率为4.35％，阳性的52例受检者通过进一步心理疏导和医学科普，有41例受检者进一步完成了内窥镜检查，其中内窥镜检查结果阳性40例，整体阳性率为97.60％，而其中肠道发生病变的样本数量为19例，疾病种类如下表3所示。

表3.1150例无症状受检者Septin9阳性肠镜结果。

通过1150例无症状人群的Septin9筛查，对于排斥内窥镜检查的结直肠癌高危人群，Septin9甲基化检测提供了一种安全无创的结直肠癌癌前病变和癌前疾病早期筛查的辅助诊断方法。1150例无症状人群，通过Septin9检测，其中19例受检者通过提前干预，可有效降低结直肠癌癌变的风险。如没有该检测，对于排斥内窥镜检查的结直肠癌高危人群则没有机会提前对癌前疾病进行有效干预。

实施例5：肝癌癌前病变和癌前疾病的检测

共计完成了1459例无症状人群的Septin9检测，该1459例无症状人群经问卷调查全部对影像学或内窥镜有不同程度的抵触情绪。其中检测样本为血浆(1.2～3.5mL)，提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂。

然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂进行的。

然后，上述经过预处理的1459例无症状人群的DNA样本中加入上述实施例1的检测体系，检测Septin9基因。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物(使用组合物1：正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2)、225nM探针(使用组合物1：探针SEQID No.3)、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对1459例无症状人群进行结果判读，其中Septin9甲基化阳性68例，阳性率为4.66％，阳性的68例受检者中49例进一步完成了超声检查，其中肝硬化39例，整体阳性率为79.59％，疾病种类如下表4所示。

表4.1459例无症状受检者Septin9阳性超声结果。

通过1459例无症状志愿者的Septin9筛查，对于排斥影像学检查的肝癌高危人群，Septin9甲基化检测提供了一种安全无创的肝癌癌前病变和癌前疾病早期筛查的辅助诊断方法。1459例无症状人群，通过Septin9检测，其中39例受检者通过提前干预，可有效降低肝癌癌变的风险。如没有该检测，对于排斥影像学检查的肝癌高危人群则没有机会提前对癌前疾病进行有效干预。

实施例6：胰腺癌前疾病的检测

共计完成了1247例无症状人群的Septin9检测，该1247例无症状人群经问卷调查全部对影像学或内窥镜有不同程度的抵触情绪。其中检测样本为血浆(1.2～3.5mL)，提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂。

然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂进行的。

然后，上述经过预处理的1247例无症状人群的DNA样本中加入上述实施例1的检测体系，检测Septin9基因。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物(使用组合物2：正向引物SEQ ID No.4和反向引物SEQ ID No.5)、225nM探针(使用组合物2：探针SEQID No.6)、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对1247例无症状人群进行结果判读，其中Septin9甲基化阳性62例，阳性率为4.97％，阳性的62例受检者中52例进一步完成了超声检查，其中胰腺病变34例，整体阳性率为79.59％，疾病种类如下表5所示。

表5.1247例无症状受检者Septin9阳性影像学结果。

通过1247例无症状志愿者的Septin9筛查，对于排斥影像学检查的胰腺癌高危人群，Septin9甲基化检测提供了一种安全无创的胰腺癌癌前病变和癌前疾病早期筛查的辅助诊断方法。1247例无症状人群，通过Septin9检测，其中29例受检者通过提前干预，可有效降低胰腺癌癌变的风险。如没有该检测，对于排斥影像学检查的胰腺癌高危人群则没有机会提前对癌前疾病进行有效干预。

实施例7:假阳性

共计完成了100例正常人志愿者的Septin9检测，该100例正常人志愿者全部使用影像学或内窥镜进行检测，确定无任何消化道癌症、癌前疾病和癌前病变。检测样本为血浆(1.2～3.5mL)，提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂。

然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂进行的。

然后，上述经过预处理的100例正常人志愿者的DNA样本中加入上述实施例1的检测体系，检测Septin9基因。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物(使用组合物1：正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2)、225nM探针(使用组合物1：探针SEQID No.3)、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对100例无症状人群进行结果判读，其中Septin9甲基化阳性2例，假阳性率为2％。

表6.100例正常人志愿者Septin9检测结果

比较例

比较例1

为了对比本发明所述的引物、探针组合物显著优于其他组合物，本比较例将使用组合物1和Septin9基因上其他区域的组合物5(SEQ ID Nos.15-17)平行检测消化道疾病样本，并对比两组组合物对消化道疾病的检出率。

组合物5：

正向引物SEQ ID No.15：5'-GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT-3'

反向引物SEQ ID No.16：5'-CCCACCAACCATCATAT-3'

探针SEQ ID No.17：5'-GAACCCCGCGATCAACGCG-3'；

针对50例消化道疾病患者和50例正常人志愿者(全部使用影像学或内窥镜进行检测，确定无任何消化道癌症、癌前疾病和癌前病变)，分别平行检测组合物1和组合物5，检测样本为血浆(1.2～3.5mL)，提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本比较例中，所有的样品DNA是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂。

然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用博尔诚(北京)科技有限公司的核酸提取试剂进行的。

然后，上述经过预处理的50例患有消化道疾病人群和50例正常人志愿者的DNA样本中加入上述实施例1的检测体系，分别使用组合物1和组合物5(SEQ ID Nos.15-17)检测Septin9基因，对比两个组合物的检测灵敏性差异和假阳性差异。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25μl和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl₂和2X PCR缓冲液组成至最终的50μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对50例患有消化道疾病人群进行结果判读(表7)，其中组合物1甲基化阳性30例，阳性率为60.00％，组合物5(SEQ ID Nos.15-17)甲基化阳性15例，阳性率为30.00％。对于已知的患有消化道疾病的人群，组合物1的检出率显著优于Septin9基因上其他区域的组合物，如组合物5。

根据试剂盒的Cutoff值(≤41.0)对50例正常人志愿者进行结果判读(表8)，其中组合物1甲基化阳性1例，假阳性率为2.00％，组合物5(SEQ ID Nos.15-17)甲基化阳性4例，阳性率为8.00％。对于已知正常人群，组合物1的假阳性显著优于Septin9基因上其他区域的组合物，如组合物5。

表7.组合物1与Septin9基因上其他区域的组合物用于检测消化道疾病人群效果对比

表8.组合物1与Septin9基因上其他区域的组合物用于检测正常人群效果对比

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化(如根据用途的不同，可以调整Cutoff值进行筛查应用)。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (22)

1.一种用于筛查肠癌患癌风险、肠癌癌前病变和癌前疾病的组合物，其特征在于，所述组合物包含用于检测Septin9基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；

其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID No.：13或SEQ ID No.：14中的连续的至少15个碱基长度的片段，所述片段的长度为60bp以上，优选为60～90bp；

所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于筛查食管癌、胃癌、肝癌和胰腺的癌患癌风险、癌前病变和癌前疾病。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：可扩增甲基化的所述靶区域，而不能扩增非甲基化的所述靶区域。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，

所述引物的长度为15bp以上，优选18～24bp；和

所述探针的长度为15bp以上，优选18～30bp。

5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述引物和探针为组合物1、2、3和4中的任何一种或多种：

组合物1：

正向引物SEQ ID No.1：5'-TGTTTGTTAGTCGCGTGCG-3'

反向引物SEQ ID No.2：5'-AAATTCTCTATCACCGCCGC-3'

探针SEQ ID No.3：5'-CGCGCGCTCTACGCCTACAA-3'；

组合物2：

正向引物SEQ ID No.4：5'-GTCGCGTTTTTCGTCGTT-3'

反向引物SEQ ID No.5：5'-CTAAACACACGACCGAAACG-3'

探针SEQ ID No.6：5'-CCCGCCTAACCCGCGCCC-3'；

组合物3:

正向引物SEQ ID No.7：5'-CGGGCGGAGTAGTTAGTGC-3'

反向引物SEQ ID No.8：5'-CTCCCGAACGAATCAAATTCC-3'

探针SEQ ID No.9：5'-CGCACCCGCACCGACCTCC-3'；和

组合物4:

正向引物SEQ ID No.10：5'-TTCGTTGAGAGCGTCGCG-3'

反向引物SEQ ID No.11：5'-GCGCAAAATCTACGCGAATAC-3'

探针SEQ ID No.12：5'-CCCACGTAAACGACGCGAACACG-3'。

6.一种用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1至5中任一项所述的组合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述消化道癌前病变和消化道癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述食管癌癌前病变和癌前疾病包括：慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述胃癌癌前病变和癌前疾病包括：萎缩性胃炎、息肉、胃溃疡、黄色素瘤、肠化生。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述肠癌癌前病变和癌前疾病包括：溃疡性结肠炎、大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病。

11.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌癌前病变和癌前疾病包括：肝硬化。

12.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述胰腺癌癌前病变和癌前疾病包括：粘液性囊腺瘤、胰腺炎、假囊肿、胰岛素瘤。

13.一种权利要求5-12中任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)采集人源样本；

b)从所述人源样本中提取游离DNA；

c)将所述DNA用亚硫酸氢盐转化；

d)进行PCR反应；

e)对所述PCR反应的产物进行结果判读。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述人源样本为自静脉中抽取的静脉血及血浆。

16.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物在制备用于筛查消化道患癌风险、消化道癌前病变和消化道癌前疾病的试剂盒中的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述癌前病变和癌前疾病为食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和胰腺癌癌前病变和癌前疾病中的一种或多种。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述食管癌癌前病变和癌前疾病包括：慢性食管炎、Barrett食管、食管白斑症、食管憩室、贲门失弛缓症、反流性食管炎。

19.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述胃癌癌前病变和癌前疾病包括：萎缩性胃炎、息肉、胃溃疡、黄色素瘤、肠化生。

20.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述肠癌癌前病变和癌前疾病包括：溃疡性结肠炎、大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病。

21.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述肝癌癌前病变和癌前疾病包括：肝硬化。

22.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述胰腺癌癌前病变和癌前疾病包括：粘液性囊腺瘤、胰腺炎、假囊肿、胰岛素瘤。

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