CN106222267A - 检测肝癌的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测SEPT9基因及其片段的至少一个区域内甲基化状态的核酸和用于检测血清中甲胎蛋白浓度的试剂，以通过所述基因及其片段的甲基化程度和甲胎蛋白的浓度来检测肝癌。本发明还提供了包括所述组合物的试剂盒。以及一种对肝癌进行体外检测的方法。因此，本发明利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SEPT9基因及其片段的检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，进一步地，本发明通过检测待测样品中甲胎蛋白的浓度，提供了一种准确的体外检测方法。

Description

检测肝癌的组合物及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测肝癌的组合物及其相应的试剂盒和用途。

背景技术

癌症是一类严重危及公共健康的疾病。世界卫生组织下属的国际癌症研究机构公布的有关全球癌症状况的最新数据(GLOBOCAN2012)显示：2012年全球新增约1,410万例癌症病例，癌症死亡人数达820万；与2008年的数据相比，2012年新增癌症病例增加11％，癌症死亡人数增加8.3％。该机构根据现有数据预计，由于全球人口增长和老龄化，到2025年前，全球每年新增癌症病例数将高达1,930万例。

由于近年来人口老龄化和人们生活方式的改变，我国的癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势。2013年全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》的数据显示：中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升；预计到2020年，中国每年的癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。

我国肝炎患者和长期饮用烈性酒的人群比例较高，导致肝癌成为我国一种高发恶性肿瘤疾病。全国肿瘤防治办公室数据显示：2015年，我国肝癌新发病例46.6万人，死亡42.2万人，位居我国常见癌症的第三位。肝癌的病死率(death-to-case ratio)达90％以上，是一种恶性程度很高的癌症。造成肝癌死亡率较高的一个重要因素是早期肝癌的确诊率低。早期肝癌缺乏明显和特异性的症状，绝大部分患者确诊时属于晚期，病灶多已发生转移。临床研究发现，从肝癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要几年时间，这为发现早期肝癌、提高早期肝癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。而肝癌的早期检测对其成功治愈具有重要的作用，因此如果充分利用这个窗口期，能够有效提高肝癌的治疗效果、极大的降低肝癌的死亡率。

目前用于肝癌检测的技术在早期肝癌的检测和筛查方面的应用非常有限：1)影像学检测技术(B超、CT、MRI等)设备成本高，操作技术要求强，检测成本高；2)组织活检的侵入性强，不适于早癌的筛查。并且这样的创伤性检测方式，给患者带来了非常大的生理病痛，因此患者不易接受。

血清肿瘤标记物(CEA，CA125，和CA199等)是近年发展起来的用于检测疾病的方法，虽然作为肝癌的无创检测方法具有一定的作用，但是由于其灵敏度较低，仍然无法充分满足临床检测需要。

在肝癌检测方面应用较广的血清标记物是甲胎蛋白(AFP)，其作为常用的肿瘤分子标记物，具有很好的检测特异性，但是只有60％左右的原发性肝癌患者出现AFP浓度上升的现象，也就是说，约有40％左右的肝癌患者的AFP是阴性的，并且在新发的病例中，AFP阴性肝癌的比例不断增加，AFP检测肝癌的特异性以及敏感度已经不能满足当前的需求。

多年研究证明，表观遗传学在癌症的发生、发展中起着极其重要的作用。作为表观遗传学的一种重要机制，DNA甲基化在多种肿瘤(肠癌、胃癌、肺癌等)中的调控得到了深入的研究。大量研究显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关联；细胞基因甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。其中，SEPT9基因，即人类Septin9基因，位于染色体17q25的AC068594内，为Septin基因家族的成员，与膜泡运输到胞质分裂的多种细胞功能相关。Septin9基因作为一种甲基化基因标记物在大肠癌的体外检测方面得到广泛应用。

基于此，当前对用于早期肝癌检测的敏感性高和特异性高的标记物存在需求，理想的肝癌标记物能在肝脏结节恶变的早期阶段即能敏感和特异性地检出。

发明内容

因此，针对现有技术存在的对AFP阴性的肝癌患者难以检测的问题，本发明提供了一种用于检测肝癌的组合物；本发明提供的组合物能够敏感和特异性地检测早期肝癌，包括AFP阴性的肝癌患者；本发明还提供了包含所述组合物的试剂盒以及其在检测肝癌中的用途。

本发明提供了一种用于检测肝癌的组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测SEPT9基因及其片段的至少一个区域内甲基化状态的核酸和用于检测血清中的甲胎蛋白浓度的试剂。通过判断所述SEPT9基因及其片段的甲基化程度和血清中的甲胎蛋白的浓度来联合检测肝癌。

优选地，所述SEPT9基因及其片段的至少一个区域包括选自所述SEPT9基因及其片段的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列，CpG的甲基化状态表明所述疾病的检测结果。更优选地，所述用于检测SEPT9基因及其片段的至少一个区域内甲基化状态的核酸包括等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ IDNO：1所示的序列的至少9个核苷酸的片段。

优选地，所述用于检测SEPT9基因及其片段中至少一个区域内甲基化状态的核酸为选自以下的引物和/或探针：

SEPT9引物F1:

SEQ ID NO：2：CCCACCAACCATCATAT

SEPT9引物R1:

SEQ ID NO：3：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT

SEPT9探针P1:

SEQ ID NO：4：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC

SEPT9探针P2:

SEQ ID NO：5：CGTTGATCGCGGGGTTC

优选地，所述组合物还包括将SEPT9基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂；更优选的试剂是亚硫酸氢盐。

优选地，所述用于检测血清中的甲胎蛋白浓度的试剂为酶联免疫吸附试剂(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)；更优选的，所述试剂为“三明治式”酶联免疫吸附试剂；进一步优选地，所述试剂包括AFP抗体包被的反应板、AFP酶结合物、底物液、洗液、终止液。

根据本发明的第二个方面，还提供了包括所述组合物的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括用于容纳待测生物样品的容器。

优选地，所述的试剂盒还包括使用和解释试剂盒结果的说明。

根据本发明的第三个方面，还提供了一种体外检测肝癌的方法，所述方法包括以下步骤：

1.分离待测生物样品中的SEPT9基因及其片段，确定所述SEPT9基因及其片段中至少一个区域内的甲基化状态；

2.收集待测生物样品的血清/血浆，并检测其中甲胎蛋白的浓度；

3.通过SEPT9基因及其片段的甲基化状态以及血清中的甲胎蛋白的浓度判断生物样品的状态。

根据某些优选实施方式，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5’位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即所述SEPT9基因及其片段的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面是可检测的；

3)将经步骤2)处理过的DNA样品与所述SEPT9基因及其片段的引物和扩增酶接触，使得所述经处理的基因被扩增以产生扩增产物或不被扩增；

4)用探针检测扩增产物；

5)基于所述扩增物是否存在以及存在的量，判断所述SEPT9基因及其片段的DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。

优选地，所述SEPT9基因及其片段的引物包括等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1的至少15个核苷酸的片段及其互补序列。

优选地，所述引物和/或探针如下所示：

SEPT9引物F1:

SEQ ID NO：2：CCCACCAACCATCATAT

SEPT9引物R1:

SEQ ID NO：3：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT

SEPT9探针P1:

SEQ ID NO：4：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC

SEPT9探针P2:

SEQ ID NO：5：CGTTGATCGCGGGGTTC

并且，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶、使用聚合酶链式反应(PCR)、产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。

所述个体的生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

优选的个体的生物样品为血清/血浆。

根据某些优选实施方式，所述SEPT9基因及其片段的DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定的。

根据某些优选实施方式，所述步骤2)中，使用ELISA试剂盒检测其中甲胎蛋白的浓度。

本发明中，发明人通过实验发现肝癌患者的SEPT9基因的甲基化状态和在正常人的所述基因的甲基化状态存在显著性差异：在肝癌患者人群中，SEPT9基因发生甲基化，而在正常人群中，SEPT9基因不发生甲基化，并且本发明的发明人发现，在原发性肝癌患者中，SEPT9基因甲基化状态与肝癌患者中的AFP浓度不相关，是独立于血清AFP的一项检测指标，同时本发明人惊奇地发现，将SEPT9与AFP联合用于作为肝癌的检测，极大地提高了肝癌检测的灵敏度和特异性，并且克服了AFP阴性的肝癌患者难以检测的问题。

因此本发明提供了一种通过检测样本中的SEPT9基因的甲基化状态联合待测样品中的甲肽蛋白浓度来对肝癌进行体外检测的方法，从而提供了一种无创的、快速、准确的肝癌筛查方法。

具体地，本发明利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SEPT9基因及其片段的检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，进一步地，联合待测样品血清中的甲胎蛋白水平，提供了一种准确的体外检测方法。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

本发明的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。

附图说明

本发明的上述及其它特征将通过下面结合附图及其详细描述作进一步说明。应当理解的是，这些附图仅示出了根据本发明的若干示例性的实施方式，因此不应被视为是对本发明保护范围的限制。除非特别说明，附图不必是成比例的，并且其中类似的标号表示类似的部件。

图1为肝癌、肝硬化和正常个体血浆样品中SEPT9基因甲基化状态的示意图，其中图1A示出了肝癌、肝硬化和正常个体血浆样品中SEPT9基因甲基化程度；图1B为图1A的散点图。

图2为AFP阴性和AFP阳性肝癌患者的SEPT9基因甲基化程度。

图3为使用SEPT9基因甲基化检测联合甲胎蛋白检测，提高肝癌患者检出率的方法示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种通过检测SEPT9基因的甲基化状态联合血清中的甲胎蛋白浓度来对肝癌进行体外检测的方法，其灵敏性和特异性高于目前临床常用的单独使用肝癌血清标记物AFP的检测方法；本发明进一步提供了一种通过检测SEPT9基因的甲基化状态来对肝癌血清标记物AFP阴性患者进行体外检测的方法，这是对现有肝癌体外检测方法是一项重要的补充，提高了肝癌体外检测的检出率。

下述为本发明的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。

在第一组实施方案中，公开了用于体外检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测SEPT9基因及其片段的至少一个区域内甲基化状态的核酸和用于检测血清中的甲肽蛋白浓度的试剂。通过所述甲基化检测结果联合甲胎蛋白的浓度水平对肝癌进行体外检测。

用于检测SEPT9基因及其片段中至少一个区域内甲基化状态的核酸序列包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1的连续序列的至少9个碱基的核酸序列。如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列提供了SEPT9基因的富含CpG的序列。

SEQ ID NO：1序列：

GGGAGTTGGTGGCCTCTCGCTGGTGCCATGGGACTCGCATGTTCGCCCTGCGCCCCTCGGCTCTTGAGCCCACAGGCCGGGATCCTGCCTGCCAGCCGCGTGCGCTGCCGTTTAACCCTTGCAGGCGCAGAGCGCGCGGCGGCGGTGACAGAGAACTTTGTTTGGCTGCCCAAATACAGCCTCCTGCAGAAGGACCCTGCGCCCGGGGAAGGGGAGGAATCTCTTCCCCTCTGGGCGCCCGCCCTCCTCGCCATGGCCCGGCCTCCACATCCGCCCACATCTGGCCGCAGCGGGGCGCCCGGGGGGAGGGGCTGAGGCCGCGTCTCTCGCCGTCCCCTGGGCGCGGGCCAGGCGGGGAGGAGGGGGGCGCTCCGGTCGTGTGCCCAGGACTGTCCCCCAGCGGCCACTCGGGCCCCAGCCCCCCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGCCCGGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCCATTCATTCAGCTGAGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGACCCCTAATCCAGGCGCCCTCCCGCTGAGAGCGCCGCGCGCCCCCGGCCCCGTGCCCGCGCCGCCTACGTGGGGGACCCTGTTAGGGGCACCCGCGTAGACCCTGCGCGCCCTCACAGGACCCTGTGCTCGTTCTGCGCACTGCCGCCTGGGTTTCCTTCCTTTTATTGTTGTTTGTGTTTGCCAAGCGACAGCGACCTCCTCGAGGGCTCGCGAGGCTGCCTCGGAACTCTCCAGGACGCACAGTTTCACTCTGGGAAATCCATCGGTCCCCTCCCTTTGGCTCTCCCCGGCGGCTCTCGGGCCCCGCTTGGACCCGGCAACGGGATAGGGAGGTCGTTCCTCACCTCCGACTGAGTGGACAGCCGCGTCCTGCTCGGGTGGACAGCCCTCCCCTCCCCCACGCCAGTTTCGGGGCCGCCAAGTTGTGCAGCCCGTGGGCCGGGAGCACCGAACGGACACA

如SEQ ID NO：2-5所示的序列提供了根据SEQ ID NO：1设计的引物和/或探针：

SEPT9引物F1:

SEQ ID NO：2：CCCACCAACCATCATAT

SEPT9引物R1:

SEQ ID NO：3：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT

SEPT9探针P1:

SEQ ID NO：4：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC

SEPT9探针P2:

SEQ ID NO：5：CGTTGATCGCGGGGTTC

在某些具体实施方式中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。例如，该试剂可以是亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰。其例如在调节转录、遗传印迹以及肿瘤发生中起作用。因此确认5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分有相当大的意义。但是，5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，例如在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应，由此在随后的碱性水解后，胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。但重要的是，在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。结果，原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性，现在可被充分利用了。因此，典型地，本发明提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用，用于确定SEPT9基因及其片段的序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。基因组CpG二核苷酸可被甲基化或未被甲基化(或者分别称为上和下甲基化(up-and down-methylated))。但是，本发明的方法适于分析异质的生物样品，例如血液或粪便中的低水平肿瘤细胞。因此，当分析这种样品中CpG位置的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG位置处的甲基化状态(例如百分比、份数、比率、比例或程度)，而不是甲基化状态。相应地，术语甲基化状况或甲基化状态还应被认为是指反映CpG位置处甲基化程度的值。

在某些实施方式中，本发明的方法具体包括：1)提取待测样品的基因组DNA；2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5’位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即所述SEPT9基因及其片段的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面是可检测的；3)将经步骤2)处理过的DNA样品与所述SEPT9基因及其片段的引物和扩增酶接触，使得所述经处理的基因被扩增以产生扩增产物或不被扩增；4)用探针检测扩增产物；5)基于所述扩增物是否存在以及存在的量，判断所述SEPT9基因及其片段的DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态；6)使用试剂检测待测样品中甲胎蛋白的水平。

典型地，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用聚合酶链式反应(PCR)；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。即，优选地用PCR方式来测定甲基化状态，诸如“基于荧光的实时PCR技术”、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA)等测定方法被用于测定SEPT9基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。其中，“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定，其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan)技术，在PCR步骤后不需要进一步的操作。简言之，“基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始，该混合样品根据标准操作(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶)在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增过程水平以及在荧光检测过程水平上产生序列差别。“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，在重叠特定的推定甲基化位点的荧光探针存在下，PCR反应提供了甲基化特异的扩增。用于输入DNA量的无偏移对照由以下反应提供：其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸。”基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用，如“TaqMan”、“Lightcycler”等等。TaqMan探针为荧光报道物(Reporter)和淬灭分子(Quencher)双标记的，并被设计为特异于相对高GC含量区，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时，其最终会遇到退火的TaqMan_探针。Taq聚合酶5’至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan_探针而顶替它，从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂(例如，可以在基于“基于荧光的实时PCR”的试剂盒中找到的)可以包括，但不限于：用于特定基因(或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；TaqMan或Lightcycler探针；优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。

并且，具体而言，在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

在第一步中，获得待分析的组织样品。该来源可以是任何适合的来源，例如细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液分离的细胞及其所有可能的组合。

优选地，DNA的所述来源为粪便或体液，选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、分离自血液的细胞。然后从所述样品分离基因组DNA。可通过现有技术中的任何标准手段来分离，包括使用可商购的试剂盒。简言之，当目的DNA被包裹在细胞膜中时，该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液回收基因组DNA。这可以通过各种方法来实现，包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA的量。当所述样品DNA未被包裹在细胞膜中时(例如来自血液样品的循环DNA)，可以使用现有技术中分离和/或纯化DNA的标准方法。这些方法包括使用蛋白降解试剂，例如离液盐，如盐酸胍或脲；或去污剂，如十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化氰。其它方法包括但不限于乙醇沉淀或丙醇沉淀、通过离心的真空浓缩等。本领域技术人员也可以利用装置，例如诸如超滤的滤器，硅表面或膜，磁性颗粒，聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯表面，带正电荷的表面以及带阳性电荷的膜，带电膜，带电表面，带电转换膜，带电转换表面。

一旦核酸被提取，就将基因组双链DNA用于分析。在所述方法的第二步中，将所述基因组DNA样品处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。这应被理解为本文所述的“预处理”或“处理”。这优选通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现。术语“亚硫酸氢盐试剂”指包括亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐(disulfite)、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如这里所公开的可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。优选地，该亚硫酸氢盐处理在变性溶剂存在下进行，所述变性溶剂诸如但不限于正烷基二醇，尤其是二乙二醇二甲基醚(DME)，或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行。在优选的实施方案中，所述变性溶剂以1％至35％(v/v)的水平使用。还优选该亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，例如但不限于色原烷衍生物，如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基色原烷2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物，例如没食子酸。该亚硫酸氢盐转变优选在30℃至70℃的反应温度下进行，其中在反应期间温度短时间地增加至超过85℃。经亚硫酸氢盐处理的DNA优选在定量之前进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行，例如但不限于超滤，优选通过Microcon^(TM)柱(由Millipore^(TM)生产)进行。

在所述方法的第三步中，采用本发明的引物核苷酸以及扩增酶扩增经处理的DNA的片段。可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增。通常，该扩增反应采用聚合酶链式反应(PCR)进行。优选地，所述扩增产物的长度为100至2,000个碱基对。对于SEPT9基因及其片段的甲基化的检测，利用针对SEPT9基因的引物和探针。例如：

SEPT9引物F1:

SEQ ID NO：2：CCCACCAACCATCATAT

SEPT9引物R1:

SEQ ID NO：3：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT

SEPT9探针P1:

SEQ ID NO：4：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC

SEPT9探针P2:

SEQ ID NO：5：CGTTGATCGCGGGGTTC

通过扩增获得的片段可携带有可直接或间接地检测的标记物。优选的是，标记物为荧光标记物、放射性核素或可附着的分子片段的形式。

在所述方法的第四步中，分析在所述方法的第三步中获得的扩增产物，以便确定处理之前CpG二核苷酸的甲基化状态。在第四步中，对扩增产物的检测是通过实时检测探针来进行。在本发明中，可以利用各种商业用实时PCR仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方式，在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR的检测。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400uM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的2μl至100μl的体积。在85至99℃持续3-60分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在50至72℃进行1至30秒的35-55个循环的退火，在45至80℃下退火5至90秒，在85至99℃下变性5至90秒。通过仅仅在甲基化的SEPT9基因片段上观测扩增，用与含5-甲基胞嘧啶的SEPT9基因的CpG岛区域的特异性的探针检测所述基因片段。并且，在某些具体实施方式中，以β肌动蛋白基因(ACTB)作为PCR的内参，通过使用与β肌动蛋白基因序列互补的引物来创建β肌动蛋白基因扩增子，并且用特定的探针检测β肌动蛋白基因扩增子。每个样品进行至少一次的实时PCR，在某些具体实施方式中，进行两次或三次实时PCR检测。

在所述方法的第五步中，分别体现所述SEPT9基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后比较所测样本的SEPT9基因所对应的PCR的Ct值与SEPT9基因的预先设定的cut off值，从而确定基于BNC1基因的分析结果是否为阳性，结果确定所述样本的最终分析结果是正常、还是肝癌。

根据本发明的具体实施方式，基于一定数量的肝癌样本和正常样本的SEPT9基因的平均Ct值，确定相对于SEPT9基因的肝癌和正常的临界Ct值。并且，本发明还允许使用不同的方法学来分析Ct值。例如，使用ΔCt或dCT，肌动蛋白Ct作为PCR内部对照，SEPT9基因的Ct减去肌动蛋白的Ct得到SEPT9基因的dCT值。相应地，如果采用ΔCt或dCT作为检测标准，那么在所述方法的第五步中，分别体现所述SEPT9基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后比较所测样本的SEPT9基因所对应的PCRΔCt值与SEPT9基因的预先设定的Δcut值(即临界Ct值)。

第六步，检测待分析样品的血清/血浆中的甲胎蛋白水平。根据本发明的具体实施方式，基于一定数量的肝癌样本和正常样本的AFP的平均浓度值，确定肝癌和正常的AFP临界值。

从而确定基于SEPT9基因甲基化和AFP浓度的分析结果是正常、还是肝癌，结果确定所述样本的最综分析结果是正常、还是肝癌。

综上所述，本发明通过以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，通过联合利用分别用于检测SEPT9基因及其片段的甲基化的核酸序列和用于检测AFP的试剂，实现了利用SEPT9基因甲基化生物标记物和AFP来对肝癌进行体外检测，从而有效提高了肝癌体外检测的灵敏度和特异性。

以下将详述具体的实施例。

实施例一：SEPT9基因的甲基化DNA检测。

对肝癌、肝病和正常人进行检测。对于SEPT9使用的探针和引物，可以参照现有技术，例如在中国专利CN101160411A中记录的探针和引物(相当于本发明的SEQ ID NO：2-5)

本实施例包括以下步骤：

首先，得到15例肝癌患者、24例肝病患者(代偿期和失代偿期各12例)和10例正常人的血浆样本。所有样品来源于博尔诚公司。然后提取肝癌和正常人的基因组DNA，并对所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的提取和亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒提取的。

然后，上述经过处理的15例肝癌患者、24例肝病患者、和10例正常人的DNA样本中加入上述的SEPT9基因引物、探针组合和内参基因ACTB基因引物、探针组合，通过PCR检测SEPT9基因的甲基化状态。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，分别测得15例肝癌患者、24例肝病患者、和10例正常人的DNA样本对于SEPT9基因的实时PCR的Ct值。检测结果显示：1)SEPT9基因的甲基化在肝癌患者中显著高于正常人，p＝0.0001(费舍尔精确检验，Fisher’sExact Test)(图1A)；2)SEPT9基因的甲基化在肝癌患者中显著高于肝硬化患者(包括代偿期和失代偿期)，p＝0.0004(费舍尔精确检验，Fisher’s Exact Test)(图1A)；3)随着肝癌的发展，从正常，到代偿期肝硬化患者，到失代偿期肝硬化患者，最终到肝癌患者，SEPT9基因的甲基化呈上升趋势(图1B)。在该实施例中，当以Ct值38为临界值时，SEPT9基因甲基化检测肝癌的灵敏度是80％，如果联合AFP检测，则灵敏度提高至93.3％。高于目前常用的血清标记物AFP检测肝癌的灵敏度(66.7％)。上述实验结果表明了SEPT9基因甲基化DNA是肝癌的一种标记物，其对肝癌的灵敏度高于目前临床常用的肝癌血清标记物AFP，当其与血清标记物AFP联合时，能极大提高肝癌的检出率，因此通过本发明的SEPT9基因甲基化DNA检测联合血清标记物AFP浓度检测，可以对肝癌进行体外检测。

实施例二：SEPT9基因的甲基化DNA检测，对AFP阴性肝癌患者进行检测

首先，得到15例肝癌患者的血浆样本。所有样品来源于博尔诚公司。然后提取肝癌患者血浆样本的基因组DNA，并对所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的提取和亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒提取的。然后，上述经过处理的15例肝癌患者的DNA样本中加入上述的SEPT9基因引物、探针组合和内参基因ACTB基因引物、探针组合，通过PCR检测SEPT9基因的甲基化状态。其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在LifeTechnologies仪器(7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。最后，分别测得15例肝癌患者的DNA样本对于SEPT9基因的实时PCR的Ct值。

同时，对这15例肝癌患者的血清样本进行血清标记物检测AFP检测。

检测结果显示：1)肝癌患者的SEPT9基因甲基化与肝癌患者的AFP浓度不相关，是独立于血清AFP的一项检测指标(图2：在AFP阳性和AFP阴性的肝癌患者中，SEPT9基因甲基化阳性率均为80％)；2)通过对AFP阴性的肝癌患者进行SEPT9基因甲基化的检测，可以提高肝癌患者的检出率：从66.7％提高至93.3％。

实验结果表明了SEPT9基因甲基化与肝癌患者的AFP浓度不相关，是独立于血清AFP的一项检测指标；通过本发明的对AFP阴性患者进行SEPT9基因的甲基化DNA检测，可以显著提高对肝癌进行体外检测的检出率(图3)。

实施例三：肝癌患者的多种标记物联检

肝癌的发病机制、发病过程、临床表现等方面具有高度异质性。因此使用单一标识物进行检测的效果不理想。基于此，发明人通过对多种标识物联检，进行肝癌检测。

首先，得到10例肝癌患者的血浆样本。所有样品来源于博尔诚公司。然后，对这15例肝癌患者的血清样本进行血清标记物检测，分别检测了CEA、CA125和AFP三种不同的血清标记物，同时进行了SEPT9甲基化检测，该SEPT9甲基化检测的方法如实施例1和实施例2所示。

提取肝癌患者血浆样本的基因组DNA，并对所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的提取和亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒提取的。然后，上述经过处理的15例肝癌患者的DNA样本中加入上述的SEPT9基因引物、探针组合和内参基因ACTB基因引物、探针组合，通过PCR检测SEPT9基因的甲基化状态。其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。最后，分别测得15例肝癌患者的DNA样本对于SEPT9基因的实时PCR的Ct值。

检测结果如表1所示，从表1中可以得知，CEA和CA125相比，SEPT9甲基化和AFP联检对于肝癌具有更好的检测效果。

表一：肝癌患者的多标记物联检

	SEPT9	CEA	CA125	AFP
					1	+	-	-	-
2	-	-	-	-
					3	+	-	+	-
4	+	-	+	+
					5	+	-	+	+
6	+	-	-	+
					7	+	-	-	+
8	+	-	+	+
					9	+	-	-	+
10	+	-	-	+
					阳性数	9	0	4	7

通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SEPT9基因的检测，并且能根据实时PCR的CT值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，同时检测联合血清标记物AFP浓度检测，可以对肝癌进行高灵敏性的体外检测，从而提供了一种无创性的快速的癌症的体外检测方法。

尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。

Claims (9)

1.一种用于检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测SEPT9基因及其片段的至少一个区域内甲基化状态的核酸和用于检测血清中的甲胎蛋白浓度的试剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述SEPT9基因及其片段的至少一个区域包括选自所述SEPT9基因及其片段的至少15个核苷酸的片段，其中，所述核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述用于检测SEPT9基因及其片段的至少一个区域内甲基化状态的核酸包括等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ IDNO：1所示的序列的至少9个核苷酸的片段。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测SEPT9基因及其片段中至少一个区域内甲基化状态的核酸为选自以下的引物和/或探针：

SEPT9引物F1:

SEQ ID NO：2：CCCACCAACCATCATAT

SEPT9引物R1:

SEQ ID NO：3：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT

SEPT9探针P1:

SEQ ID NO：4：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC

SEPT9探针P2:

SEQ ID NO：5：CGTTGATCGCGGGGTTC。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括将SEPT9基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述试剂是亚硫酸氢盐。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测血清中的甲胎蛋白浓度的试剂为酶联免疫吸附试剂(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)；优选的，所述试剂为“三明治式”酶联免疫吸附试剂；更优选地，所述试剂包括AFP抗体包被的反应板、AFP酶结合物、底物液、洗液、终止液。

8.一种用于检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-6中任一项所述的组合物；

优选地，所述试剂盒还包括用于容纳待测生物样品的容器。

优选地，所述的试剂盒还包括使用和解释试剂盒结果的说明。

9.如权利要求1-7中任一项所述的组合物在制备用于检测肝癌的试剂盒中的用途。