CN115786350A

CN115786350A - 一种特异性识别并结合外周血t淋巴细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用

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Publication number: CN115786350A
Application number: CN202210977686.4A
Authority: CN
Inventors: 谭蔚泓; 彭天欢; 叶茂; 邱丽萍; 李小东; 王田田
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2022-08-16
Filing date: 2022-08-16
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2042-08-16
Also published as: CN115786350B

Abstract

本发明公开了一种特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用。本发明通过Cell‑SELEX技术筛选获得的核酸适体XD‑10可特异性识别且高亲和力结合T淋巴细胞。该核酸适体可以作为高效的分子识别探针，实现外周血T淋巴细胞的高效捕获。本发明还设计了核酸适体的互补序列，利用互补序列间的特异性杂交作用，抑制核酸适体功能活性二级结构的形成，从而实现核酸适体探针及磁珠从细胞表面解离，达到无痕分选的目的。本发明在实现外周血T淋巴细胞高效捕获的前提下，有效降低了外源性物质对于细胞活性、T细胞扩增、激活等下游应用的影响，在免疫诊断和免疫治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

一种特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用

技术领域

本发明属于细胞分离技术领域，具体涉及一种特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用。

背景技术

T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分，通过直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体以及产生细胞因子等生物学功能，形成人体抵御疾病感染、肿瘤形成的重要防线。T淋巴细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞，按其功能可分为三个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。人体外周血中T淋巴细胞及其亚型的数量、比值变化、T细胞表面蛋白表达水平是诊断免疫性疾病、病毒性感染及肿瘤等疾病的重要临床依据。

外周血中T淋巴细胞的特异性分选是实现基于T淋巴细胞的免疫诊断和免疫治疗的前提条件。目前，临床上外周血中T淋巴细胞分选主要依赖抗体标记免疫磁珠法，可分为阳性分选法和阴性分选法两大类。阳性分选法采用免疫磁珠直接标记目的细胞，具有较高的分离效率和细胞纯度。然而，外源性抗体、磁珠等物质残留在目的细胞表面，易对其下游应用带来较大干扰和安全性问题。阴性分选法采用免疫磁珠标记非目的细胞，通过去除非目的细胞的方法实现富集目的。该方法有效地避免了外源性物质的干扰，但是细胞纯度较低，且需要大量单克隆抗体，成本昂贵。此外，单克隆抗体分子复杂的生产过程、批次差异、苛刻的保存及运输条件，也是导致其较低富集效率、较高成本的关键因素。因此，开发高效率、高纯度的细胞无痕分选技术是T淋巴细胞临床分选的迫切需求。

核酸适体(Aptamer)是利用指数富集配体系统进化技术(System Evolution ofLigands by Exponential Enrichment；SELEX)从核酸文库中筛选得到的一类能高特异性、高亲和力结合靶标的单链DNA/RNA序列。核酸适体与其靶标分子的识别和结合具有类似抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力，被形象的称为“化学家的抗体”。此外，核酸适体具有靶标范围广、易于精准制备及修饰标记、设计灵活可控、制造成本低等突出优点，在化学传感、分子医学等领域具有广泛的应用与独特的优势。

本发明直接以临床外周血单个核细胞复杂样本为筛选靶标，通过Cell-SELEX技术筛选获得的核酸适体XD-10可特异性识别且高亲和力结合T淋巴细胞，而与外周血中的其它血细胞作用较弱。该核酸适体可以作为高效的分子识别探针，特异性识别并结合外周血中的T淋巴细胞，实现外周血T淋巴细胞的高效捕获。本发明还设计了核酸适体的互补序列，利用互补序列间的特异性杂交作用，抑制核酸适体功能活性二级结构的形成，从而实现核酸适体探针及磁珠从细胞表面解离，达到无痕分选的目的。本发明在实现外周血T淋巴细胞高效捕获的前提下，有效降低了外源性物质对于细胞活性、T细胞扩增、激活等下游应用的影响，在免疫诊断和免疫治疗领域具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种高特异性、高亲和力的外周血T淋巴细胞核酸适体作为分子探针。

一种特异性识别并结合外周血中T淋巴细胞的核酸适体，能特异性识别并结合外周血T淋巴细胞；所述的核酸适体XD-10序列如下：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGTTGACAAGGTGCTAAACGTTACCTTCGGTATCTTCGACAACGCCTGGACACGGTGGCTTAGT-3’。

进一步地，所述的特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的核酸适体，通过对所述的核酸适体XD-10增加或者删减碱基，或者碱基替换，可获得具有相同功能的核酸适体；优选核酸适体XD-10截短成XD-10a，其序列为：

5’-TCCAGAGTGACGCAGCAGTTGACAAGGTGCTAAACGTTACCTTCGGTATCTTCGACAACGCCTGGACACTCTGGC-3’。

进一步地，通过对所述的核酸适体标记上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，获得与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。

本发明的第二个目的是提供所述的核酸适体在制备特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种基于核酸适体的外周血T淋巴细胞特异性识别与富集方法；所述核酸适体包括上述的核酸适体。

本发明的第四个目的是提供一种基于互补序列的外周血T淋巴细胞无痕释放方法，利用互补释放序列释放被所述的核酸适体XD-10序列识别与富集的外周血T淋巴细胞，所述核酸适体XD-10序列如下：

优选：所述互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’。

进一步地，通过对所述的核酸适体或互补释放序列增加或者删减碱基，或者碱基替换，可获得具有相同功能的核酸适体或互补释放序列。

本发明的第五个目的是提供一种互补释放序列在制备无损释放被核酸适体捕获的外周血T淋巴细胞的制剂中的应用，其特征在于，所述的互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’；

所述核酸适体XD-10序列如下：

本发明的第六个目的是提供一种无损释放被核酸适体捕获的外周血T淋巴细胞的互补释放序列，所述的互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’；

所述核酸适体XD-10序列如下：

本发明的第七个目的是提供一种无损释放被核酸适体捕获的外周血T淋巴细胞的制剂，包括所述的互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’；

所述核酸适体XD-10序列如下：

本发明的高特异性、高亲和力的外周血T淋巴细胞核酸适体分子探针获得方案如下：

1)采用临床外周血中单个核细胞复杂样本作为筛选靶标，有效排除细胞系与临床实际样本间的差异，增强筛选核酸适体探针在复杂临床体系的适用性。

2)以临床外周血中单个核细胞复杂样本进行竞争筛选，提供一种可满足临床需求的体外筛选压力，通过富集复杂样本中特异性结合T淋巴细胞的序列，大大提高筛选序列的特异性。

3)通过高通量测序及生物信息学分析，成功获得T淋巴细胞特异性核酸适体探针XD-10，其详细序列如下：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGTTGACAAGGTGCTAAACGTTACCTTCGGTATCTTCGACAACGCCTGGACACGGTGGCTTAGT-3’

4)核酸适体XD-10经截短优化，成功获得特异性高、亲和力强、结构稳定的T淋巴细胞核酸适体探针XD-10a，其详细序列如下：

本发明的基于上述核酸适体的灵敏度高、特异性强、操作简便的外周血中T淋巴细胞无痕分选方法。具体实施方案如下：

一、外周血采集与预处理

1)采用EDTA-K₂真空抗凝采血管采集患者外周血10mL，12h内送达实验室。

2)通过密度梯度离心或红细胞选择性裂解去除大量成熟红细胞，获得外周血单个核细胞(PBMCs)。

二、核酸适体合成及修饰

通过自动化固相合成技术合成5’-末端生物素修饰的核酸适体序列(命名为XD-10-biotin)。

三、外周血T淋巴细胞富集

1)取适量的核酸适体XD-10-biotin，95℃加热5min，置于4℃冷却10min；

2)将PBMCs用Binding Buffer重悬，加入适量预备好的XD-10-biotin，4℃振荡孵育30min，使核酸适体与T淋巴细胞充分结合；

3)离心去除过量未结合的核酸适体探针，加入Washing Buffer离心洗涤两次；

4)加入抗生物素抗体(或链霉亲和素)标记的磁珠进行孵育，使得核酸适体结合的细胞标记上磁珠，通过磁分选分离富集外周血单个核细胞中的T淋巴细胞。

四、捕获的T淋巴细胞无损释放

向磁分选富集的细胞中加入适量互补序列，静置反应30min，通过核酸分子间的互补配对作用，破坏核酸适体的二级结构，从而实现捕获的T淋巴细胞的无痕释放。

五、无痕分选T细胞的分析与表征

1)采用多标志物免疫荧光标记，通过流式、激光共聚焦荧光显微镜表征分选T淋巴细胞的效率、纯度和亚型等；

2)对于无痕分选的T淋巴细胞通过台盼蓝染色表征细胞活性。

本发明相对现有技术的优势：1)提供了一种性能优异的外周血T淋巴细胞捕获核酸适体探针，并建立了基于核酸适体的新型外周血T淋巴细胞无痕分选方法，具有广泛的应用潜力；2)采用临床复杂样本作为筛选靶标并引入竞争筛选，大大提高了所获得的核酸适体的特异性和临床适用性；3)核酸适体具有易精准合成及修饰、质量可控，批次间差异小、性质稳定，易存储运输、制备成本低，可规模化生产等应用优势；4)发展了基于互补核酸序列的无损细胞释放方法，大大降低了捕获过程对于细胞的损伤和对下游分析的影响；5)为发展基于T淋巴细胞的细胞免疫疗法提供了新的方法与途径，具有重要的临床意义。

附图说明

图1核酸适体XD-10结合外周血中CD4+和CD8+ T细胞的流式和共聚焦表征。

图1A为流式分析核酸适体XD-10结合外周血中CD4+T细胞以及CD4-细胞情况。

图1B为共聚焦分析核酸适体XD-10结合外周血中CD4+ T细胞情况。

图1C为流式分析核酸适体XD-10结合外周血中CD8+ T细胞以及CD8-细胞情况。

图1D为共聚焦分析核酸适体XD-10结合外周血中CD8+ T细胞情况。

图2核酸适体XD-10结合外周血中T淋巴细胞亚群分析。

图2A为流式分析核酸适体XD-10结合外周血中CD3+/CD4+T细胞和CD3+/CD8+T细胞情况。

图2B为核酸适体XD-10结合外周血中CD3+/CD4+T细胞和CD3+/CD8+T细胞统计分析。

图3核酸适体XD-10结合外周血中T淋巴细胞亚群的普适性和特异性分析。

图3A为流式分析核酸适体XD-10结合外周血中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞情况。

图3B为核酸适体XD-10结合外周血中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞统计分析。

图3C为流式分析核酸适体XD-10结合外周血中成熟红细胞情况。

图3D为核酸适体XD-10结合外周血中成熟红细胞统计分析。

图4核酸适体XD-10结合外周血中T淋巴细胞表观解离常数(Kd)分析。

图5核酸适体XD-10序列的截短与优化分析。

图5A为核酸适体XD-10二级结构模拟分析。

图5B为核酸适体XD-10和XD-10a结合外周血T淋巴细胞分析。

图5C为核酸适体XD-10和XD-10a结合外周血T淋巴细胞靶标一致性分析。

图6核酸适体XD-10捕获外周血中T淋巴细胞效率、纯度和细胞活性分析。

图6A为核酸适体XD-10捕获外周血中T淋巴细胞效率分析。

图6B为核酸适体XD-10捕获细胞纯度分析。

图6C为核酸适体XD-10捕获细胞的活性分析。

图7核酸适体XD-10互补序列无痕释放效率、纯度和细胞活性分析。

图7A为互补序列10-RA1无痕释放效率分析。

图7B为互补序列10-RA1无痕释放细胞的纯度分析。

图7C为互补序列10-RA1无痕释放细胞的活性分析。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明中所用试剂：

SEPMATE^TMTUBE(STEMCELL)、Lymphoprep,250mL(STEMCELL)、PBMC高效离心管，15mL(TBD)、CD4Microbeads,human(Miltenyi)、CD8 Microbeads,human(Miltenyi)、LSSeparation columns(Miltenyi)、Anti-Biotin Microbeads(Miltenyi)、Hu CD3 BV421SK7(BD)、Hu CD8 PE HIT8a(BD)、PE Mouse FITC anti-human CD4(Biolegend)。

本发明中所配制试剂：

Washing Buffer：称取0.5082g六水氯化镁，2.25g葡萄糖，加入30mL DPBS，溶解，加入剩余的470mL DPBS中，4℃保存。

Binding Buffer：称取0.01g BSA，加入10mL Washing buffer，再加入100μL tRNA(100mg/mL)，漩涡震荡，充分溶解，4℃保存。

10×ACK Lysis Buffer：称取40.118g NH₄Cl，5g KHCO₃，0.186g EDTA-Na₂，加入30mL无菌水，溶解，再加入470mL无菌水中，调节pH为7.20，4℃保存。使用时，直接使用无菌水稀释成1×ACK Lysis Buffer即可。

本发明中所用仪器：

AL204电子天平(Mettler Toledo)、Centrifuge 5418R台式离心机(Eppendorf)、DxP Athena^TM流式细胞仪(Cytek)、Nikon共聚焦双光子显微镜(Nikon)。

实施例1：核酸适体XD-10结合外周血中CD4+和CD8+ T细胞的流式和共聚焦表征。

1).由专业的医护人员从医院采集患者外周血4-8mL，K₂-EDTA抗凝，并颠倒混匀，防止血液凝固，常温运输至实验室。

2).通过密度梯度离心分离获得外周血中的PBMCs，加入适量样本稀释液(DPBS，含1％FBS)至终体积为10mL，充分颠倒混匀后，离心(300g、5min、25℃)沉淀细胞，弃尽上清，之后再加入10mL样本稀释液洗涤一遍，并收集PBMCs，置于冰上备用。

3).分别使用CD4Microbeads和CD8 Microbeads磁分选获得PBMCs中的CD4+ T淋巴细胞和CD4-细胞，以及CD8+ T淋巴细胞和CD8-细胞，之后使用Binding Buffer重悬各部分细胞并计数。

4).设置样品分组，每个样品细胞数量为3×10⁵个，体系为125μL。

5).向其中的样品中加入1.25μL CD3、2μL CD4、10μL CD8 Antibody分析磁分选获得的CD4+ T淋巴细胞和CD4-细胞，以及CD8+ T淋巴细胞和CD8-细胞亚群组成。同时，向其它分组细胞样品中加入100nM终浓度的XD-10(cy5)，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育35-40min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。

6).孵育结束之后，再加入200μL Washing Buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing Buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检测细胞的荧光强度。

流式结果图1所示，一方面，外周血PBMCs中主要包含粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，而杀伤性T淋巴细胞(CD8+ T细胞)和辅助性T淋巴细胞(CD4+ T细胞)是T淋巴细胞中的两个主要亚群，CD8蛋白是杀伤性T淋巴细胞的特异性标志物，CD4蛋白则是辅助性T淋巴细胞的特异性标志物。所以，商业化的杀伤性T淋巴细胞磁分选磁珠(CD8 Microbeads)和辅助性T淋巴细胞磁分选磁珠(CD4Microbeads)可以特异性分离富集PBMCs中的杀伤性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。另一方面，CD3为淋巴细胞中总T淋巴细胞标志物，CD8为杀伤性T淋巴细胞标志物，CD4为辅助性T淋巴细胞标志物，可用于流式分析T淋巴细胞亚群组成。所以，这里使用CD8 Microbeads成功分离获得高纯度的CD8+ T细胞，而在磁分选流出细胞(CD8-细胞)中几乎不含有CD8+ T细胞。同时，核酸适体XD-10特异性结合部分CD8+ T细胞，与共聚焦结果一致。此外，CD4Microbeads可以成功分离获得高纯度的CD4+ T细胞，而在磁分选流出细胞(CD4-细胞)中几乎不含有CD4+ T细胞。同时，核酸适体XD-10特异性结合CD4+ T细胞，与共聚焦结果一致。

实施例2：核酸适体XD-10结合外周血中T淋巴细胞亚群分析。

3).设置样品分组，每个样品细胞数量为4×10⁵个，体系为125μL。

4).向其中的分组样品中加入1.25μL CD3、2μL CD4、10μL CD8 Antibody，同时100nM终浓度的XD-10(cy5)，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育35-40min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。

5).孵育结束之后，再加入200μL Washing Buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing Buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检测细胞的荧光强度。

流式结果图2所示，一方面，外周血PBMCs中主要包含粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，而淋巴细胞中主要包括T细胞、B细胞、NK细胞等。其中杀伤性T淋巴细胞(CD8+ T细胞)和辅助性T淋巴细胞(CD4+ T细胞)是T淋巴细胞中的两个主要亚群。另一方面，CD3为淋巴细胞中总T淋巴细胞标志物，CD8为杀伤性T淋巴细胞标志物，CD4为辅助性T淋巴细胞标志物，可用于流式分析T淋巴细胞亚群组成。这里，首先使用CD3(BV421)、CD4(FITC)、CD8(PE)分析PBMCs中杀伤性T淋巴细胞(CD3 CD8+ T细胞)和辅助性T淋巴细胞(CD3CD4+ T细胞)的比例。同时，加入核酸适体XD-10(cy5)分析核酸适体靶向的细胞亚群比例，即(XD-10+cell)。最后，通过四色流式分析核酸适体XD-10靶向的细胞亚群与CD3 CD8+ T细胞或CD3 CD4+ T细胞重合比例，从而判断核酸适体所结合的T淋巴细胞亚群。因此，从流式分析结果中可以看到，核酸适体特异性结合部分CD3 CD4+ T细胞和部分CD3 CD8+ T细胞，也就是说核酸适体特异性结合T淋巴细胞亚群。

实施例3：核酸适体XD-10结合外周血T淋巴细胞亚群的普适性和特异性分析。

1).由专业的医护人员从医院随机采集多例患者外周血4-8mL，K₂-EDTA抗凝，并颠倒混匀，防止血液凝固，常温运输至实验室。

2).首先，保留100μL全血，即成熟的红细胞样品。剩余外周血通过密度梯度离心分离获得外周血中的PBMCs(主要包含淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)，加入适量样本稀释液(DPBS，含1％FBS)至终体积为10mL，充分颠倒混匀后，离心(300g、5min、25℃)沉淀细胞，弃尽上清，之后再加入10mL样本稀释液洗涤一遍，并收集PBMCs，置于冰上备用。

3).设置样品分组，包括全血样品和PBMCs，每个样品细胞数量为5×10⁵个，体系为125μL。

4).向其中的分组样品中加入100nM终浓度的XD-10(FAM)，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育35-40min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。

在实施例1和实施例2中，已经证明核酸适体XD-10特异结合T淋巴细胞亚群，这里进一步分析核酸适体的临床普适性和特异性。流式结果图3所示，对于随机采集的不同患者外周血样品，XD-10特异性结合淋巴细胞中的T淋巴细胞，而不结合其它血细胞，包括单核细胞，粒细胞以及成熟的红细胞。

实施例4：核酸适体XD-10结合人周血中T淋巴细胞表观解离常数(Kd)分析。

3).使用CD4Microbeads和CD8 Microbeads磁分选同时获得PBMCs中的CD4+和CD8+T淋巴细胞，使用Binding Buffer重悬并计数。

4).设置样品分组，每组样品设置核酸适体的浓度梯度为0、25、50、100、150、250、400、600nM，而且每个浓度梯度设置3个样品，每个样品细胞数量为3×10⁵个，体系为200μL。

5).分别向每组细胞样品中加入相应的浓度的XD-10，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。

6).孵育结束之后，再加入200μL Washing Buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing Buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检測细胞的荧光强度并计算Kd值。

图4结果表明核酸适体XD-10与T淋巴细胞具有相当高的亲和力，其Kd值为2.11±1.86nM。

实施例5：核酸适体XD-10序列的截短与优化分析。

1).核酸适体XD-10序列的截短、优化是基于其折叠形成的二级结构(NUPACK)，并对两端的引物序列进行适当的截短和碱基替换优化。这里将核酸适体XD-10(81nt)截短优化成XD-10a(75nt)，进行合成并标记FAM荧光，用于验证与外周血中T淋巴细胞的结合能力，同时验证截短优化之后的序列是否依然与原来序列结合一致的靶标。

2).由专业的医护人员从医院采集患者外周血4-8mL，K₂-EDTA抗凝，并颠倒混匀，防止血液凝固，常温运输至实验室。

3).通过密度梯度离心分离获得外周血中的PBMCs，加入适量样本稀释液(DPBS，含1％FBS)至终体积为10mL，充分颠倒混匀后，离心(300g、5min、25℃)沉淀细胞，弃尽上清，之后再加入10mL样本稀释液洗涤一遍，并收集PBMCs，置于冰上备用。

4).设置样品分组，每个样品细胞数量为3×10⁵个，体系为200μL。

5).分别向每组细胞样品中加入50nM浓度的XD-10(FAM)、XD-10a(FAM)，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育35-40min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。

6).同时，向剩余的分组样品中加入50nM终浓度的XD-10a(FAM)和1μM终浓度的XD-10(未做修饰)，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育35-40min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。通过竞争性结合实验，验证XD-10a是否与原来序列结合一致的靶标。

7).孵育结束之后，再加入200μL Washing Buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing Buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检测细胞的荧光强度。

图5表明核酸适体XD-10a与原来序列依然保持相当的结合能力。同时，核酸适体XD-10a与原来序列结合一致的靶标。

实施例6：核酸适体XD-10捕获外周血中T淋巴细胞效率、纯度和细胞活性分析。

3).设置样品分组，分别向每组细胞样品中加入相应的核酸适体至终浓度为50nM，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育35-40min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。同时，设置阳性对照样品，即使用CD4Microbeads和CD8 Microbeads分离PBMCs中的CD4+和CD8+ T细胞。

4).孵育结束之后，25℃，300g；5min离心，弃尽上清，并洗涤细胞1次，之后加入Anti-biotin MicroBeads，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育30min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。

5).孵育结束之后，通过磁分选获得核酸适体、CD4和CD8 Antibody捕获分离的各部分细胞，同时进行多标志物免疫荧光抗体特异性标记其中的T淋巴细胞，并分析捕获效率、捕获纯度。

6).同时通过台盼蓝染色分析核酸适体、CD4和CD8 Antibody捕获分离细胞的细胞活性。

图6结果表明，核酸适体XD-10捕获T淋巴细胞效率达47.02％，其中CD3+/CD4+ T细胞和CD3+/CD8+ T细胞纯度达84.08％，捕获细胞的细胞活性达92.61％。

实施例7：核酸适体XD-10互补序列无痕释放效率、纯度和细胞活性分析。

3).设置样品分组，分别向每组细胞样品中核酸适体XD-10至终浓度为50nM，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育35-40min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。

5).孵育结束之后，通过磁分选富集核酸适体XD-10捕获的T淋巴细胞。之后，分别向分选柱中加入50倍浓度的互补序列10-RA1(500μL)，室温孵育35-40min。向分选柱中加入9mL Washing Buffer，3mL/次，洗涤互补序列竞争释放的T淋巴细胞，同时收集分选柱保留和流出的细胞，并计数分析无痕释放效率。此外，通过台盼蓝染色分析无痕释放细胞的活性。

6).同时，对无痕释放的细胞标记CD3、CD4、CD8 Antibdy，通过流式分析所释放细胞的纯度。

图7结果表明，互补序列10-RA1可以有效地释放核酸适体XD-10捕获的T淋巴细胞，其释放效率达70.18％。而且所释放细胞的纯度在80％以上，细胞活性分为91.18％。

Claims

1.一种特异性识别并结合外周血中T淋巴细胞的核酸适体，其特征在于，能特异性识别并结合外周血T淋巴细胞；所述的核酸适体XD-10序列如下：

2.根据权利要求1所述的特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的核酸适体，其特征在于，通过对所述的核酸适体XD-10增加或者删减碱基，或者碱基替换，获得具有相同功能的核酸适体；优选核酸适体XD-10截短成XD-10a，其序列为：

3.根据权利要求1或2所述的特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的核酸适体，其特征在于，通过对所述的核酸适体标记上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，获得与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。

4.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备特异性识别并结合外周血T淋巴细胞的制剂中的应用。

5.一种基于核酸适体的外周血T淋巴细胞特异性识别与富集方法，其特征在于，所述核酸适体包括权利要求1-3任一项所述的核酸适体。

6.一种基于互补序列的外周血T淋巴细胞无痕释放方法，其特征在于，利用互补释放序列释放被所述的核酸适体XD-10序列识别与富集的外周血T淋巴细胞，所述核酸适体XD-10序列如下：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGTTGACAAGGTGCTAAACGTTACCTTCGGTATCTTCGACAACGCCTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；

优选：所述互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’。

7.根据权利要求6所述的基于互补序列的外周血T淋巴细胞无痕释放方法，其特征在于，通过对所述的核酸适体或互补释放序列增加或者删减碱基，或者碱基替换，获得具有相同功能的核酸适体或互补释放序列。

8.一种互补释放序列在制备无损释放被核酸适体捕获的外周血T淋巴细胞的制剂中的应用，

其特征在于，所述的互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’；

所述核酸适体XD-10序列如下：

9.一种无损释放被核酸适体捕获的外周血T淋巴细胞的互补释放序列，其特征在于，所述的互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’；

所述核酸适体XD-10序列如下：

10.一种无损释放被核酸适体捕获的外周血T淋巴细胞的制剂，其特征在于，包括所述的互补释放序列10-RA1如下：

5’-ACTAAGCCACCGTGTCCAGGCGTTGTCGAAGATACC-3’；

所述核酸适体XD-10序列如下：