CN104818280A - 单链核酸适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单链核酸适配体，所述适配体满足下述（1）和（2）：（1）具有5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’的通式，其中N代表长度为35-45bp的随机序列；（2）能特异性中和RhD抗体。所述N为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。本发明提供的单链核酸适配体，其能特异性的中和RhD抗体，其能制备成组合物、试剂盒或芯片可用于RhD抗体的检测，进一步的，其制备成治疗剂可用于新生儿溶血病的治疗，其制备成辅助剂可用于RhD阴性患者的急救输血。

Description

单链核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学与临床医学技术领域。具体而言，本发明涉及单链核酸适配体及其应用。

背景技术

核酸适配体(Aptamer)筛选技术是近年来新兴的一项多学科交叉研究技术，核酸适配体对靶分子的识别具有很强的特异性与高亲和力，在高灵敏检测分析、诊断、蛋白质相互作用、抗感染新药研发及难治性病毒感染性疾病(如AIDS、HBV、HSV、Rabies virus等)与癌症治疗等方面显示出广阔的应用前景。虽未见核酸适配体用于Rh血型系统方面的研究，但同类研究显示，多肽、细菌、病毒颗粒、哺乳动物细胞、核酸等可通过SELEX技术筛选出高亲和力的核酸适配体。核酸适配体可通过基因合成或PCR扩增的方法大量获得，成本低廉，而且寡核苷酸片段对人体无毒性。Aptamer与蛋白质的结合力高于抗原与抗体之间的结合，具有更高的灵敏度和准确性，可以弥补抗体在诊断领域中的不足，是理想的检测及治疗的材料。

Rh血型系统(Rhesus Blood Group Sytstem)是仅次于ABO血型的具有重要临床意义的血型系统，主要抗原有RhD、RhCc、RhEe。其中RhD抗原性最强，临床上根据个体是否存在RhD抗原而分为Rh阳性和Rh阴性。约75％的Rh阴性个体可通过输血、妊娠等途径产生RhD抗体，若再次输入RhD阳性血液可引起致命的溶血性输血反应、肾功能衰竭等。RhD阴性育龄妇女若与胎儿Rh血型不合还会引起新生儿溶血病(Hemolytic Disease of the Newborn,HDN)，导致新生儿出现黄疸、贫血、大脑损伤，甚至死亡。在临床输血治疗实践中，Rh血型系统相合性输注面临着两个难题：一是自身免疫性溶血性贫血患者的Rh血型系统不规则抗体鉴定，另一个是已产生RhD抗体个体的输血与治疗，如新生儿溶血病的治疗、RhD阴性个体的紧急输血等。

临床上，红细胞血型抗体的检测主要是指不规则抗体的检测，目的是为了防止不规则抗体引起溶血性输血不良反应，以确保输血安全。抗体检测的基本原则是用已知抗原来检测未知抗体，并根据实验结果来判断样本中是否存在相应抗体。对于红细胞血型抗体检测而言，理想的方法是用已知的、高纯度的、单一血型抗原来进检测未知抗体。但由于科技水平的限制，目前尚无法得到各种单一的、纯化的红细胞血型抗原，所以检测红细胞血型抗体只能选择携有多种抗原的红细胞。通常将用于检测抗体特异性，携有多种血型抗原的多个个体的红细胞称为红细胞谱细胞，也称谱红细胞。采用谱红细胞检测抗体的原理是若被检样本中存在某种血型抗体，分别与来自多个个体的谱红细胞混合后，就会表现出一种特有的反应格局：与有相应抗原的红细胞发生凝集反应的阳性结果，及与无相应抗原的红细胞不发生凝集反应的阴性结果，根据反应格局来判定血型抗体的特异性。应用谱红细胞检测不规则抗体是目前唯一检测不规则抗体的方法，但这种方法存在以下几个缺点：①红细胞保存时间短，并且随着保存期内时间的延长，部分血型抗原会降解消失，导致抗体检出能力下降；②由于多数红细胞抗原在人群中呈偏态分布，对于部分抗原阴性的红细胞很难找到，因此对某些不规则抗体无法鉴定区分；③对于存在多种抗体或自身抗体的情况下，谱红细胞无法鉴定不规则抗体的特异性；④目前采用谱红细胞鉴定抗体的方法无法实现自动化和标准化，也无法实现对抗体进行定量检测。因此，通过人工方法制备单纯抗原是解决以上缺点的有效途径。本发明通过筛选获得的能与抗-D特异性结合的aptamer，能够实现抗体鉴定的精确化、自动化，并且不受自身抗体以及其他因素的影响，对于血型不规则抗体的鉴定提供了新的途径，是方法学的一个飞跃。

新生儿溶血病主要是指母婴红细胞血型不合引起的新生儿同种免疫性溶血性疾病，以同种免疫性溶血(ABO，Rh血型不合)最为常见也最为重要。新生儿同种免疫性溶血是由于母体存在与胎儿血型不相容的血型抗体(IgG)而引起的。胎儿红细胞进入母体循环后，若母体缺乏胎儿红细胞所具有的抗原时，母体就可产生相应的血型抗体，此抗体通过胎盘进入胎儿循环，则可引起胎儿红细胞致敏、破坏而出现溶血，导致贫血、水肿、肝脾肿大、生后短时间内出现进行性重度黄疸，甚至发生核黄疸而影响智力发育，并导致运动障碍。Rh新生儿溶血病以IgG型抗-D引起的最多见，孕妇如有高效价的抗-D常会导致流产、死胎或者早产，即使能分娩，新生儿的病情往往很严重，需进行换血治疗。目前Rh新生儿溶血病尚无有效的治疗手段，没有药物可以降低孕妇体内抗-D水平，只能寄希望于胎儿能坚持到分娩，并在出生后得到及时治疗，但因Rh阴性(D抗原阴性)血液很稀有，新生儿往往不能得到及时的换血治疗。

我国汉族人群RhD阴性个体比例仅为0.2％～0.5％，Rh阴性血液是稀有血液，对于Rh阴性的急救患者来说，如果不能及时得到Rh阴性血液，就会危及其生命。为缓解上述危机，输血规则中允许对Rh阴性的急救患者给予Rh阳性血液，但仅限于没有产生RhD抗体的RhD阴性患者；对于产生RhD抗体的RhD阴性患者来说，仍然只能等待Rh阴性血液。

发明内容

本发明提供了一种单链核酸适配体，其能特异性的中和RhD抗体，其能制备成组合物、试剂盒或芯片可用于RhD抗体的检测，进一步的，其制备成治疗剂可用于新生儿溶血病的治疗，其制备成辅助剂可用于RhD阴性患者的急救输血。

本发明提供了一种单链核酸适配体，所述适配体满足下述(1)和(2)：

(1)具有5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’的通式，

其中N代表长度为35-45bp的随机序列；

(2)能特异性中和RhD抗体。

所述N为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

本发明还提供了用于检测RhD抗体的组合物、试剂盒或芯片，其含有上述的单链核酸适配体或其组合物。

本发明还提供了用于检测RhD抗体的组合物、试剂盒或芯片，其含有SEQ ID NO：19。

本发明还提供了上述的单链核酸适配体或其组合物用于制备RhD抗体检测试剂的用途。

本发明还提供了一种新生儿溶血病患者使用的治疗剂，所述治疗剂包含上述的单链核酸适配体或其组合物。

本发明还提供了一种新生儿溶血病患者使用的治疗剂，所述治疗剂包含SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：20。

本发明还提供了一种RhD阴性患者输血用的辅助剂，所述辅助剂包含上述的单链核酸适配体或其组合物。

本发明还提供了一种RhD阴性患者输血用的辅助剂，所述辅助剂包含SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：20。

本发明的单链核酸适配体是由78～81个碱基组成的小分子物质，可特异性地与抗-D结合，故可作为检测试剂用于抗-D的检测。由于单链核酸适配体性质稳定，故可实现抗-D检测的标准化及定量检测。而且单链核酸适配体可以有效中和IgG型抗-D，使其失去生物活性，阻断与RhD抗原的特异性结合，避免红细胞的破坏，可以用于孕妇以降低其体内抗-D水平，起到预防抗-D引起的新生儿溶血病的作用，也可用于患儿以起到及时治疗的作用；因本发明的单链核酸适配体具有中和RhD抗体的特性，其对产生RhD抗体的RhD阴性患者可以先行使用，使其抗-D水平快速下降，就可以使用Rh阳性血液以得到及时救治，并且可在整个治疗过程中多次使用，以避免输血反应的发生。

附图说明

图1为实施例1的ssDNA次级文库的制备方法流程图。

图2为实施例1中ssDNA次级文库的制备方法的各步骤产物的琼脂糖凝胶电泳图，从左至右依次为：分子量为500bp的Marker；1为步骤一的对称PCR扩增产物；2为步骤二的不对称PCR扩增产物；3为步骤三的在步骤二的产物基础上纯化后的产物。

图3为实施例1中ssDNA次级文库的制备方法的各步骤产物的MLCE条带模式分析图，从左至右依次为：分子量为300bp的Marker；1为步骤一的对称PCR扩增产物；2为步骤二的不对称PCR扩增产物；3为步骤三的在步骤二的产物基础上纯化后的产物。

图4为实施例1中ssDNA次级文库的制备方法的各步骤产物的扩增副产品MLCE峰值分析图，横坐标为产物大小，纵坐标为荧光值。

图5为实施例2步骤一中根据ssDNA单链序列库长度不同的分类统计图，其中横坐标为ssDNA单链序列长度，纵坐标为相应长度出现的频次。

图6为实施例2步骤一中根据ssDNA单链序列库接头不同的测序分类统计图，其中横坐标为各种类型的接头，纵坐标为对应各种类型的接头出现的频次。其中0代表AGAGACGGACACAGGATGAGC；1代表CCTTCCCCAAGACAGCATCCA；2代表TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG；3代表GCTCATCCTGTGTCCGTCTCT；01为第一链，23为互补链；only：引物二聚体，中间无目标序列，两接头直接相连，且接头完全匹配；contain：中间有目标序列，两端有接头，且接头完全匹配；part：有目标序列，只有一端有接头相连，且接头完全匹配(或许测序错误导致另一端不能匹配)；other：剩下的其他情况，比如只有引物本身，或者引物测序错误，插入，缺失等。

图7为实施例2有效性验证中经不同ssDNA全长序列中和后的抗-D分别与RhD阳性红细胞孵育后的荧光强度变化，其中横坐标为ssDNA编号，纵坐标为荧光强度。

图8为实施例2特异性验证中各特异检测靶分子与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20结合后荧光强度的变化，其中横坐标为ssDNA编号，纵坐标为荧光强度。图9为实施例2亲和力验证中抗-D特异检测靶分子与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20结合后荧光强度的变化，其中横坐标为ssDNA全长序列的浓度，纵坐标为荧光强度。图10为实施例2微柱凝胶法中根据红细胞处于凝胶柱的位置为判断标准来判断其阴性阳性结果的图示。

图11为实施例2在凝胶柱中SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:20联合使用中和抗-D后的图示，从左至右分别为：Neg阴性对照，Pos阳性对照，ssDNA浓度为25pmol，ssDNA浓度为50pmol，ssDNA浓度为100pmol，ssDNA浓度为200pmol。

图12为实施例2中SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:20联合使用中和抗-D后在显微镜下观察(10×10)到的间接抗球蛋白试验结果。

图13为实施例2中SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:20联合使用中和抗-D微球后在显微镜下观察(40×10)到的间接抗球蛋白试验结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种ssDNA次级文库的制备方法，其制备流程见图1，包括如下步骤：

步骤一：使用生物素标记的上、下游引物对ssDNA文库进行PCR扩增，获得携有生物素的dsDNA，为不对称PCR提供足够的模板。

PCR反应体系如下：

      

所述Taq酶选自Promega公司的型号为M1665S的试剂盒。

所述生物素标记上游引物为5’-biotin-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’；

所述生物素标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’；

其中，biotin为生物素。

所述ssDNA文库由82bp组成，文库中间为40bp的随机序列，两侧是分别由21bp组成的引物结合区：5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N40-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’。

以上引物和ssDNA文库均由TaKaRa公司合成。

扩增条件：

第一阶段：

94℃  5min

第二阶段：(11个循环)

94℃  30s

59℃  30s

72℃  30s

第三阶段：

72℃  5min

4℃保存，得到获得携有生物素的dsDNA扩增产物。

步骤二：以步骤一得到的携有生物素的dsDNA扩增产物为模板，使用无生物素标记的上游引物，以及生物素标记的下游引物，两者物质的量之比为20:1，进行不对称PCR扩增。经过不对称PCR扩增后所得到的dsDNA、副产品均携有生物素，而ssDNA却不含生物素。

      

所述AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix(2×)来自Life Technologies公司的4390939试剂盒。

所述上游引物为5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’；

所述生物素标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’；

其中，biotin为生物素，上述引物均由TaKaRa公司合成。

按下列条件进行扩增：

第一阶段：

95℃  10min

第二阶段：(30个循环)

96℃  3s

59℃  3s

68℃  3s

第三阶段：

72℃  10s

4℃保存，得到扩增产物，此扩增产物包括均携有生物素的dsDNA和副产品，以及不含生物素的ssDNA。

步骤三：最后在步骤二的扩增产物中加入链霉亲和素磁珠，去除扩增产物中所有携带生物素的dsDNA和副产品，从而获得高纯度、高浓度的ssDNA。

取步骤二的扩增产物1.5倍体积的链霉亲和素磁珠(ParamagneticParticles，Promega,Z5482)，用PBS-Tween(pH 7.4,with 0.02％Tween-20)洗涤3次，在磁力架上贴壁30s，去除上清。将ssDNA扩增产物转移至磁珠管中，室温摇摆孵育20min。在磁力架上吸出上清液，上清液即为所需要的ssDNA次级文库。

结果检测：

1)ssDNA浓度

使用荧光定量法检测ssDNA浓度，经检测ssDNA浓度为21.67～33.27μg/mL，即810～1230nM。

经对比可知，此ssDNA浓度高于采用其它方法获得的ssDNA浓度，其它方法如文献报道的不对称PCR法、生物素-链霉亲和素分离法及核酸外切酶消化法得到的ssDNA浓度分别为：237～275nM、30.6～42.0nM和31.5～41.5nM。

2)ssDNA纯度

使用高分辨琼脂糖凝胶电泳及微流控芯片毛细管电泳法(MLCE法)检测ssDNA的纯度，结果见图2-4。

琼脂糖凝胶电泳既可分析dsDNA也可分析ssDNA，而MLCE只能分析dsDNA，不能分析ssDNA。从图2可以看出，1-3分别为步骤一、步骤二和步骤三的产物，从图可以看出，步骤一只获得dsDNA，步骤二获得dsDNA、ssDNA以及少量副产品，经步骤三纯化后dsDNA和少量副产品已经去除，得到纯度较高的ssDNA；从图3可以看出，经步骤三纯化后，dsDNA已经去除而检测不到。图4也印证了图2和图3的检测结果。

实施例2

本实施例提供了通过实施例1的ssDNA次级文库筛选能够特异性中和RhD抗体的单链核酸适配体的方法：步骤一：筛选出的ssDNA序列库测序

采用Ion Torrent半导体测序技术对实施例1得到的ssDNA次级文库进行测序和分析(测序服务由Life Technologies公司完成)。

根据图5的ssDNA单链序列库长度分类统计图可以看出，预期测序目标长度符合要求，约为82bp；根据ssDNA单链序列库接头不同的测序分类统计见图6。

根据ssDNA序列库测序结果，我们将中间有目标序列、两端有接头且接头完全匹配的序列作为重点验证对象。同时考虑到因测序无方向性，故将互补序列按碱基互补配对原则转化为第一链序列，即：5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’，其中N代表ssDNA的随机序列。

根据测序结果，筛选出在序列库中占优势的ssDNA随机序列，见表1，其筛选标准为：ssDNA序列库中拷贝数>1000，且长度为35-45bp的序列(在上述PCR扩增过程中，通过PCR重组、跳跃、滑动、偏选等机制，可产生新的特异性高亲和力强的核酸适配体，因此筛选出的ssDNA长度会有所变化)。

表1

      

      

步骤二：对步骤一筛选出的ssDNA的随机序列进行多项指标验证

1、有效性验证(阻断抗体与相应抗原结合的能力验证)

2‰RhD阳性红细胞悬液：取200μL RhD阳性的志愿献血者全血，用生理盐水洗3次，1000×g离心15秒，制成压积红细胞；在小试管中加入2mL生理盐水及4μL压积红细胞，混匀，即为2‰红细胞悬液。同时制备2‰RhD阴性红细胞悬液，即用RhD阴性的志愿献血者全血取代RhD阳性的志愿献血者全血，制备过程与上同。

滴度为1:100的抗-D：使用生理盐水对抗-D进行倍比稀释，稀释后的滴度为1:100。

ssDNA阻断抗体与相应抗原结合的能力验证方法：在96孔微量反应板中每孔加入100μL滴度为1:100的抗-D；然后再分别加入筛选出的ssDNA全长序列10pmol；37℃摇摆孵育30min；然后加入100μL 2‰RhD阳性红细胞悬液，37℃摇摆孵育30min；用生理盐水洗涤3次，加入100μL 1000倍稀释的FITC标记的羊抗人IgG荧光抗体，37℃孵育30min；生理盐水洗涤3次，加入200μL生理盐水，混匀，上机进行流式检测。

同时设置阳性对照和阴性对照，各做3个平行孔。阳性对照的制备方法同ssDNA阻断抗体与相应抗原结合的能力验证方法，只是其中并不加入筛选出的ssDNA全长序列；阴性对照的制备方法同ssDNA阻断抗体与相应抗原结合的能力验证方法，区别是将使用的“2‰RhD阳性红细胞悬液”更换为“2‰RhD阴性红细胞悬液”。

上述抗-D采用的是上海血液生物医药有限责任公司的IgG型抗体；上述FITC标记的羊抗人IgG荧光抗体为AbD Serotec公司的Goat F(ab′)2Anti Human IgG:FITC；上述流式检测采用的流式细胞仪为美国BD公司的FACSCanto^TMII；上述筛选出的ssDNA全长序列SEQ IDNO：13～SEQ ID NO：24由上海生工生物工程股份有限公司合成，各序列如表2所示，分别依次对应于上述ssDNA随机序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：12。

表2

      

结果分析：

以阳性对照荧光强度为参照，观察试验组荧光强度下降程度。使用IBM SPSS Statistics 22软件，采用单因素方差分析(One-Way Anova)比较各均值差异是否显著，p＜0.05为差异有统计学意义。

图7示出了各ssDNA全长序列中和抗-D从而阻断抗-D与RhD抗原结合后荧光强度变化情况，从图可以看出：中间随机序列由SEQ ID No 2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 7或SEQ ID No8组成的ssDNA全长序列具有显著的中和抗-D作用，与阳性对照相比统计学差异显著(p值均<0.05)。

结论：

通过筛选得到表3中的4种有效的ssDNA随机序列，分别对应于表4的ssDNA的全长序列：SEQ ID NO：2对应于SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：3对应于SEQ ID NO：15；SEQ IDNO：7对应于SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：8对应于SEQ ID NO：20。

表3

      

表4

      

2、特异性验证

使用微球结合中国人群中常见血型抗体、干扰抗体及可能会影响筛选效果的干扰蛋白作为特异性检测靶分子，与标有FITC荧光素的ssDNA全长序列孵育，然后采用流式检测方法观察ssDNA与靶分子的结合情况，判断其特异性。同时设置空白对照及阳性对照。

中国人群中常见血型抗体：抗-A，抗-B，抗-D，抗-Fy^a，本实施例采用抗-D。

干扰抗体：人IgG，人IgM，人IgM F(ab′)2片段。

可能会影响筛选效果的干扰蛋白：蛋白A(protein A)，牛血清白蛋白(BSA)。

特异性检测靶分子微球的制备：吸取500μL微球，加入1mL浓度为5mg/mL的抗体或蛋白(在本实施例中采用人IgG、人IgM、人IgM F(ab′)2片段、蛋白A或BSA)，用2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(0.025M,pH 6.0)调节反应体积至2mL，混合，室温下过夜孵育。使用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.1M,pH 7.2)洗涤微球3次，用2mL生理盐水重悬微球，备用。

特异性检测方法：在96孔板中，每孔中加入100μL相应的特异性检测靶分子微球及10μL的1pmol/μL的ssDNA-FITC，37℃摇摆孵育30min。4500rcf(Labofuge 400R,HeraeusInstruments)，离心5min，用生理盐水洗涤3次，最后一次离心去上清后，加入200μL的生理盐水，上机检测荧光强度变化情况。

同时设置阳性对照和阴性对照。阳性对照：以抗-D替代上述特异性检测方法中的特异性检测靶分子微球的制备所用的抗体或蛋白，方法同上；阴性对照：用生理盐水代替上述特异性检测方法中的ssDNA-FITC，方法同上。

所述微球来自Life Technologies公司的1643307试剂盒。

所述抗-D来自上海血液生物医药有限责任公司的IgG型抗体。

所述人IgG抗体来自ROCKLAND公司的25323试剂盒。

所述人IgM抗体来自ROCKLAND公司的24973试剂盒。

所述人IgM抗体F(ab′)2片段来自ROCKLAND公司的29496试剂盒。

所述牛白蛋白(BSA)来自AMRESCO的1683C344试剂盒。

所述蛋白A(Protein A)来自SIGMA公司的SLBJ5265V试剂盒。

所述ssDNA-FITC为标有FITC荧光素的ssDNA全长序列(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：19/SEQ ID NO：20)(由上海生工生物工程股份有限公司合成)。

检测结果如下：

按ssDNA全长序列分组，观察各特异性检测靶分子与ssDNA结合后荧光强度变化情况；每组中，以抗-D特异性检测靶分子与ssDNA结合后的荧光强度作为参考值，与其它特异性检测靶分子与ssDNA结合后的荧光强度进行比较，如图8所示。

从图8可以看出，同一种ssDNA与不同特异性检测靶分子的结合能力不同，荧光强度变化幅度较大，同一种特异性检测靶分子与不同的ssDNA结合效率也不相同。

使用IBM SPSS Statistics 22软件，采用单因素方差分析(One-Way Anova)比较各均值差异是否显著，p＜0.05为有统计学意义上的显著差异。由此分析得出：Seq ID No 14、Seq IDNo 19和Seq ID No 20均有显著的特异性，其中Seq ID No 19的特异性最好，而Seq ID No15则无显著的特异性。

综合以上数据，得出如下结论：

1)特异性由高到低依次为：Seq ID No 19、Seq ID No 20、Seq ID No 14、Seq ID No15。

2)因Seq ID No 15的特异性低，以下试验中均弃置不用。

3、亲和力的验证

在96孔板中加入50μL抗-D特异性检测靶分子微球(方法同上述特异性检测靶分子微球的制备，其中抗体采用抗-D)，及50μL生理盐水。然后在不同孔中分别加入FITC荧光标记的Seq14、Seq 19、Seq 20，使每种ssDNA的终浓度达到50mM、100mM、200mM、400mM及800mM。37℃摇摆孵育30min。4500rcf(Labofuge 400R,Heraeus Instruments)，离心5min。甩掉板中的液体。用生理盐水洗涤3次，最后一次离心去上清后，加入200μL生理盐水，上机检测荧光强度。

检测结果：

图9示出了抗-D特异性检测靶分子与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20结合后荧光强度的变化，根据荧光强度变化情况，使用GraphPad Prism V6软件进行解离常数(Kd)分析。数据分析复合非线性拟合分析要求，使用如下公式计算Kd值：

       $Y=\frac{B\max *X}{\mathrm{Kd}+X}$

其中Bmax为最大结合率，X为各ssDNA全长序列的浓度，Y为与X值对应的荧光强度值。由此计算得出Seq14、Seq19、Seq20的Kd值分别为：36.56～66.36nM、450.71～635.89nM、331.83～474.77nM。

结论：

亲和力由高至低依次为：Seq14、Seq 20、Seq 19。

4、ssDNA中和RhD抗体的剂量效应关系

采用间接抗人抗球蛋白试验法对ssDNA中和RhD抗体的剂量效应关系进行分析。

间接抗人抗球蛋白试验法：在96孔板中，加入100μL滴度为1:256的抗-D，在不同孔中分别加入25pmol、50pmol、100pmol和200pmol的不同种类ssDNA全长序列(SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:19+SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:19+SEQ ID NO:20)(联合使用时总量不变且每种ssDNA均加相同的量)，37℃摇摆孵育30min。然后再加入50μL 5‰RhD阳性红细胞悬液，37℃摇摆孵育30min。最后采用不同的判断方法判断结果：1)微柱凝胶法：将反应物转移至低离子介质抗人球微柱凝胶反应系统中(Diamed-ID LISS/Coombs microtubecolumn system，达亚美公司，瑞士)，离心后根据试剂盒结果判断方法对试验结果进行判断并记录。2)显微镜镜下观察：在前反应物中加入100μL抗人球蛋白试剂(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20140617)，1000×g离心15s，重悬后滴片，显微镜(日本奥林巴斯公司的奥林巴斯BX43型显微镜)下(10×10)观察结果，并记录。同时使用抗-D特异性检测靶分子微球(制备方法同前)代替本试验中的抗-D，进行试验(其它操作与上同)，显微镜下(40×10)观察结果，并记录。

同时设置阳性和阴性对照。阳性对照的制备方法同上述间接抗人抗球蛋白试验法，只是其中并不加入ssDNA全长序列；阴性对照的制备方法同上述间接抗人抗球蛋白试验法，区别是将使用的“5‰RhD阳性红细胞悬液”更换为“5‰RhD阴性红细胞悬液”；5‰RhD阴性红细胞悬液，即用RhD阴性的志愿献血者全血取代RhD阳性的志愿献血者全血，制备方法同5‰RhD阳性红细胞悬液。

同上，所述抗-D为上海血液生物医药有限责任公司生产的IgG型抗体。

滴度为1:256的抗-D：使用生理盐水对抗-D进行倍比稀释，稀释后的滴度为1:256。

5‰RhD阳性红细胞悬液：取200μLRhD阳性的志愿献血者全血，用生理盐水洗3次，1000×g离心15秒，制成压积红细胞；在小试管中加入2mL生理盐水及10μL压积红细胞，混匀，即为5‰RhD阳性红细胞悬液。

检测结果：

1、微柱凝胶法：

图10示出了微柱凝胶法中根据红细胞处于凝胶柱的位置为判断标准来判断其阴性阳性结果。对照图示，微柱凝胶法结果判读标准如下：红细胞完全处于凝胶柱底部为阴性结果(Neg)；处于凝胶柱其它区域的均为阳性结果，根据其分散程度，可将阳性结果分为+/-～4+依次由弱到强的不同强度；MF为混合视野，即有阳性又有阴性的混合结果。

根据微柱凝胶法结果判读标准，上述试验结果可整理为表5。

表5

      

根据表5可以看出随着ssDNA浓度的升高，当达到200pmol时均可完全中和抗-D，使试验结果呈阴性。SEQ ID No 14和SEQ ID No 20的具有相同的中和能力，中和效率均高于SEQID No 19。联合使用不同ssDNA的中和效果明显优于单独使用一种ssDNA的中和效果，较好的组合是SEQ ID No 14与SEQ ID No 20联合使用，见图11。

2)显微镜镜下观察结果

显微镜镜下结果与微柱凝胶法所得结果一致，见图12和图13。

ssDNA的使用浓度与中和抗-D的效果存在明显的剂量效应关系，随着浓度的升高，中和效果明显。ssDNA单独使用SEQ ID NO 14与SEQ ID NO 20效果相同，均优于SEQ ID NO 19。ssDNA联合使用，SEQ ID NO 14+SEQ ID NO 20效果较好，性价比较高。

结论：

综合考虑ssDNA的亲和力、特异性及剂量效应，用于抗-D检测时首选SEQ ID NO：19，而用于以中和抗-D为目的治疗时，首选SEQ ID NO：14+SEQ ID NO：20。

实施例3

本实施例提供了用于检测RhD抗体的ssDNA、试剂盒或芯片，其中含有实施例2所述的单链核酸适配体SEQ ID NO：19。

本实施例还提供了一种新生儿溶血病使用的治疗剂，所述治疗剂含有实施例2所述的单链核酸适配体SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：20。

本实施例进一步提供了一种RhD阴性患者输血用的辅助剂，所述辅助剂含有实施例2所述的单链核酸适配体SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：20。

Claims (9)

1.一种单链核酸适配体，所述适配体满足下述（1）和（2）：

（1）具有5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’的通式，其中N代表长度为35-45bp的随机序列；

（2）能特异性中和RhD抗体。

2.根据权利要求1所述的单链核酸适配体，其特征在于，所述N为SEQ ID NO ：2、SEQ ID NO ：7或SEQ ID NO ：8。

3.用于检测RhD抗体的组合物、试剂盒或芯片，其特征在于，其含有权利要求1-2中任一项所述的单链核酸适配体或其组合物。

4.用于检测RhD抗体的组合物、试剂盒或芯片，其特征在于，其含有SEQ ID NO ：19。

5.权利要求1-2 中任一项所述的单链核酸适配体或其组合物用于制备RhD抗体检测试剂的用途。

6.一种新生儿溶血病患者使用的治疗剂，其特征在于，所述治疗剂包含根据权利要求1 至2 中任一项所述的单链核酸适配体或其组合物。

7.一种新生儿溶血病患者使用的治疗剂，其特征在于，所述治疗剂包含SEQ ID NO：14 和 SEQ ID NO：20。

8.一种RhD阴性患者输血用的辅助剂，其特征在于，所述辅助剂包含根据权利要求1 至2 中任一项所述的单链核酸适配体或其组合物。

9.一种RhD阴性患者输血用的辅助剂，其特征在于，所述辅助剂包含SEQ ID NO：14 和 SEQ ID NO：20。