CN115704033A - 一种突变后的k亚群禽白血病病毒受体基因及其在抗k亚群禽白血病病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种突变后的K亚群禽白血病病毒(ALV‑K)受体基因(Tva)及其在抗K亚群禽白血病病毒感染中的应用。本发明鉴定了介导ALV‑K感染鸡细胞的受体蛋白Tva的关键功能性氨基酸位点E53、L55、H59及G70，发现将这四个位点突变后，将导致ALV‑K无法感染宿主细胞。进一步的，本发明还公开了一种构建抗ALV‑K感染的DF‑1细胞系的方法，该方法利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选，将Tva基因作为ALV‑K受体的关键氨基酸位点E53、L55、H59及G70进行突变。结果表明，含有上述位点突变的替换序列可高效定点替换Tva基因的相应序列；Tva基因编辑细胞系可在不影响细胞增殖水平的条件下抵抗ALV‑K的感染。本发明的提出为进一步研究Tva基因的功能及建立抗ALV‑K感染新技术奠定了基础。

Description

一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因及其在抗K亚群禽 白血病病毒感染中的应用

技术领域

本发明涉及一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)及其在抗K 亚群禽白血病病毒(ALV-K)感染中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

禽白血病(AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的一种造成禽类肿瘤的种源性疾病。ALV属于α-反转录病毒属，为有囊膜的RNA病毒。根据其囊膜蛋白的不同，目前，ALV被划分为A-J 10个亚群，近年来在我国又出现了新的ALV亚群，指定为K亚群(Cui N,Su S,Chen Z,et al.Genomic sequence analysis and biologicalcharacteristics of a rescued clone of avian leukosis virus strain JS11C1,isolated from indigenous chickens[J].J Gen Virol,2014,95(Pt 11):2512- 2522.)。ALV-K作为新出现的ALV亚型，其主要引起感染鸡群的胶质瘤。

不同亚群ALV利用不同的表面蛋白作为受体感染宿主细胞。但是，所有亚型的ALV的囊膜蛋白与受体分子的特异性氨基酸相互作用都是其建立感染至关重要的一步。A亚群禽白血病病毒(ALV-A)受体基因(Tva)同时也为ALV-K的细胞受体基因，其含有一个称为LDL-A的结构域，为介导病毒进入的关键功能域，Tva介导ALV-K感染的关键氨基酸E53、L55、H59及G70位于该LDL-A结构域中。Tva作为人CD320的同源基因，是一个TC介导的Cbl(维生素B12) 摄取的细胞受体分子之一，因此，Tva对于鸡的生长至关重要。

删除或突变受体分子介导病毒进入宿主细胞的关键功能域或关键氨基酸，使受体丧失介导病毒进入细胞的能力，同时保留其维持细胞正常生命活动的功能，是最好的以受体分子为靶分子建立抗ALV感染鸡的策略。CRISPR/Cas9基因编辑技术作为新一代基因编辑技术，可实现基因的“精准”编辑，这为抗病鸡的构建提供了有利的工具。

因此，本发明拟通过利用CRISPR/Cas9技术对Tva介导ALV-K入侵的关键氨基酸位点进行基因突变或缺失，为进一步构建抗ALV-K的基因编辑鸡奠定基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种突变后的K亚群禽白血病病毒(ALV-K)受体基因(Tva)及其在抗K亚群禽白血病病毒感染中的应用；

本发明的目的之二在于提供一种利用上述突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)构建抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第53、55、59 及70位氨基酸位点发生了突变或缺失。

本发明发明人通过研究发现Tva的第53、55、59及70位氨基酸均为其介导 ALV-K入侵的关键氨基酸位点，对这四个氨基酸位点进行任意的突变或缺失都会导致Tva无法作为ALV-K的受体介导ALV-K的感染。因此，凡是通过对上述这四个位点进行突变或缺失得到的突变后的鸡Tva基因都应落入本发明的保护范围之内。

为了更具体的说明，在本发明的一个具体实施例中，所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因 (Tva)在研究Tva基因的功能以及通过基因编辑的方法制备抗K亚群禽白血病病毒的生物材料中的应用。

其中，优选的，所述的生物材料为抗K亚群禽白血病病毒感染的细胞系。

其中，优选的，所述的细胞系为DF-1细胞系。

更进一步的，本发明还提出了一种构建抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1 细胞系的方法，所述的方法利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选，将鸡Tva 基因所编码的Tva蛋白的第53、55、59及70位氨基酸位点进行了突变或缺失。

其中，优选的，突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

更优选的，所述的方法包括以下步骤：

(1)Tva-sgRNA敲除质粒的构建

合成Tva敲除引导RNA序列，并将该序列插入到pMD-18T载体中，构建得到Tva-sgRNA敲除质粒，其中，所述的引导RNA序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)ssODN序列的合成

合成SEQ ID NO.3所示的ssODN序列，将原始Tva基因所编码的第E53、 L55、H59及G70位氨基酸突变表达；

(3)r-Tva细胞系的构建及筛选

将pCas9-GFP质粒、Tva-sgRNA质粒及ssOND共转入DF-1细胞内，培养 48h后，使用流式细胞分选仪筛选带有GFP荧光的细胞，将阳性细胞接入96孔板中，7d后于光学显微镜下观察筛选单克隆细胞系并扩大培养；

(4)细胞系的鉴定

使用基因组提取试剂盒提取单克隆细胞系的基因组，分别选取突变位点的上下游的一段序列作为引物进行PCR扩增，并对扩增的产物进行测序分析，替换序列成功插入Tva基因中，表明成功获得抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系。

其中，优选的，步骤(4)中所述的引物序列为：

Tva-CX-F：gttctttggcgcagtgctc；

Tva-CX-R：cgctgcagctgagctttatg。

按照所述的方法构建得到的抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系也在本发明的保护范围之内。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

ALV目前在我国种鸡群中仍有较高的感染率。禽白血病等目前尚无疫苗及有效治疗药物的疾病，目前的主要防控措施依赖于净化，淘汰患病动物，需要大量耗费大量人力物力。而CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展为禽白血病的防控带来了新的机遇。通过对病毒感染宿主细胞所需的必需宿主因子进行基因编辑，建立抗ALV感染的天然屏障。但是，某些受体分子参与维持细胞的正常生理功能无法进行直接敲除，因此，体外构建受体关键氨基酸位点突变的基因编辑技术对于构建基因编辑动物至关重要。

Tva基因作为ALV-K的受体，其对于细胞摄取维生素B12至关重要。本发明鉴定了介导K亚群禽白血病病毒(ALV-K)感染鸡细胞的受体蛋白Tva(又称为 CD320)的关键功能性氨基酸位点E53、L55、H59及G70，发现将这四个位点突变后，将导致ALV-K无法感染宿主细胞。因此，本发明针对鸡Tva的第53、55、 59及70四个氨基酸位点进行突变或缺失，利用CRISPR/Cas9技术成功对鸡Tva 的第53、55、59及70位氨基酸位点进行了突变。结果显示，利用CRISPR/Cas9 技术可有效获得Tva基因编辑细胞系r-Tva。接毒结果显示，Tva基因编辑细胞系 r-Tva可有效抵抗ALV-K毒株的感染，本发明为进一步建立基因编辑鸡奠定了基础。

目前针对DF-1基因编辑细胞的构建主要通过转染含有抗性的Cas9表达质粒及替换片段，该方法通过药物筛选获得基因编辑细胞系，提高了外源抗性基因随机整合至宿主基因组的概率，此方法对于转基因鸡的构建存在一定的隐患。本发明通过流式细胞术成功筛选获得Tva基因编辑细胞系r-Tva，降低了转染质粒随机插入宿主基因组的风险。

附图说明

图1为r-Tva细胞系的鉴定；

图2为r-Tva细胞系增殖水平的鉴定；

图3为r-Tva细胞系抗ALV-K-GFP毒株感染水平的检测；

图4为荧光定量检测r-Tva细胞系抗ALV-K毒株感染水平。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)的设计

本发明发明人通过研究发现，鸡Tva的第53、55、59及70位氨基酸均为其介导ALV-K入侵的关键氨基酸位点。对这四个氨基酸位点进行任意的突变或缺失都会导致Tva无法作为ALV-K的受体介导ALV-K的感染。因此，本发明针对鸡Tva的第53、55、59及70位四个氨基酸位点进行了突变或缺失。

在该具体实施例中，将Tva蛋白的第53位的E突变为L、第55位的L突变为A、第59位的H突变为D，第70位的G突变为三个氨基酸PQR，所述的突变后的Tva基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。原始Tva基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系的构建

1材料与方法

1.1主要实验材料

DF-1细胞及表达绿色荧光蛋白的重组病毒ALV-K-GFP毒株为本实验室保存； ALV-K(JS15SG01)为本实验室分离；TIANamp Genomic DNA提取试剂盒购自 TIANGEN公司；pMD-18T载体购自TARAKA公司；pCas9-GFP质粒本实验室保存。

1.2载体构建

使用E-CRISP在线软件(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcris/html)设计Tva敲除引导RNA(gRNA)序列(CCACTCCAGCGGGTAGCAGT,SEQ ID NO.2所示)，并将该序列插入到pMD-18T载体，构建Tva-sgRNA敲除质粒。根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Tva基因序列，设计 ssODN(TTCGGAGCCGCACGATCCCCAGACCGACTGCTACCCGCTGCTGTGG GCCTGCGACGGGGACCCCGACTGCGACGATGGACGGGACGAGTGGCCGCA GCGCTGCGGAGCGAGCGGGAGCCCCGCGGTGCCCACCGCCGGCG,SEQ ID NO.3所示)，将Tva蛋白的第53位的E突变为L、第55位的L突变为A、第59 位的H突变为D，第70位的G突变为三个氨基酸PQR。

1.3 r-Tva细胞系的构建及筛选

将pCas9-GFP质粒、Tva-sgRNA质粒及ssOND共转入DF-1细胞内，培养 48h后，使用流式细胞分选仪筛选带有GFP荧光的细胞，将分选的阳性细胞接入 96孔板中，7d后于光学显微镜下观察筛选单克隆细胞系(r-Tva)并扩大培养，使用基因组提取试剂盒提取r-Tva细胞系的基因组，以Tva-CX- F(gttctttggcgcagtgctc)及Tva-CX-R(cgctgcagctgagctttatg)为引物扩增替换序列，回收扩增产物进行测序鉴定。

1.4 r-Tva细胞系生长水平的检测

各取r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系，铺至96孔板。铺板后12h使用 CCK8试剂盒按照说明书对细胞系的生长水平检测，简单来说，向每个孔中加入 10μL的显色液，37℃避光孵育2h后使用酶标仪在450nm通道进行读数。

1.5 r-Tva细胞系抗ALV-K-GFP毒株感染水平的检测

各取r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系，铺至12孔板，16h后分别接ALV- K-GFP毒株(10^5.2TCID₅₀/mL)100μL/孔，各设置三个平行孔。接毒72h后通过倒置荧光显微镜观察GFP荧光比例，检测r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系感染 ALV-K-GFP毒株的比例。

1.6 r-Tva细胞系抗ALV-K野生型毒株感染水平的检测

各取r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系，铺至12孔板，16h后分别接ALV- K(JS15SG01)毒株(10^5.5TCID₅₀/mL)/孔，每组设置3个平行孔，接毒72h后冻融，收集病毒悬液，提取病毒的基因组，使用K-gp85- F(CAGACAGGTTCTCGCTTCCG)及K-gp85-R(CCATATACCTCCTGTGCGTGT) 为引物，通过荧光定量方法检测r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系感染ALV-K 的比例。

2结果

2.1 r-Tva细胞系的构建及筛选

通过CRISPR/Cas9方法，将替换序列插入到鸡Tva基因中，使其编码的E53、 L55、H59及G70突变表达(图1)。提取r-Tva细胞系的基因组，利用PCR扩增方法对r-Tva细胞系进行扩增鉴定。以r-Tva细胞系的基因组为模板，分别选取突变位点的上下游的一段序列作为引物进行扩增，并对扩增的产物进行测序分析，替换序列成功插入Tva基因中。表明成功获得r-Tva细胞系(图1)。

2.2 r-Tva细胞系增殖水平的检测

将r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系分别接种至96孔板中，12h后使用 CCK8试剂盒对细胞活性进行检测，结果如图2所示，结果显示r-Tva细胞系与野生型DF-1细胞系的细胞活性无差异。

2.3 r-Tva细胞系抗ALV-K-GFP毒株感染水平的检测

将r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系分别接种至12孔板中，16h后分别接ALV-K-GFP毒株，接毒后72h观察GFP荧光比例，结果如图3所示，结果显示与野生型DF-1细胞相比，r-Tva细胞系接ALLV-A-GFP毒株后无GFP荧光。表明r-Tva细胞系可抵抗ALV-K-GFP毒株的感染。

2.4 r-Tva细胞系抗ALV-K野生型毒株感染水平的检测

将r-Tva细胞系及野生型DF-1细胞系分别接种至12孔板中，16h后分别接 ALV-K野生型毒株，接毒后72h收集病毒悬液并提取基因组，进行荧光定量PCR 检测。结果如图4所示，结果显示与野生型DF-1细胞相比，r-Tva细胞系无ALLV- K野生型毒株感染，表明r-Tva细胞系可抵抗ALV-K野生型毒株的感染。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 一种突变后的鸡K亚群禽白血病病毒受体基因及其在抗K亚群禽白血病病毒感染中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 375

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

atggtgcggttgttggagctgctggtgctgctgcgcgccgtccgcccgctgcccacccccacctccgcgcccggcaacggttctttggcgcagtgctcacccgagcagttccactgttcggagccgcacgatccccagaccgactgctacccgctgctgtgggcctgcgacggggaccccgactgcgacgatggacgggacgagtggccgcagcgctgcggagcgagcgggagccccgcggtgcccaccgccggcggcacagagacttcagctgtccctgcgcctgggcgtgctctgccatccaggaaccacggccgcatgtggatgctgatcgttgcagggatctttcactgtgaggtggtaagatgggactga

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> Tva

<400> 2

cgctggagtggctctgcgac

<210> 3

<211> 140

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

ttcggagccgcacgatccccagaccgactgctacccgctgctgtgggcctgcgacggggaccccgactgcgacgatggacgggacgagtggccgcagcgctgcggagcgagcgggagccccgcggtgcccaccgccggcg

<210> 4

<211> 369

<212> DNA

<213> Tva

<400> 4

atggtgcggttgttggagctgctggtgctgctgcgcgccgtccgcccgctgcccacccccacctccgcgcccggcaacggttctttggcgcagtgctcacccgagcagttccactgttcggagccgcacgatccccagaccgactgctacccgctggagtggctctgcgacgggcatcccgactgcgacgatggacgggacgagtggggctgcggagcgagcgggagccccgcggtgcccaccgccggcggcacagagacttcagctgtccctgcgcctgggcgtgctctgccatccaggaaccacggccgcatgtggatgctgatcgttgcagggatctttcactgtgaggtggtaagatgggactga

Claims (10)

1.一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第53、55、59及70位氨基酸位点发生了突变或缺失。

2.如权利要求1所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)在研究Tva基因的功能以及通过基因编辑的方法制备抗K亚群禽白血病病毒的生物材料中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物材料为抗K亚群禽白血病病毒感染的细胞系。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的细胞系为DF-1细胞系。

6.一种构建抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系的方法，其特征在于，所述的方法利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选，将K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第53、55、59及70位氨基酸位点进行了突变或缺失。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)Tva-sgRNA敲除质粒的构建

合成Tva敲除引导RNA序列，并将该序列插入到pMD-18T载体中，构建得到Tva-sgRNA敲除质粒，其中，所述的引导RNA序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)ssODN序列的合成

合成SEQ ID NO.3所示的ssODN序列，将原始Tva基因所编码的第E53、L55、H59及G70位氨基酸进行突变表达；

(3)r-Tva细胞系的构建及筛选

将pCas9-GFP质粒、Tva-sgRNA质粒及ssOND共转入DF-1细胞内，培养48h后，使用流式细胞分选仪筛选带有GFP荧光的细胞，将阳性细胞接入96孔板中，7d后于光学显微镜下观察筛选单克隆细胞系并扩大培养；

(4)细胞系的鉴定

使用基因组提取试剂盒提取单克隆细胞系的基因组，分别选取突变位点的上下游的一段序列作为引物进行PCR扩增，并对扩增的产物进行测序分析，替换序列成功插入Tva基因中，表明成功获得抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的引物序列为：

Tva-CX-F：gttctttggcgcagtgctc；

Tva-CX-R：cgctgcagctgagctttatg。

10.按照权利要求6-9中任一项所述的方法构建得到的抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系。

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