CN112143704A

CN112143704A - 一种可用于指示ace2表达量的细胞株及其构建方法与应用

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Publication number: CN112143704A
Application number: CN202010978943.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋明贵; 方娟; 刘军鹏; 刘阳; 何胜; 刘彩云; 许澎; 屈飞
Original assignee: Hunan Prate Network Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Prate Network Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: CN112143704B

Abstract

本发明公开了一种可用于指示ACE2表达量的细胞株及其构建方法与应用，所述构建方法包括以下步骤：S1、设计并构建能切割ACE2基因组的sgRNA/Cas9蛋白共表达载体；S2、构建含ACE2基因同源序列、标记基因的donor载体；S3、将sgRNA/Cas9蛋白共表达载体和donor载体共转染工具细胞Huh7‑细胞，筛选阳性克隆，得到所述细胞株；其中，所述sgRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。本发明构建的细胞株可用于冠状病毒等的筛选，效率高，成本低，在抗击新冠疫情中具有广阔的应用前景。

Description

一种可用于指示ACE2表达量的细胞株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和基因遗传修饰技术领域，具体涉及一种可用于指示ACE2表达量的细胞株及其构建方法与应用。

背景技术

冠状病毒是自然界广泛存在的一大类病毒，主要感染脊椎类动物，如人、鼠、猪、禽类等，因其病毒形态在电镜下观察似王冠而得名。2019新型冠状病毒(2019-nCov，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。截止到2020年8月中旬，因新型冠状病毒感染的肺炎(Novelcoronavirus pneumonia，NCP)在世界范围内已造成接近2000万例感染，并造成接近80万例死亡，给全世界社会、经济、政治、生活都造成了严重影响。相关研究表明，冠状病毒是通过S蛋白与宿主的受体结合，从而感染宿主细胞。冠状病毒S蛋白的多样性高、机制复杂，β属冠状病毒的S蛋白大小以及在细胞表面与其结合的受体都各不相同。前期研究证实，SARS-Cov是通过细胞膜表面ACE2受体进入细胞。而我国病毒所石正丽研究团队通过实验证明2019-nCoV可以通过细胞膜表面ACE2受体进入细胞，这与SARS-CoV进入细胞的途径是一样的。这些都提示ACE2可能是新型冠状病毒的潜在治疗靶点。

自国家病原微生物资源库于2020年1月24日发布由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所成功分离的我国第一株病毒毒种信息及其电镜照片(如图1所示)以来，医药领域的各研发人员正在奋力研究其相关检测及防治药物。目前，准确检测技术研究已取得较一定的进展，而防治药物还尚未面世。因此，加快促进可靠药物的研制具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种细胞株的构建方法，该方法通过CRISPR/Cas技术构建得到的细胞株能够用于指示冠状病毒受体ACE2表达量。

本发明还提出上述方法构建得到的细胞株。

本发明还提出上述细胞株的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的构建方法，包括以下步骤：

S1、设计并构建能切割ACE2基因组的sgRNA/Cas9蛋白共表达载体；

S2、构建含ACE2基因同源序列、标记基因的donor载体；

S3、将sgRNA/Cas9蛋白共表达载体和donor载体共转染工具细胞Huh7-细胞，筛选阳性克隆，得到所述细胞株；

其中，所述sgRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

根据本发明的一些实施方式，所述ACE2基因同源序列包括同源左臂序列和同源右臂序列，所述同源左臂序列如Seq ID No.2所示，所述同源右臂序列如Seq ID No.3所示。

根据本发明的一些实施方式，所述标记基因包含荧光标记基因；优选地，所述荧光标记基因选自GFP荧光标记基因。所述GFP荧光标记基因通过2A肽与ACE2左游臂相连，以确保GFP蛋白的荧光值能特异性的代表ACE2蛋白的表达量。基于CRISP(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)/Cas9基因编辑系统，在ACE2位点加入2A肽连接GFP蛋白，通过GFP荧光的强弱，能特征性指示ACE2的蛋白表达。

根据本发明的一些实施方式，所述标记基因还包括抗生素筛选基因；优选地，所述抗生素筛选标记基因选自嘌呤霉素抗性基因。所述嘌呤霉素抗性基因由鸡肌动蛋白启动子启动表达。

根据本发明实施方式的构建方法，至少具有如下有益效果：本发明结合CRISPR/Cas9技术培训和同源重组技术，使用带有特异片段(ACE2位点)的donor载体，将外源序列精确地整合到特定位点，进而有效规避病毒元件随机整合带来的风险；本发明构建的细胞株可用于冠状病毒等的筛选，效率高，成本低，在抗击新冠疫情中具有广阔的应用前景。

根据本发明的第二方面实施方式的细胞株，采用上述方法制得所述细胞株。

根据本发明的第三方面实施方式的应用，上述细胞株在检测ACE2表达量试剂盒制备中的应用。

上述细胞株在冠状病毒诊断试剂或治疗药物制备中的应用。

根据本发明的一些实施方式，所述冠状病毒为COVID-19。目前各研究机构设计及测试的药物中，相当一部分直接作用于ACE2位点，基于模型预测的各类待测药物通常需要在体外进行一系列检测，以缩小待检范围，通过本发明方案构建的细胞株可实现高通量、高灵敏度地药物筛选。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为中国疾病预防控制中心公布的新型冠状病毒的电镜图；

图2为本发明实施例中sgRNA靶位点切割效果图；

图3为本发明实施例中含靶位点的sgRNA/Cas9蛋白共表达载体图谱；

图4为本发明实施例中donor载体原始质粒图谱；

图5为本发明实施例中构建的donor载体图谱；

图6为本发明实施例中Huh-7转染效果图(同时转染sgRNA载体和Donor载体呈绿色荧光)；

图7为本发明实施例中流式分选GFP阳性的Huh-7单细胞图；

图8为本发明实施例中GFP+单细胞形成的单克隆细胞系图；

图9为本发明实施例中获得基因工程细胞株的基因组鉴定结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明的实施例为：一种可用于指示ACE2表达量的细胞株的其制备方法，包括以下步骤：

一、设计并构建能切割ACE2基因组的sgRNA和Cas9蛋白共表达载体

1.1提取共表达载体原始质粒

使用质粒小提试剂盒(购买自康为世纪，货号CW0511C)，按照产品说明书的实验步骤小量提取共表达载体原始质粒(购买自addgene，货号plasmid#48138)。

1.2酶切切割载体原始质粒

使用内切酶(购买自Neb，货号R0539L)，按照产品说明书的实验步骤对1.1提取的质粒进行酶切，并回收酶切产物。

1.3筛选合适的sgRNA靶序列片段

1.3.1挑选sgRNA靶位点

根据NCBI网站上给出的人源基因ACE2位点基因组序列选取sgRNA靶位点，其中3个靶位点的测试情况，具体序列如下：

sg1(序列如Seq ID No.4所示)：5`-acatagatttttctaaaagg-3`；

sg2(序列如Seq ID No.5所示)：5`-aaaacatagatttttctaaa-3`；

sg3(序列如Seq ID No.1所示)：5`-aatctatgtttttcctcttg-3`。

1.3.2sgRNA靶位点筛选

使用gRNA活性荧光检测试剂盒(购买自北京合生基因，货号HS-SR-0001A)，按照产品说明书操作步骤构建检测载体，并进行细胞实验。实验结果如图2所示(左侧为细胞形态图，右侧为荧光图；从图中可以看出，1号靶点荧光比例低，2号、3号靶点荧光比例高，其中3号最高)。根据使用的gRNA活性荧光检测试剂盒的检测原理，荧光比例越高，表明靶序列被切割的细胞比例越高(靶序列被Cas9蛋白切割，随后进行同源重组，细胞才会表达荧光)，因此靶序列越容易被Cas9蛋白切割。

因此，本发明以sg3为sgRNA靶位点(即5`-AATCTATGTTTTTCCTCTTG-3`(Seq IDNO.1))进行后续实验。

1.4构建sgRNA靶序列片段

合成sgRNA靶序列引物，并通过PCR仪进行退火反应。

1.4.1设计的sgRNA靶序列引物

sg-F(序列如Seq ID No.6所示)：5`-caccaatctatgtttttcctcttg-3`；

sg-R(序列如Seq ID No.7所示)：5`-aaaccaagaggaaaaacatagatt-3`。

1.4.2退火反应使用程序

a.95℃，5min；

b.25℃，20min。

1.4.3将退火完成的产物稀释成10μM，用于后续实验。

1.5构建共表达载体质粒

1.5.1使用T4连接酶(购买自Neb，货号M0202S)，按照产品说明书，将酶切好的原始质粒和稀释好的sgRNA靶序列进行连接反应。

1.5.2使用感受态细胞(购买自博迈德，货号BC102-02)，按照产品说明书，将连接完成的混合物进行转化实验。

1.5.3挑取单克隆进行测序，并比对测序结果，确定共表达载体构建成功。构建的载体图谱如图3所示。

二、构建donor载体

构建含有ACE2基因、抗生素筛选标记基因(嘌呤霉素)和荧光标记基因(GFP)的donor载体。

2.1提取供体(donor)载体原始质粒

使用质粒小提试剂盒(购买自康为世纪，货号CW0511C)，按照产品说明书的实验步骤小量提取供体(donor)载体原始质粒Pdonor(内部构建)，质粒图谱如图4所示。

2.2PCR扩增目的片段

2.2.1以Huh-7基因组为模板，进行基因组PCR，扩增上游臂/下游臂片段，并进行胶回收。

扩增引物：

上游臂-F(序列如Seq ID No.8所示):5`-3`:cactaaagggactagtcctgcaggtcttttttctcagaca；

上游臂-R(序列如Seq ID No.9所示):5`-3`:ggaagagaagaggtcagaagcttaaaggaggtctgaacat；

下游臂-F(序列如Seq ID No.10所示):5`-3`:gacctgcagcccaagctggtaccaaaaatctatgtttttc；

下游臂-R(序列如Seq ID No.11所示)：5`-3`:gggcgaattgaatttagcggccgcaagatttaagagactg。

2.2.2以Pdonor原始质粒为模板，进行PCR，扩增中间段片段，并进行胶回收。

扩增引物：

中间-f(序列如Seq ID No.12所示)：5`-3`:atgttcagacctcctttaagcttctgacctcttctcttcc；

中间-r(序列如Seq ID No.13所示)：5`-3`:gaaaaacatagatttttggtaccagcttgggctgcaggtc。

2.3重组连接

2.3.1使用无缝连接酶(购买自擎科生物，货号TSV-S2)，按照产品说明书步骤，将2.2.1胶回收片段和2.2.2胶回收片段进行重组连接。

2.3.2使用感受态细胞(购买自博迈德，货号BC102-02)，按照产品说明书步骤，将连接完成的混合物进行转化实验。

2.3.3挑取单克隆进行测序，并比对测序结果，选择构建成功的donor载体，载体图谱如图5所示。其中，donor载体中含有ACE2基因同源序列，包括同源左臂序列(上游臂)和同源右臂序列(下游臂)，同源左臂的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，同源右臂的核苷酸序列如Seq ID NO.3所示。donor载体中荧光标记基因为GFP荧光标记基因，通过2A肽与ACE2上游臂相连；荧抗生素筛选标记基因为嘌呤霉素抗性基因，由鸡肌动蛋白启动子启动表达。

三、细胞转染与初筛

3.1培养Huh-7细胞

复苏并培养Huh-7细胞。细胞培养基的配方如下表1所示：

表1.Huh-7细胞完全培养基成分表

3.2细胞转染

本发明采用汉恒生物的转染试剂(货号：HB-TRLF-1000)，按照产品说明书步骤进行转染。

转染后第三天(72小时后)，观察带绿色荧光的细胞比例，显微镜视野中，绿色荧光比例呈阳性的细胞越多，绿色荧光越强，标明转染效率越高，实验结果如图6所示，图6中可见荧光较强，说明转染效率高。

3.3嘌呤霉素筛选阳性克隆

使用经3.2细胞转染后的细胞，在正常的Huh-7细胞完全培养基(成分见表1)中加入嘌呤霉素，进行细胞筛选。本发明使用的嘌呤霉素筛选浓度为2μg/ml，筛选时间为3天。筛选3天后换成正常的Huh-7细胞完全培养基培养4天，进行二次筛选。二次筛选使用的嘌呤霉素筛选浓度为3μg/ml，筛选时间为3天。筛选3天后换成正常的Huh-7细胞完全培养基培养一周。通过嘌呤霉素筛选，能富集到同时转染成功sgRNA/Cas9蛋白共表达载体和donor载体的细胞。

3.4流式分选

使用流式细胞分选仪对3.3中筛选两轮后获得的细胞进行单细胞分选，确保每个孔中只含有1个细胞，如图7所示。通过流式分选，可以进一步纯化并获得可用于指示新冠病毒受体ACE2表达量的单个细胞。

3.5单细胞建系

3.5.1使用正常的Huh-7细胞完全培养基培养3.4中获得的单细胞，直至长成单细胞来源的单克隆细胞亚系，如图8所示，并命名为Huh-7-ACE。

3.5.2挑取5个单细胞来源的细胞亚系进行扩大培养，分别命名为Huh-7-ACE-1、Huh-7-ACE-2、Huh-7-ACE-3、Huh-7-ACE-4和Huh-7-ACE-5。

3.6通过分子生物学实验鉴定获得基于CRISPR/Cas9系统构建的可用于指示新冠病毒受体ACE2表达量的细胞株的基因工程细胞株。

3.6.1基因组PCR鉴定阳性克隆

a.分别收集3.5.2的5株亚克隆细胞系，使用基因组提取试剂盒(购买自天根，货号DP304-03)分别提取基因组。

b.设计基因组鉴定引物，对提取的基因组进行PCR扩增。

检测-F(序列如Seq ID No.14所示):atttcctgagtatgccaata；

R1(序列如Seq ID No.15所示):accttgatgccgttcttctgc；

R2(序列如Seq ID No.16所示):cactgctcaaacactgtgagc；

通过凝胶电泳对扩增的DNA产物进行鉴定，鉴定图如图9所示。FR1扩增后产物的分子量为986bp，FR2扩增后产物的分子量为1207bp。从图9中可以看出，亚克隆细胞系2(Huh-7-ACE-2)经鉴定为假阳性，基因组中没有整合相关基因片段；亚克隆细胞系1，3，4，5为阳性克隆。并且，亚克隆细胞系Huh-7-ACE-4为纯合阳性；亚克隆细胞系Huh-7-ACE-1、Huh-7-ACE-3、Huh-7-ACE-5为杂合阳性。因此，选择亚克隆细胞系Huh-7-CPG-4作为工具细胞Huh7-细胞株进行构建成功最优细胞株。

图6至图8中左侧为细胞形态图，右侧为荧光图。

综上所述，本发明结合CRISPR/Cas9技术和同源重组技术，使用带有特异片段(如ACE2位点)的donor载体，将外源序列精确地整合到特定位点，就能有效规避病毒元件随机整合带来的风险。在人源细胞的安全港位点——ACE2位点定点整合Cas9蛋白以及抗生素筛选标记(嘌呤霉素)和荧光标记蛋白(GFP)，并通过筛选标记筛选获得能稳定表达Cas9蛋白和筛选标记的细胞系。而通过二次基因编辑，将筛选标记切除，进而获得稳定表达Cas9蛋白且不带任何筛选标记，后续可持续高效地针对目标基因进行编辑的工具细胞Huh7-细胞系。将本发明的细胞株作为一种工具细胞Huh7-细胞株，能稳定表达Cas9蛋白，大幅提高后续基因编辑效率。同时，由于本发明的工具细胞Huh7-细胞株本身不带有任何筛选标记，在进行后续基因编辑时不会对筛选标记的使用造成任何困扰与影响。因此，本发明的工具细胞Huh7-细胞株在基因编辑制备目标细胞株/模式动物领域具有广阔的应用前景。

CRISPR/Cas(CRISPR-associated)系统是原核生物所拥有的一种针对外源性遗传物质的免疫系统。CRISPR/Cas系统具有操作简单、成本低廉和作用高效的特点，是目前已经被广泛用于基础研究的基因编辑新技术。CRISPR/Cas系统是进行基因编辑的强大工具，可以对大部分物种的基因组进行精确编辑。本发明实施例将含有Cas9蛋白编码基因和sgRNA表达序列的质粒转染某个细胞时，sgRNA可以靶向目标序列，Cas9蛋白则会使相应的DNA双链发生断裂。如果在此基础上同时引入一个含有目标序列的模板质粒(供体DNA分子，即donor载体)，通过同源重组，细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入外源片段，从而实现目标基因的特定编辑。本发明实施例构建的细胞株可实现基于荧光表达强弱的评价系统，能直接通过采集荧光信号，进行高通量，高灵敏度地药物筛选，直接评估各类抗2019n-Cov药物的效价。本发明对于加速抗新冠病毒开发具有重大作用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 湖南普拉特网络科技有限公司

<120> 一种可用于指示ACE2表达量的细胞株及其制备方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatctatgtt tttcctcttg 20

<210> 2

<211> 793

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcttttttct cagacatata tatatatata tatatatata tatatctcct ttttagtata 60

caaatatata cttttttagt gtgtatattt gtgtgtatgt gcatatgtat atctcatttc 120

ttagtataca aatgttagca ggctataaac aatgttctgc atattttgtt ttccacttaa 180

tggttttttt aaatttttat ttatataggt gtgatccacc acacccagcc cacttaatgt 240

gttttagaga tcattacaca ttagttgcac aaaaaacttc tccttttttc tggcagtata 300

atttcccatt tcacgaatgg attgtaattt tgataaacag tcatctattg atgaactttt 360

atgttgtttc caaacatttg tgtttactta aaaaaagtga tggcttaata taggtaattt 420

cctgagtatg ccaatatacc cttaagatga atcctagcag tgggaaagct gggtgaaagc 480

atacgtgcaa ttgctaattt tgataaatat tgccaaattg ccctcaatag cggctgtacc 540

aatttatact cacatcaaca gtttatgaaa cttcctgttc ctccctccca gcctccttaa 600

cacagattcc cctgaaactt tttgattttc atcagtccga ttgattttaa cataagtata 660

ttaaggcaac cttgctctat ttaacaggaa aaataaagca agaagtggag aaaatcctta 720

tgcctccatc gatattagca aaggagaaaa taatccagga ttccaaaaca ctgatgatgt 780

tcagacctcc ttt 793

<210> 3

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaatctat gtttttcctc ttgaggtgat tttgttgtat gtaaatgtta atttcatggt 60

atagaaaata taagatgata aagatatcat taaatgtcaa aactatgact ctgttcagaa 120

aaaaaattgt ccaaagacaa catggccaag gagagagcat cttcattgac attgctttca 180

gtatttattt ctgtctctgg atttgacttc tgttctgttt cttaataagg attttgtatt 240

agagtatatt agggaaagtg tgtatttggt ctcacaggct gttcagggat aatctaaatg 300

taaatgtctg ttgaatttct gaagttgaaa acaaggatat atcattggag caagtgttgg 360

atcttgtatg gaatatggat ggatcacttg taaggacagt gcctgggaac tggtgtagct 420

gcaaggattg agaatggcat gcattagctc actttcattt aatccattgt caaggatgac 480

atgctttctt cacagtaact cagttcaagt actatggtga tttgcctaca gtgatgtttg 540

gaatcgatca tgctttcttc aaggtgacag gtctaaagag agaagaatcc agggaacagg 600

tagaggacat tgctttttca cttccaaggt gcttgatcaa catctccctg acaacacaaa 660

actagagcca ggggcctccg tgaactccca gagcatgcct gatagaaact catttctact 720

gttctctaac tgtggagtga atggaaattc caactgtatg ttcaccctct gaagtgggta 780

cccagtctct taaatctt 798

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acatagattt ttctaaaagg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaacataga tttttctaaa 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccaatcta tgtttttcct cttg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaccaagag gaaaaacata gatt 24

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cactaaaggg actagtcctg caggtctttt ttctcagaca 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaagagaag aggtcagaag cttaaaggag gtctgaacat 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacctgcagc ccaagctggt accaaaaatc tatgtttttc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggcgaattg aatttagcgg ccgcaagatt taagagactg 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgttcagac ctcctttaag cttctgacct cttctcttcc 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaaaacata gatttttggt accagcttgg gctgcaggtc 40

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atttcctgag tatgccaata 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

accttgatgc cgttcttctg c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cactgctcaa acactgtgag c 21

Claims

1.一种可用于指示ACE2表达量的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、设计并构建能切割ACE2基因组的sgRNA/Cas9蛋白共表达载体；

S2、构建含ACE2基因同源序列、标记基因的donor载体；

其中，所述sgRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的可用于指示ACE2表达量的构建方法，其特征在于：所述ACE2基因同源序列包括同源左臂序列和同源右臂序列，所述同源左臂序列如Seq ID No.2所示，所述同源右臂序列如Seq ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述的可用于指示ACE2表达量的构建方法，其特征在于：所述标记基因包含荧光标记基因。

4.根据权利要求3所述的可用于指示ACE2表达量的构建方法，其特征在于：所述荧光标记基因选自GFP荧光标记基因。

5.根据权利要求3所述的可用于指示ACE2表达量的构建方法，其特征在于：所述标记基因还包括抗生素筛选基因。

6.根据权利要求5所述的可用于指示ACE2表达量的构建方法，其特征在于：所述抗生素筛选标记基因选自嘌呤霉素抗性基因。

7.一种采用如权利要求1至6任一项所述的方法制得所述细胞株。

8.如权利要求7所述的细胞株在检测ACE2表达量试剂盒制备中的应用。

9.如权利要求7所述的细胞株在冠状病毒诊断试剂或治疗药物制备中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒为COVID-19。