CN115667929A - 检体中的目标分子的检测方法以及目标分子检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种检体中的目标分子的检测方法，包括：使检体中的目标分子、与所述目标分子结合的捕捉分子、以及由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与所述目标分子结合的标记化结合分子反应，从而形成由所述目标分子、所述捕捉分子以及所述标记化结合分子构成的复合体的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体形成工序；除去未与目标分子结合的所述标记化结合分子的工序；使所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体与对产生ATP的反应进行催化的酶的底物反应以产生ATP的ATP产生工序；对产生的ATP进行扩增的ATP扩增工序；以及对扩增了的ATP进行检测的ATP检测工序。

Description

检体中的目标分子的检测方法以及目标分子检测试剂盒
技术领域
本发明涉及检体中的目标分子的检测方法以及目标分子检测试剂盒。
背景技术
免疫测定法被广泛用作检测人的体液中的病毒和食品中的过敏原等目标物的方法。免疫色谱法(immunochromatography)是应用了在纤维素膜上检体一边溶解试剂一边缓慢流动的性质(毛细管现象)的免疫测定法，应用于妊娠诊断、流感检查等。
然而，虽然免疫色谱法具有能够非常简便地进行测定的优点，但是由于使用了基于显色的判定方法，因此灵敏度低。在流感等的判定中，在刚发病后的检体中病毒量少的情况下等，无法检测出病毒，有时需要经过直至病毒量充分增加的时间之后再测定。
ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫吸附测定)是通过利用各种抗原抗体反应的组合，将酶标记了的抗原或抗体组装到反应体系中来检测酶活性，从而检测检体中的目标分子的方法，与目视判定免疫色谱中通常采用的金属胶体的显色的方法相比，可以高灵敏度地检测目标分子。ELISA利用吸收光谱因酶反应而变化的底物(比色法)、发出荧光信号的底物(荧光法)、发光的底物(化学发光法、生物发光法)等，通过读板仪(plate reader)或光度计(Luminometer)等测定装置使酶活性数值化，从而能够检测/定量目标分子。
另一方面，已知使用对产生ATP的反应进行催化的酶，使用荧光素酶使产生的ATP发光，测定生成的发光量的ATP的定量法(专利文献1)。另外，已知一种使检体中的ATP扩增，并使用生物发光法对扩增后的ATP进行定量的方法(专利文献2)。然而，这些定量方法都是在ATP等的ATP转化反应中使用的分子的定量方法，不是使用对产生ATP的反应进行催化的酶作为标记酶来检测检体中的与ATP转化反应无关的目标分子的免疫测定方法。
作为使用对产生ATP的反应进行催化的酶作为标记酶进行检测的免疫测定方法，在非专利文献1中公开了使用乙酸激酶或丙酮酸磷酸双激酶作为标记酶的目标分子的免疫测定方法。然而，在该方法中，只能得到基于仅依赖于乙酸激酶或丙酮酸磷酸双激酶的代谢转换数的ATP产生量的发光信号，不能检测微量的ATP。另外，该方法将使用了容易分解的ADP的乙酸激酶带来的ATP供给作为初级反应，不适合检测试剂盒等的商业利用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平9-234099号公报
专利文献2：日本特开2001-299390号公报
非专利文献
非专利文献1：Anal Sci.2003 Jan；19(1):105-9.
发明内容
发明所要解决的课题
在诸如免疫色谱法或ELISA的免疫测定法中，通过抗体的标记物及其检测法来决定灵敏度。在免疫测定法中，能够以最高灵敏度检测分子的生物发光法在1个测定中能够检测出10-20mol(以分子数计为数千个)左右的分子，但是即使使用该生物发光法，每1个测定中也需要在检体中含有数千分子以上的目标分子，在其以下的分子数中无法检测出目标分子。
因此，本发明的目的在于提供在现有的免疫测定方法中，即使在由于检体中的目标分子的量在检测限以下而无法测定的情况下也能够测定的检体中的目标分子的检测方法以及目标分子检测试剂盒。
用于解决课题的手段
为了实现上述目的，本发明采用了以下构成。
[1]一种检体中的目标分子的检测方法，包括：
工序(1)：使检体中的目标分子、与所述目标分子结合的捕捉分子、以及由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与所述目标分子结合的标记化结合分子反应，从而形成由所述目标分子、所述标记化结合分子以及所述捕捉分子构成的复合体(以下称为目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体)的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体形成工序；
工序(2)：除去所述工序(1)中未与目标分子结合的所述标记化结合分子的工序；
工序(3)：使所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体与对产生ATP的反应进行催化的酶的底物反应以产生ATP的ATP产生工序；
工序(4)：对在所述工序(3)中产生的ATP进行扩增的ATP扩增工序；以及
工序(5)：对在所述工序(4)中扩增了的ATP进行检测的ATP检测工序。
[2]根据[1]所述的检测方法，包括：在所述工序(1)中，在形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体之前，预先除去检体中的ATP的工序。
[3]根据[1]或[2]所述的检测方法，其中，所述捕捉分子是与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体(aptamer)。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记化结合分子是由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是丙酮酸磷酸双激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸以及AMP。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是乙酰-CoA合成酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP、焦磷酸以及乙酰-CoA。
[7]根据[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是ATP硫酸化酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是腺苷5′-磷酸硫酸酐和焦磷酸。
[8]根据[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是II型多磷酸激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP和多磷酸。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(4)中，通过使用腺苷酸激酶和丙酮酸激酶来进行ATP的扩增。
[10]根据[1]～[8]中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(4)中，通过使用腺苷酸激酶和多磷酸激酶来进行ATP的扩增。
[11]根据[1]～[8]中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(4)中，通过使用腺苷酸激酶和乙酸激酶来进行ATP的扩增。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(5)中，通过使用荧光素酶来进行ATP的检测。
[13]一种检体中的目标分子检测试剂盒，包含：固定有与目标分子结合的捕捉分子的不溶性载体、由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与所述目标分子结合的标记化结合分子、对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂、以及检测ATP的试剂。
[14]根据[13]所述的检测试剂盒，其中，所述捕捉分子是与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体。
[15]根据[13]或[14]所述的检测试剂盒，其中，所述标记化结合分子是由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体。
[16]根据[13]～[15]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是丙酮酸磷酸双激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸以及AMP。
[17]根据[13]～[15]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是乙酰-CoA合成酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP、焦磷酸以及乙酰-CoA。
[18]根据[13]～[15]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是ATP硫酸化酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是腺苷5′-磷酸硫酸酐和焦磷酸。
[19]根据[13]～[15]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是II型多磷酸激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP和多磷酸。
[20]根据[13]～[19]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述扩增ATP的试剂是AMP、磷酸烯醇丙酮酸、镁离子、腺苷酸激酶以及丙酮酸激酶。
[21]根据[13]～[19]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述扩增ATP的试剂是AMP、多磷酸、镁离子、腺苷酸激酶以及多磷酸激酶。
[22]根据[13]～[19]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述扩增ATP的试剂是AMP、乙酰磷酸、镁离子、腺苷酸激酶以及乙酸激酶。
[23]根据[13]～[22]中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述检测ATP的试剂是D-荧光素和荧光素酶。
发明的效果
根据本发明的检体中的目标分子的检测方法，在现有的免疫测定方法中，即使在由于检体中的目标分子的量在检测限以下而无法测定的情况下，也能够检测检体中的目标分子。另外，根据本发明的检体中的目标分子检测试剂盒，提供在现有的免疫测定试剂盒中，即使在由于检体中的目标分子的量在检测限以下而无法测定的情况下，也能够检测检体中的目标分子的目标分子检测试剂盒。
附图说明
[图1]是示出使检体中的目标分子10、固定在不溶性载体40上且与目标分子10结合的捕捉分子20、以及由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的标记化结合分子30反应，从而在不溶性载体40上形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体的状态的图。
[图2]是示出将ATP的扩增工序和ATP的检测工序分开进行时的目标分子的检测方法的操作步骤的一个例子的图。
[图3]是示出同时进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序时的目标分子的检测方法的操作步骤的一个例子的图。
[图4]是示出同时进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序时的目标分子的定量方法的操作步骤的一个例子的图。
[图5A]是示出使用了本实施方式的目标分子的检测方法的免疫色谱法的构成例的侧面的图。
[图5B]是示出使用了本实施方式的目标分子的检测方法的免疫色谱法的构成例的上面的图。
[图6]是示出使用利用辊从外部对弹性容器施加力以进行送液的盒(cartridge)，并分别使用病毒作为目标分子10、DNA适体作为与目标分子10结合的捕捉抗体20、丙酮酸磷酸双激酶标记化重链可变区抗体作为由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的标记化结合物质30、腺苷酸激酶和丙酮酸激酶作为扩增ATP的酶、荧光素酶作为检测ATP的酶、环烯烃聚合物(COP)作为不溶性载体40的免疫色谱法的构成例和操作的一个例子的图。
[图7]是示出实施例1的样品编号1～7的样品的发光强度的曲线图。
[图8]是示出实施例2的组合使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体和扩增ATP的试剂的情况、单独使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体的情况、阴性对照(进行ATP扩增的情况和不进行ATP扩增的情况)的发光强度的曲线图。
[图9]是示出在实施例2的组合使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体和扩增ATP的试剂的情况、单独使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体的情况下，分别将进行ATP的扩增时的阴性对照的发光强度和未进行ATP的扩增时的阴性对照的发光强度作为背景减去后的发光强度的曲线图。
具体实施方式
本发明的检体中的目标分子的检测方法的特征在于，包括：
工序(1)：使检体中的目标分子、与所述目标分子结合的捕捉分子、以及由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与所述目标分子结合的标记化结合分子反应，从而形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体形成工序；
工序(2)：除去所述工序(1)中未与目标分子结合的所述标记化结合分子的工序；
工序(3)：使所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体与对产生ATP的反应进行催化的酶的底物反应以产生ATP的ATP产生工序；
工序(4)：对在所述工序(3)中产生的ATP进行扩增的ATP扩增工序；以及
工序(5)：对在所述工序(4)中扩增了的ATP进行检测的ATP检测工序。
以下，对本发明的检体中的目标分子的检测方法的实施方式进行说明。
需要说明的是，在以下的描述中，除非另外指明，否则捕捉分子、标记化结合分子分别指与目标分子结合的捕捉分子、由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与目标分子结合的标记化结合分子。
[工序(1)]
工序(1)是使检体中的目标分子、捕捉分子、以及标记化结合分子反应，从而形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体形成工序。
在工序(1)中，作为使检体中的目标分子、捕捉分子、以及标记化结合分子反应的方法，可以是使检体中的目标分子、捕捉分子、以及标记化结合分子同时反应的方法；也可以是使目标分子和捕捉分子反应以形成由目标分子和捕捉分子构成的目标分子/捕捉分子复合体，然后使标记化结合分子反应的方法。另外，也可以是使目标分子和标记化结合分子反应以形成由目标分子和标记化结合分子构成的目标分子/标记化结合分子复合体，然后使捕捉分子反应的方法。
所述捕捉分子可以不固定在不溶性载体上、也可以固定在不溶性载体上，但是优选固定。
图1是示出在所述工序(1)中，使检体中的目标分子10、固定在不溶性载体40上的捕捉分子20、以及标记化结合分子30反应，从而在不溶性载体40上形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体的状态的图。在捕捉分子20固定在不溶性载体40上的情况下，在后述的工序(2)中，通过用清洗液清洗不溶性载体40，能够容易地从未反应成分(来自检体的成分、未与目标分子10结合的标记化结合分子30等)中分离出在工序(1)中形成的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体。作为清洗液，可以列举出磷酸缓冲生理盐水(以下也称为PBS)、含有表面活性剂的PBS、后述的水性介质等。作为所述表面活性剂，例如可以列举出吐温(Tween)20等非离子性表面活性剂等。
作为所述不溶性载体40，只要能够将所述捕捉分子20固定即可，没有特别地限制。作为不溶性载体40的优选材料，可以列举出聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、明胶、琼脂糖、纤维素、硝基纤维素、纤维素乙酸酯、醋酸纤维素、环烯烃聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯等高分子材料、玻璃、陶瓷、磁性粒子或金属等，优选不吸附蛋白质、且能够抑制标记化结合分子30向不溶性载体的非特异性结合的醋酸纤维素、环烯烃聚合物等。作为不溶性载体的优选形状，可以列举出管、珠子、板、基板、胶乳等微粒子、棍状物等。
作为捕捉分子20向不溶性载体40的固定方法，可以使用利用物理结合的方法和利用化学结合的方法或它们的并用等公知的方法。作为物理结合，例如可以列举出静电结合、氢结合、疏水结合等。作为化学结合，例如可以列举出共价结合、配位结合等。例如，在将环聚烯烃系聚合物制的基板用作不溶性载体40的情况下，可以列举出以下方法：通过在所述基板中添加捕捉分子20的溶液，在4℃～30℃孵育1小时～1天，使其物理吸附并固定。
捕捉分子20可以直接固定在不溶性载体40上，也可以间接固定在不溶性载体40上。作为间接的固定方法，例如可以列举出以下方法：在固定有亲和素(Avidin)的不溶性载体40中添加生物素(Biotin)化了的捕捉分子20的溶液，经由生物素和亲和素的特异性结合将捕捉分子20固定在不溶性载体40上。另外，也可以在不溶性载体40上固定与捕捉分子20特异性结合的抗体，经由该抗体将捕捉分子20固定在不溶性载体40上。或者，捕捉分子20可以经由连接子(Linker)的共价结合而固定在不溶性载体40上。作为连接子，例如可以列举出能够与捕捉分子20的官能团和不溶性载体40保持在其表面的官能团二者共价结合的分子等。作为所述分子，优选在同一分子内具有能够与捕捉分子20的官能团反应的第1反应活性基团和能够与不溶性载体40保持在其表面上的官能团反应的第2反应活性基团的分子。其中，特别优选第1反应活性基团和第2反应活性基团为不同基团的分子。作为捕捉分子20的官能团和不溶性载体40保持在其表面的官能团，可以列举出羧基或氨基、缩水甘油基、氢硫基、羟基、酰胺基、亚氨基、N-羟基琥珀酰基、马来酰亚胺基等。作为连接子中的活性反应性基团，可以列举出烯丙基叠氮化物、碳二亚胺、酰肼、醛、羟甲基膦、酰亚胺酯、异氰酸酯、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、五氟苯基(PFP)酯、Solarene、吡啶二硫化物、乙烯基砜等基团。
在本实施方式的检测方法中，作为检体，没有特别地限制，例如可以列举出：人等哺乳动物的血液、血细胞、血清、血浆、髓液、尿、汗、唾液、羊水、胰液等体液或组织等；食品或来自食品的提取物；动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、微生物细胞的细胞培养液等；医疗设备等的清洗液等。检体可以是从检测对象物中采集的检体，也可以是对采集的检体进行通常进行的稀释、浓缩等处理而得的检体。另外，本实施方式的检测方法中使用的检体可以是在实施本实施方式的检测方法时采集或制备的检体，也可以是预先采集或制备并保存的检体。
在本实施方式的检测方法中，作为目标分子10，只要是在本实施方式的检测方法中作为检测对象的分子且能够通过本实施方式的检测方法进行检测即可，没有特别地限制，例如可以列举出蛋白质、核酸、脂质、维生素、多糖类、低分子化合物等。作为核酸，可以列举出DNA、RNA等。另外，作为蛋白质，可以列举出酶、激素、各种肽等。
在本实施方式的检测方法中，作为捕捉分子20，只要是能够与检体中的目标分子10特异性结合的分子即可，没有特别地限制，例如可以列举出与所述目标分子10特异性结合的抗体或抗体片段、与所述目标分子10特异性结合的适体等。作为所述抗体，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体中的任一者，但是优选单克隆抗体。作为抗体片段，例如可以列举出F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、它们的变异体、包含抗体部分的融合蛋白或融合肽等。
作为所述抗体片段，也可以使用骆驼科动物抗体的重链可变区抗体(以下也称为VHH抗体)。VHH抗体可以仅在重链可变区与抗原结合。另外，VHH抗体可以串联化使用，通过串联化，可以提高与作为目标分子的抗原的结合亲和性，可以减轻与除抗原以外的分子的非特异性结合。
这些抗体和抗体片段可以通过公知的方法制作。
作为与检体中的目标分子特异性结合的适体，可以是DNA适体、RNA适体等核酸适体，也可以是肽适体。核酸适体可以通过离体筛选(in vitro selection)法、SELEX法等公知的方法制作。另外，核酸适体可以通过2’-氟化嘧啶或PEG链等进行分子修饰，通过所述分子修饰，可以延长核酸适体的半衰期。
在本实施方式的检测方法中，作为对产生ATP的反应进行催化的酶，只要是能够对产生ATP的反应进行催化的酶即可，没有特别地限制，例如可以列举出丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase；以下也称为PPDK)、乙酰-CoA合成酶(Acetyl-CoAsynthetase)、ATP硫酸化酶(ATP-Sulfurylase)、II型多磷酸激酶等，优选PPDK。
如下述式所示，PPDK是以下公知的酶：在作为辅助因子的镁离子的存在下，作用于AMP、磷酸烯醇丙酮酸及焦磷酸(PPi)，以催化产生ATP、丙酮酸及磷酸(Pi)的反应，也催化其逆反应，也称为丙酮酸正磷酸双激酶。
[化学式1]
Figure BDA0003949362440000111
在本实施方式的检测方法中，作为标记化结合分子30，只要是由所述对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与目标分子10结合的分子即可，没有特别地限制，例如可以列举出由所述对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与所述目标分子10特异性结合的抗体或抗体片段、或适体等。标记化结合分子30可以在与捕捉分子20不同的部分处与目标分子10结合，也可以在与捕捉分子20相同的部分处与目标分子10结合。
作为所述标记化结合分子30中的抗体、抗体片段以及适体，分别列举出上述的捕捉分子20中的抗体、抗体片段以及适体。作为所述标记化结合分子30和所述捕捉分子20的组合，可以是抗体彼此，也可以是抗体和抗体片段的组合、抗体和适体的组合、抗体片段和适体的组合等中的任意一种。
所述标记化结合分子30的标记化可以通过在与目标分子10结合的分子的官能团、与对产生ATP的反应进行催化的酶的官能团之间，经由连接子或不经由连接子而产生共价结合的反应来进行。作为官能团，可以列举出羧基或氨基、缩水甘油基、氢硫基、羟基、酰胺基、亚氨基、羟基琥珀酰酯基、马来酰亚胺基、异硫氰酸酯基等。可以在该官能团彼此之间进行缩合反应。
作为不经由连接子的结合方法，例如可以列举出使用EDC等碳二亚胺化合物的方法等。在这种情况下，也可以使用NHS或其衍生物等活性酯。异硫氰酸酯基和氨基之间的缩合反应不需要其他试剂，仅在中性～弱碱性的条件下混合进行，因此优选。
作为连接子，例如可以列举出在分子内具有以下两者的官能团的分子：与与目标分子10结合的分子的官能团反应的官能团、和与对产生ATP的反应进行催化的酶的官能团反应的官能团。作为所述在分子内具有两者的官能团的分子，优选在同一分子内具有能够与与所述目标分子10结合的分子的氨基酸残基反应的第1官能团、和能够与对产生ATP的反应进行催化的酶的官能团反应的第2官能团的分子。其中，特别优选第1官能团和第2官能团为不同基团的分子。作为连接子的官能团，例如可以列举出上述的官能团。
另外，在与目标分子10结合的分子为抗体、抗体片段等蛋白质的情况下，也可以将与目标分子10结合的分子和对产生ATP的反应进行催化的酶作为一个融合蛋白质来制造。在所述融合蛋白质中，可以在与目标分子10结合的分子、与对产生ATP的反应进行催化的酶之间插入数个残基至数十个残基的连接肽。另外，在所述融合蛋白质中，对产生ATP的反应进行催化的酶可以融合到结合目标分子10的分子的N末侧和C末侧中的任一者。
优选的是，在工序(1)中，在形成所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体之前，预先除去检体中的ATP。在工序(1)中，通过在形成所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体之前，预先除去检体中的ATP，可以在后述的工序(4)中，抑制因存在于检体中的ATP而使ATP扩增从而产生假阳性，从而能够准确地检测出检体中的目标分子10。
作为在形成所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体之前预先除去检体中的ATP的方法，只要是能够除去检体中的ATP的方法即可，没有特别地限制，例如可以列举出通过清洗除去ATP的方法，使腺苷磷酸脱氨酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、己糖激酶等分解ATP的酶发挥作用而分解除去ATP的方法等。
[工序(2)]
工序(2)是除去工序(1)中未与目标分子10结合的标记化结合分子30的工序。通过除去工序(1)中未与目标分子结合的标记化结合分子30，能够抑制假阳性的发生，能够准确地检测目标分子。另外，除了除去工序(1)中未与目标分子结合的标记化结合分子30以外，还可以除去除目标分子10以外的来自检体的成分。
在工序(2)中，作为除去未与目标分子结合的所述标记化结合分子30的方法，没有特别地限制，例如可以列举出清洗、离心分离等，优选清洗。例如，可以列举出使用清洗液清洗固定有捕捉分子/目标分子/标记化结合分子复合体的不溶性载体的方法。作为清洗液，可以列举出PBS、含有表面活性剂的PBS、后述的水性介质等。作为所述表面活性剂，例如可以列举出吐温(Tween)20等非离子性表面活性剂等。
[工序(3)]
工序(3)是使所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体与对产生ATP的反应进行催化的酶的底物反应以产生ATP的ATP产生工序。
作为所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物，可以根据所述对产生ATP的反应进行催化的酶来适当决定。例如，当所述对产生ATP的反应进行催化的酶是PPDK时，可以列举出磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸以及AMP。当所述对产生ATP的反应进行催化的酶是乙酰-CoA合成酶(Acetyl-CoA synthetase)时，可以列举出AMP、焦磷酸以及乙酰-CoA。当所述对产生ATP的反应进行催化的酶是ATP硫酸化酶(ATP-Sulfurylase)时，可以列举出腺苷5′-磷酸硫酸酐和焦磷酸。当所述对产生ATP的反应进行催化的酶是II型多磷酸激酶时，可以列举出AMP和多磷酸。需要说明的是，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物与所述对产生ATP的反应进行催化的酶的反应根据所使用的酶，在镁离子等辅助因子的存在下进行。
在使用由PPDK标记了的标记化结合分子作为对产生ATP的反应进行催化的酶的情况下，通过在作为辅助因子的镁离子的存在下，使磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸(PPi)以及AMP与所述工序(1)中生成的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体反应，从而产生丙酮酸、磷酸(Pi)以及ATP。将该产生的ATP提供给下一工序(4)的ATP扩增工序。
[工序(4)]
工序(4)是对在所述工序(3)中产生的ATP进行扩增的ATP扩增工序。作为扩增ATP的方法，没有特别地限制，但是优选使用扩增ATP的试剂的方法。作为扩增ATP的试剂，可以列举出扩增ATP的酶及其底物。当使用扩增ATP的酶及其底物时，扩增ATP的试剂包含该酶反应所需的辅助因子。作为扩增ATP的酶，例如可以列举出腺苷酸激酶(以下也称为AK)与丙酮酸激酶(以下也称为PK)的组合、AK与多磷酸激酶的组合、AK与肌酸激酶的组合、AK与乙酸激酶的组合等，优选AK与PK的组合。
作为扩增ATP的酶的底物和辅助因子，可以根据扩增ATP的酶来适当决定。例如，当扩增ATP的酶是AK与PK的组合时，作为扩增ATP的酶的底物，可以列举出AMP和磷酸烯醇丙酮酸，作为辅助因子，可以列举出镁离子。当扩增ATP的酶是AK与多磷酸激酶的组合时，作为扩增ATP的酶的底物，可以列举出AMP和多磷酸，作为辅助因子，可以列举出镁离子。当扩增ATP的酶是AK与肌酸激酶的组合时，作为扩增ATP的酶的底物，可以列举出AMP和磷酸肌酸，作为辅助因子，可以列举出镁离子。当扩增ATP的酶是AK与乙酸激酶的组合时，作为扩增ATP的酶的底物，可以列举出AMP和乙酰磷酸，作为辅助因子，可以列举出镁离子。
使用AK与PK的组合对ATP进行扩增的方法由下述反应式表示。
[化学式2]
Figure BDA0003949362440000151
在使用AK与PK的ATP的扩增方法中，在作为辅助因子的镁离子的存在下，使用AK，由工序(3)中产生的1分子的ATP和1分子的AMP产生2分子的ADP。接着，在作为辅助因子的镁离子的存在下，使用PK，由产生的2分子的ADP和2分子的磷酸烯醇丙酮酸产生2分子的丙酮酸和2分子的ATP(第1循环)。通过再次使用上述AK与PK的反应体系，使在第1循环中产生的2分子的ATP产生4分子的ATP(第2循环)。通过重复n次该循环，在第n循环中使ATP扩增为2n倍。
工序(4)也可以与所述工序(3)同时进行。在工序(4)与工序(3)同时进行的情况下，在工序(3)中，通过在所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体中添加对产生ATP的反应进行催化的酶的底物和扩增ATP的试剂，可以同时进行ATP的产生和ATP的扩增。例如，在对产生ATP的反应进行催化的酶是PPDK、且使用AK与PK使ATP扩增的情况下，通过在所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体中添加磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸(PPi)、AMP、AK、PK以及镁离子，从而可以同时进行ATP的产生和扩增。
[工序(5)]
工序(5)是对在所述工序(4)中扩增了的ATP进行检测的ATP检测工序。作为对ATP进行检测的方法，没有特别地限制，优选使用检测ATP的试剂的方法。作为检测ATP的试剂，可以列举出与ATP反应而产生色素或发光的酶及其底物、或与ATP反应而产生过氧化氢的酶及其底物等。
作为使用检测ATP的试剂的方法，可以列举出：使用荧光素酶测定由ATP和D-荧光素产生的发光的方法；并用葡糖激酶和乙酸激酶作为检测ATP的酶，对由ATP和葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸的反应进行扩增，进一步组合葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和心肌黄酶(diaphorase)以进行可目视的显色反应的方法(日本特开2003-225098)；并用己糖激酶和丙酮酸激酶，对由ATP和D-葡萄糖生成葡萄糖6-磷酸的反应进行扩增，根据使用了1-甲氧基-5-吩嗪硫酸甲酯和Isoluminol的化学发光进行定量的方法(日本特开昭64-23900)；在ATP中加入核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶，对反应中生成的过氧化氢进行定量的方法(日本特开昭63-11848)；使ATP分解酶作用于ATP，测定由生成的磷酸和钼的反应产生的钼蓝的方法(日本特开平4-360700号等)；使烟酰胺单核苷酸和腺苷酰转移酶作用于ATP，使生成的NAD进行以NAD为辅酶的氧化还原反应体系和以还原型NAD为辅酶的辅酶循环反应来进行定量的方法(日本特开昭59-166099)等，优选使用荧光素酶测定由ATP和D-荧光素产生的发光的方法。另外，作为对ATP进行检测的方法，也可以使用利用比色或荧光以检测ATP量的市售试剂盒(例如，ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit、BioVision公司制造)。
使用荧光素酶作为检测ATP的酶，并通过在工序(4)中扩增的ATP和D-荧光素产生发光的反应式如下所示。
[化学式3]
Figure BDA0003949362440000161
作为荧光素酶，例如可以使用来自Photinus pyralis等萤火虫和叩头虫等的甲虫荧光素酶、甲虫荧光素酶的重组体、赋予了耐热性和/或耐化学品性的甲虫荧光素酶的变异体、或者与ATP、荧光素、分子状氧、以及作为辅助因子的镁或其他任意二价阳离子反应以生成发光的任意的荧光素酶。另外，作为荧光素酶的底物，除了D-荧光素以外，还可以使用氨基荧光素或AkaLumine等荧光素类似物(analogue)。
与工序(3)中的ATP产生反应和工序(4)中的ATP扩增反应相比，工序(5)中的ATP的检测反应的反应速度慢，因此工序(5)即使与工序(3)和工序(4)同时进行也能够检测ATP。在同时进行工序(3)、工序(4)以及工序(5)情况下，在工序(3)中，在所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体中添加对产生ATP的反应进行催化的酶的底物，同时添加扩增ATP的试剂和检测ATP的试剂，从而可以同时进行ATP的产生、扩增以及检测。例如，在对产生ATP的反应进行催化的酶为PPDK、在ATP的扩增中使用AK和PK、用荧光素酶检测ATP的情况下，在工序(3)中，通过在所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体中加入磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸、AMP、AK、PK、D-荧光素、荧光素酶以及作为辅助因子的镁离子，可以同时进行ATP的产生、扩增以及检测。
通过使用已知浓度的目标分子代替检体来进行工序(1)至工序(5)，从而制作表示目标分子的浓度与ATP检测工序中的信号的关系的检量线，使用制作的检量线和检体，进行工序(1)至工序(5)，根据在工序(5)中检测出的信号的测定值可以定量检体中的目标分子的浓度。
另外，通过使用已知浓度的目标分子，进行工序(1)至工序(5)，测定ATP的检测工序中来自信号产生的信号强度的经时变化以制作信号强度的增加曲线，使用检体，进行工序(1)至工序(5)，并与工序(5)中的信号强度的增加曲线进行曲线拟合(Curve fitting)，也可以定量检体中的目标分子的浓度。
在本实施方式的目标分子的检测方法中，工序(1)及工序(3)～工序(5)优选在水性介质中进行。作为所述水性介质，例如可以列举出去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。作为缓冲液的制备中使用的缓冲剂，只要具有缓冲能力即可，没有特别地限定，例如可以列举出pH1～11的乳酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、邻苯二甲酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、三乙醇胺缓冲剂、二乙醇胺缓冲剂、赖氨酸缓冲剂、巴比妥缓冲剂、咪唑缓冲剂、苹果酸缓冲剂、草酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、碳酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、Tris缓冲剂、Good缓冲剂等。
缓冲液的浓度只要是适于检测目标分子的浓度即可，没有特别地限制，优选为0.001～2.0mol/L、更优选为0.005～1.0mol/L、特别优选为0.01～0.1mol/L。
接下来，对通过本实施方式的目标分子的检测方法检测和定量目标分子的操作步骤进行说明。图2是示出将ATP的扩增工序和ATP的检测工序分开进行时的目标分子的检测方法的操作步骤的一个例子的图。
在分开进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序时的目标分子的检测方法中，首先，将检体和标记化结合分子30混合，将得到的检体和标记化结合分子30的混合物添加到固定有捕捉抗体20的不溶性载体40上。结果，目标分子/标记化结合分子复合体结合在固定于不溶性载体40上的捕捉抗体20上，从而在不溶性载体40上形成了目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体。接着，使用清洗液清洗不溶性载体40，除去未与目标分子10结合的标记化结合分子30。在清洗不充分的情况下，重复清洗。清洗是否充分例如可以通过清洗液中是否存在未与目标分子10结合的标记化结合分子30来判断。如果在清洗液中不存在标记化结合分子30，则可以判断为清洗充分。
如果清洗充分，接下来，将包含对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂、检测ATP的酶、以及根据需要的所述酶的辅助因子的酶反应液(以下也称为酶反应液1)添加到不溶性载体40中，通过扩增ATP的试剂对由标记于标记化结合分子30的对产生ATP的反应进行催化的酶所产生的ATP进行扩增。在ATP产生反应和ATP扩增反应经过充分的时间的情况下，进入ATP检测工序。在ATP产生反应和ATP扩增反应没有经过充分的时间、ATP的扩增量不充分的情况下，延长反应时间。ATP的扩增量是否充分可以通过是否能够检测出扩增了的ATP来判断。
在ATP的产生反应和扩增反应时间充分、并且扩增了用于检测的足够量的ATP的情况下，添加用于检测ATP的底物(以下也称为酶反应液2)，测定产生的信号。例如，如果产生的信号为发光，则测定发光信号强度。在产生的信号强度超过一定的阈值的情况下，可以判定为检体中含有目标分子10。在产生的信号强度不超过一定的阈值的情况下，可以判定为在检体中不含有目标分子10。判定为检体中含有目标分子10的信号强度的阈值可以根据检测目的和检测灵敏度等适当设定。
图3是示出同时进行ATP的扩增工序和检测工序时的目标分子的检测方法的操作步骤的一个例子的图。
在同时进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序时的目标分子的检测方法中，直到使用清洗液清洗不溶性载体40以除去未与目标分子10结合的标记化结合分子30的工序为止，与上述分开进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序的情况相同。在同时进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序的情况下，在清洗不溶性载体40后，将酶反应液1和酶反应液2添加到不溶性载体40中，对由标记于标记化结合分子30的对产生ATP的反应进行催化的酶所产生的ATP进行扩增的反应，同时进行扩增了的ATP的检测反应。当反应经过充分的时间时，测定反应中产生的信号。在反应没有经过充分的时间、ATP的检测量不充分的情况下，延长反应时间。反应时间是否充分可以通过反应中产生的信号的强度来判断。
当反应时间充分并且产生信号时，测定信号强度。在产生的信号强度超过一定的阈值的情况下，可以判定为检体中含有目标分子10。在产生的信号强度不超过一定的阈值的情况下，可以判定为检体中不含有目标分子10。
图4是示出同时进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序时的目标分子的定量方法的操作步骤的一个例子的图。
在同时进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序时的目标分子的定量方法中，直至使用清洗液清洗不溶性载体40以除去未与目标分子10结合的标记化结合分子30的工序为止，与上述分开进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序的目标分子的检测方法的情况相同。在同时进行ATP的扩增工序和ATP的检测工序的目标分子的定量方法的情况下，在清洗不溶性载体40后，将酶反应液1和酶反应液2添加到不溶性载体40中，对由标记于标记化结合分子30的对产生ATP的反应进行催化的酶所产生的ATP进行扩增，同时进行扩增了的ATP的检测反应，测定在ATP检测反应中产生的信号的强度从信号产生开始时间起的经时变化。在反应没有经过充分的时间、信号强度在定量上不充分的情况下，延长反应时间。
在反应时间充分、信号强度在定量上充分的情况下，与预先使用已知浓度的目标分子同样地产生信号而制作的信号强度的经时变化数据进行拟合，计算包含在检体中的目标分子的量。
接下来，对使用了本实施方式的目标分子的检测方法的免疫色谱法的具体例进行说明。使用了本实施方式的目标分子的检测方法的免疫色谱法可以使用ELISA法中广泛使用的装置。
图5A示出使用了本实施方式的目标分子的检测方法的免疫色谱法的构成例的侧面图。图5B示出使用了本实施方式的目标分子的检测方法的免疫色谱法的构成例的上面图。使用了本实施方式的目标分子的检测方法的免疫色谱法由检体添加部50、第1试剂容纳部51、第2试剂容纳部52、流路53、混合/反应部54、检测部55以及废液容纳部56构成。第1试剂容纳部51容纳标记化结合分子30(以下也称为试剂1)。第2试剂容纳部52容纳对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂以及检测ATP的酶(以下也称为试剂2)。混合/反应部54容纳固定有捕捉分子20的不溶性载体40。需要说明的是，混合/反应部54也可以兼作检测部55。
首先，使用移液管等将检体添加到检体添加部50中，向流路53送液。检体的送液也可以使用利用了机械的自动送液。自动送液例如也可以使用通过泵或辊从外部对弹性容器施加力而进行送液的盒来进行。在图5A、图5B中，示出了使用辊57送液的例子。
接着，容纳在第1试剂容纳部51中的试剂1通过辊57向流路53送液，与检体混合，形成目标分子/标记化结合分子复合体，并供给到混合/反应部54。供给到混合/反应部54的目标分子/标记化结合分子复合体被固定在容纳于混合/反应部54的不溶性载体40上的捕捉分子20捕捉，从而在不溶性载体40上形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体。
接着，用清洗液清洗混合/反应部54后，通过辊57将容纳在第2试剂容纳部52中的试剂2通过流路53送液到混合/反应部54，添加到固定在容纳于混合/反应部54中的不溶性载体40上的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体中，产生ATP并使其扩增。接着，当在混合/反应部54中添加检测ATP的底物时，扩增了的ATP、检测ATP的酶以及检测ATP的酶的底物发生反应，产生信号。所产生的信号通过检测部55中与信号响应的检测器测定。作为所述检测器，可以列举出读板仪、光度计、光电倍增管(PMT)、电荷耦合元件(CCD)、CMOS、感光材料(照相胶片、即时胶片、印刷纸等)等。信号测定后的反应液和清洗液被容纳在废液容纳部56中并被废弃。
接着，使用图6说明：使用利用辊从外部对弹性容器施加力以进行送液的盒，并分别使用病毒作为目标分子10、PPDK标记化VHH抗体作为标记化结合物质30、DNA适体作为捕捉抗体20、环烯烃聚合物(COP)作为不溶性载体40、AK与PK的组合作为扩增ATP的酶、荧光素酶作为检测ATP的酶、D-荧光素作为检测ATP的底物的免疫色谱法的构成例和操作的一个例子。
(1)检体添加
将检体从检体添加部50添加到盒中。在图6中，作为检体，以含有病毒的唾液为例进行表示。
(2)病毒/PPDK标记化VHH抗体复合体的形成
检体和容纳在第1试剂容纳部51中的PPDK标记化VHH抗体(试剂1)由辊57送液，将检体和PPDK标记化VHH抗体混合。PPDK标记化VHH抗体与检体中的病毒形成复合体。
(3)DNA适体的病毒/PPDK标记化VHH抗体复合体的捕捉
病毒/PPDK标记化VHH抗体复合体被固定于不溶性载体40的捕捉分子20即DNA适体捕捉，从而形成病毒/PPDK标记化VHH抗体/DNA适体复合体。
(4)清洗
用辊57输送容纳在清洗液容纳部58中的清洗液，清洗在容纳于混合/反应部54中的COP上所形成的病毒/PPDK标记化VHH抗体/DNA适体复合体。进行多次清洗。通过该清洗，除去未与检体中的ATP或病毒结合的PPDK标记化VHH抗体。
(5)试剂2的添加
用辊57将容纳在第2试剂容纳部52中的包含磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸(PPi)、AMP、AK、PK以及荧光素酶(Luc)的试剂2送液到混合/反应部54。
(6)ATP的产生和扩增
试剂2与在COP上所形成的病毒/PPDK标记化VHH抗体/DNA适体反应，发生ATP的产生和ATP的扩增。静置直至反应充分进行。
(7)检测ATP的酶的底物的添加
在混合/反应部54中添加作为检测ATP的酶的荧光素酶的底物D-荧光素。当添加D-荧光素时，试剂2中的荧光素酶、扩增了的ATP与D-荧光素反应，产生发光信号。
(8)发光信号的检测
使用光电倍增管(PMT)、电荷耦合元件(CCD)、CMOS等检测器测定(7)中产生的发光信号。在发光信号高于预先设定的阈值的情况下，可以判定为检体(唾液)中存在病毒。在发光信号低于预先设定的阈值的情况下，判定为检体(唾液)中不存在病毒。
接下来，对本实施方式的检测目标分子的试剂盒进行说明。
本实施方式的检测目标分子的试剂盒是本实施方式的检测目标分子的方法中使用的试剂盒，包含捕捉分子、标记化结合分子、对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂、以及检测ATP的试剂。
作为本实施方式的检测目标分子的试剂盒中的捕捉分子、标记化结合分子、对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂、以及检测ATP的试剂，可以列举出分别在上述的本实施方式的检测目标分子的方法中列举出的捕捉分子、标记化结合分子、对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂以及检测ATP的试剂。
本实施方式的试剂盒还可以进一步包括通过本实施方式的检测目标分子的方法用于检测目标分子所需的试剂和装置。
本实施方式的试剂盒除了捕捉分子、标记化结合分子、对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂、以及检测ATP的试剂以外，还可以包含基板等不溶性载体。在这种试剂盒的情况下，将捕捉抗体20固定在基板等不溶性载体40上。作为包含固定有捕捉抗体20的不溶性载体40的试剂盒，可以列举出包含上述图5所示的由检体添加部50、第1试剂容纳部51、第2试剂容纳部52、流路53、混合/反应部54、检测部55以及废液容纳部56构成的盒、由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的标记化结合分子30、对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂以及检测ATP的试剂的试剂盒。在第1试剂容纳部51中，可以容纳标记化结合分子30(试剂1)。在第2试剂容纳部52中，可以容纳含有对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、扩增ATP的试剂、检测ATP的酶的试剂(试剂2)。在混合/反应部54中容纳固定有捕捉分子20的不溶性载体40。需要说明的是，第1试剂容纳部51、第2试剂容纳部52中可以分别预先容纳试剂1、试剂2。
在这样的试剂盒的情况下，使用移液管等将检体添加到检体添加部50中，向流路53送液。送液也可以使用利用了机械的自动送液。自动送液例如也可以通过泵或辊从外部对弹性容器施加力来进行送液。
本实施方式的试剂盒还可以进一步包含必要的缓冲液、酶反应停止液、读板仪或光度计等检测器、产品说明书等。
接下来，对本实施方式的试剂盒的使用方法的一个例子进行说明。
首先，通过辊57将容纳在第1试剂容纳部51中的试剂1向流路53送液，与检体混合，形成目标分子/标记化结合分子复合体，并供给到混合/反应部54。供给到混合/反应部54的目标分子/标记化结合分子复合体被固定在容纳于混合/反应部54中的不溶性载体40上的捕捉分子20捕捉，从而在不溶性载体40上形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体。
接着，用清洗液清洗混合/反应部54后，利用辊57将容纳在第2试剂容纳部52中的试剂2通过流路53输送到混合/反应部54。接着，在容纳在混合/反应部54中的不溶性载体40上所形成的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体中添加试剂2，产生并扩增ATP。接着，向混合/反应部54中添加检测ATP的底物，使扩增了的ATP、检测ATP的酶以及检测ATP的酶的底物反应而产生信号。通过检测部55中与信号响应的检测器测定所产生的信号。作为上述检测器，可以列举出读板仪或光度计等。信号测定后的反应液和清洗液容纳在废液容纳部56中并废弃。
本发明的适用范围不限于上述实施方式。本发明可以广泛应用于利用免疫测定方法检测检体中包含的目标分子的方法及试剂盒。
实施例
以下，基于实施例更详细地说明本发明，但是本发明不限于此。
(实施例1)
比较单独使用对产生ATP的反应进行催化的酶时和组合使用对产生ATP的反应进行催化的酶和扩增ATP的试剂时的信号强度。作为对产生ATP的反应进行催化的酶，使用PPDK。作为扩增ATP的酶，使用AK和PK。作为检测ATP的试剂，使用甲虫荧光素酶及其底物。以下示出本实施例中使用的试剂。
·丙酮酸磷酸双激酶(PPDK、BioVision公司制造)
·腺苷酸激酶(AK、Sigma公司制造)
·丙酮酸激酶(PK、Sigma公司制造)
·甲虫荧光素酶(Luc、Sigma公司制造)
·AMP(富士胶片和光纯药公司制造)
·焦磷酸(PPi、富士胶片和光纯药公司制造)
·D-荧光素(富士胶片和光纯药公司制造)
·磷酸烯醇丙酮酸(PEP、富士胶片和光纯药公司制造)
·ATP(富士胶片和光纯药公司制造)
·MgCl2(富士胶片和光纯药公司制造)
接下来，将这些试剂以成为下表1所示的最终浓度的方式溶解于PBS(pH7.4)中，制备样品编号为1～7的样品。
[表1]
表1
Figure BDA0003949362440000251
各样品在96孔板(Perkin-Elmer公司制造)的各孔内以分别成为50μl的方式制备(N＝4)。样品制备后，为了进行ATP产生反应和ATP扩增反应，在室温下孵育10分钟。孵育后，以最终浓度成为2mM的方式添加D-荧光素，使用多模式读板仪Envision(Perkin-Elmer公司制造)测定各样品的发光强度。发光强度的测定通过测定96孔板的各孔每1秒的发光量(count per sec；cps)的方法来进行。结果如图7所示。
如图7所示，单独使用PPDK、不进行使用了AK和PK的ATP扩增反应时的样品编号4和样品编号5的样品的发光强度的平均值分别为152520、28410。与此相对，在PPDK中组合使用采用了AK和PK的ATP扩增反应时的样品编号1和样品编号2的样品的发光强度的平均值分别为4952945、3451598。样品编号1的样品显示出样品编号4的样品的32.5倍的发光强度，样品编号2的样品显示出样品编号5的样品的121.5倍的发光强度，表示在PPDK浓度较低的条件下，ATP产生反应和ATP扩增反应的组合有利于信号增强。
由以上表明，与单独使用对产生ATP的反应进行催化的酶的方法相比，将对产生ATP的反应进行催化的酶和扩增ATP的试剂组合使用的本发明的方法在ATP的检测中具有显著的效果。此外，由于在对产生ATP的反应进行催化的酶PPDK的量少的情况下信号增强的效率提高，因此认为即使在与目标分子结合的标记化结合分子的量少的情况下，即目标分子少的情况下，本发明的目标分子的检测方法也能够检测目标分子。
(实施例2)
使用由PPDK标记了的抗BSA-骆驼科动物抗体的重链可变区抗体(以下也称为PPDK标记抗BSA-VHH抗体)进行BSA的检测，比较单独使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体时和组合使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体和扩增ATP的试剂时的信号强度。使用AK和PK作为扩增ATP的酶。作为检测BSA的试剂，使用甲虫荧光素酶及其底物。以下示出本实施例中使用的试剂。
·PPDK标记抗BSA-VHH抗体(RePHAGEN公司制造)
·生物素标记抗BSA抗体(ITEA公司制造)
·腺苷酸激酶(AK、Nipro公司制造)
·丙酮酸激酶(PK、Nipro公司制造)
·甲虫荧光素酶(Luc、Sigma公司制造)
·AMP(富士胶片和光纯药公司制造)
·焦磷酸(PPi、富士胶片和光纯药公司制造)
·D-荧光素(富士胶片和光纯药公司制造)
·磷酸烯醇丙酮酸(PEP、富士胶片和光纯药公司制造)
·MgCl2(富士胶片和光纯药公司制造)
使用上述试剂，按照以下步骤检测BSA。
(1)板的准备
使用洗板机Wellwash Versa(Thermo公司制造)，用300μl的PBS将NuncImmobilizer Streptavidin F96 Black板(Thermo公司制造)清洗3次。接着，在各孔中分别添加100μl的制备成1μg/ml的生物素标记抗BSA抗体，并在室温下孵育1小时。除去各孔内的生物素标记抗BSA抗体溶液，然后使用洗板机用300μl的PBS清洗3次。
(2)样品的添加
在各孔中分别添加50μl的1μg/ml的BSA溶液(N＝3)，并在室温下孵育1小时。另外，同样地在各孔中分别添加50μl的PBS(对照)(N＝3)。从各孔除去BSA溶液或PBS，然后用300μl的PBS将各孔清洗3次。接着，在各孔中分别添加50μl的用PBS稀释为1μg/ml的PPDK标记抗BSA-VHH抗体溶液，并在室温下孵育1小时。从各孔中除去PPDK标记抗BSA-VHH抗体溶液，然后使用洗板机用300μl的PBS将各孔清洗4次。
(3)信号检测
在各孔中分别添加5μl的制备成最终浓度为10μg/ml的AK后，分别添加10μl的制备成最终浓度为10μg/ml的PK酶液。接着，在各孔中分别添加10μl的PBS，然后用8道移液器分别添加25μl的试剂A(含有1mM PPi、1mM PEP、1mM AMP、10mM MgCl2的PBS)。
将上述得到的96孔板置于光度计GloMAX navigator(Promega公司制造)中，静置15分钟。用光度计的泵在各孔中添加50μl的试剂B(含有5μg/ml Luc、200μMD-荧光素的PBS)，添加后立即测定各样品的发光强度。发光强度的测定通过测定96孔板的各孔每1秒的发光量(counts/second；cps)的方法来进行。测定结果如图8所示。
如图8所示，单独使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体时的发光强度的平均为1226cps，与未进行ATP的扩增时的阴性对照的发光强度1187cps相比，差微小。另一方面，将PPDK标记抗BSA-VHH抗体和扩增ATP的试剂组合使用时的发光强度为19290cps，与进行ATP的扩增时的阴性对照的发光强度3409cps相比，发光强度大幅扩增。关于组合使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体和扩增ATP的试剂的情况、和单独使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体的情况，将进行ATP的扩增时的阴性对照的发光强度和未进行ATP的扩增时的阴性对照的发光强度作为背景分别减去后的发光强度的曲线图如图9所示。
如图9所示，可知与单独使用PPDK标记抗BSA-VHH抗体、不进行ATP的扩增的情况相比，在组合PPDK标记抗BSA-VHH抗体和扩增ATP的试剂进行ATP的扩增的情况下，发光强度大幅增加。由以上表明，本发明的方法在检测样品中包含的目标分子方面具有显著的效果。可以认为，即使在目标分子少、单独使用由ATP产生酶标记了的抗体时信号检测困难的情况下，本发明的目标分子的检测方法也可以通过扩增信号来检测目标分子。
符号的说明
10 目标分子
20 捕捉分子
30 标记化结合分子
40 不溶性载体
50 检体添加部
51 第1试剂容纳部
52 第2试剂容纳部
53 流路
54 混合/反应部
55 检测部
56 废液容纳部
57 辊
58 清洗液容纳部。

Claims (23)

1.一种检体中的目标分子的检测方法，包括：
工序(1)：使检体中的目标分子、与所述目标分子结合的捕捉分子、以及由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与所述目标分子结合的标记化结合分子反应，从而形成由所述目标分子、所述标记化结合分子以及所述捕捉分子构成的复合体(以下称为目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体)的目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体形成工序；
工序(2)：除去所述工序(1)中未与目标分子结合的所述标记化结合分子的工序；
工序(3)：使所述目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体与对产生ATP的反应进行催化的酶的底物反应以产生ATP的ATP产生工序；
工序(4)：对在所述工序(3)中产生的ATP进行扩增的ATP扩增工序；以及
工序(5)：对在所述工序(4)中扩增了的ATP进行检测的ATP检测工序。
2.根据权利要求1所述的检测方法，包括：在所述工序(1)中，在形成目标分子/标记化结合分子/捕捉分子复合体之前，预先除去检体中的ATP的工序。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，所述捕捉分子是与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，所述标记化结合分子是由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是丙酮酸磷酸双激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸以及AMP。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是乙酰-CoA合成酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP、焦磷酸以及乙酰-CoA。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是ATP硫酸化酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是腺苷5′-磷酸硫酸酐和焦磷酸。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是II型多磷酸激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP和多磷酸。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(4)中，通过使用腺苷酸激酶和丙酮酸激酶来进行ATP的扩增。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(4)中，通过使用腺苷酸激酶和多磷酸激酶来进行ATP的扩增。
11.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(4)中，通过使用腺苷酸激酶和乙酸激酶来进行ATP的扩增。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的检测方法，其中，在所述工序(5)中，通过使用荧光素酶来进行ATP的检测。
13.一种检体中的目标分子检测试剂盒，包含：
固定有与目标分子结合的捕捉分子的不溶性载体、
由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与所述目标分子结合的标记化结合分子、
对产生ATP的反应进行催化的酶的底物、
扩增ATP的试剂、以及
检测ATP的试剂。
14.根据权利要求13所述的检测试剂盒，其中，所述捕捉分子是与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体。
15.根据权利要求13或14所述的检测试剂盒，其中，所述标记化结合分子是由对产生ATP的反应进行催化的酶标记了的且与目标分子特异性结合的抗体或抗体片段、或者适体。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是丙酮酸磷酸双激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是磷酸烯醇丙酮酸、焦磷酸以及AMP。
17.根据权利要求13～15中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是乙酰-CoA合成酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP、焦磷酸以及乙酰-CoA。
18.根据权利要求13～15中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是ATP硫酸化酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是腺苷5′-磷酸硫酸酐和焦磷酸。
19.根据权利要求13～15中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述对产生ATP的反应进行催化的酶是II型多磷酸激酶，所述对产生ATP的反应进行催化的酶的底物是AMP和多磷酸。
20.根据权利要求13～19中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述扩增ATP的试剂是AMP、磷酸烯醇丙酮酸、镁离子、腺苷酸激酶以及丙酮酸激酶。
21.根据权利要求13～19中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述扩增ATP的试剂是AMP、多磷酸、镁离子、腺苷酸激酶以及多磷酸激酶。
22.根据权利要求13～19中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述扩增ATP的试剂是AMP、乙酰磷酸、镁离子、腺苷酸激酶以及乙酸激酶。
23.根据权利要求13～22中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述检测ATP的试剂是D-荧光素和荧光素酶。
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ITO et al. School of Pharmaceutical Sciences, Showa University, I-5-8 Hatanodai, Shinagawa, Tokyo 142-8555, Japan Email: itok (a) pharm. showa-u. ac. jp

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