CN115650934A

CN115650934A - 一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针及其应用

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Publication number: CN115650934A
Application number: CN202211173191.2A
Authority: CN
Inventors: 于丽佳; 赵树华
Original assignee: Occupational Safety And Health Research Center Of National Health And Health Commission Coal Industry Occupational Medicine Research Center Of National Health And Health Commission
Current assignee: Occupational Safety And Health Research Center Of National Health And Health Commission Coal Industry Occupational Medicine Research Center Of National Health And Health Commission
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-09-26
Also published as: CN115650934B

Abstract

本发明公开了一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针及其应用，所述荧光分子探针的结构式如下式(Ⅰ)所示。将所述荧光分子探针配置成浓度为5mmol/L的分子探针储备液后，可用于定性或定量检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的应用。该荧光分子探针具有较小的背景干扰性、组织穿透性强且组织损伤小等优点，另外，该荧光分子探针还具有较好的溶解性，其吸收波长也在近红外区域，能够高效快速、高选择性、高灵敏度地对焦磷酸根和碱性磷酸酯酶进行实时检测。

Description

一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针及其应用

技术领域

本发明涉及荧光分子探针与应用技术领域，具体涉及一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针及其应用。

背景技术

焦磷酸根(PPi)是三磷酸腺苷ATP的代谢产物，在能量代谢的过程中发挥关键作用。在DNA复制过程中，PPi也是不可缺少的一种物质，在血清中高浓度的PPi与急性肾衰竭和心血管疾病密切相关，在滑膜中PPi含量与关节炎和软骨钙沉着病有重要关联。此外，如罐头、鱼肉糜制品等食品中加入了作为添加剂的含焦磷酸根的钠盐。碱性磷酸酯酶(ALP)是一种核酸酶，因其在碱性条件下活性最大而得名，广泛分布在人体的各个组织中。人血清的中碱性磷酸酯酶的含量高低与很多疾病相关，如肝胆疾病、骨骼类疾病。大量的天然底物中只有少量的磷酸根底物能够被碱性磷酸酯酶水解。焦磷酸根是碱性磷酸酯酶的底物，焦磷酸根能够抑制血管钙化，通过碱性磷酸酯酶对焦磷酸根的催化水解来调节并预防血管过度钙化。因此，对焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的检测具有重要的意义。

目前，焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的检测方法有很多，例如电化学法、色谱法、比色法、化学发光法、表面增强共振拉曼散射以及荧光检测方法。其中，荧光检测方法具有较高的灵敏度、操作简单、快速响应的优势。量子点、上转化纳米材料、有机染料等介质作为荧光发光基团也较多应用到焦磷酸根或碱性磷酸酯酶的检测，但是，一些纳米材料制备相对复杂、操作繁琐，而一些有机染料不但水溶性好，而且穿透性较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针及其应用，该荧光分子探针具有较小的背景干扰性、组织穿透性强且组织损伤小等优点，另外，该荧光分子探针还具有较好的溶解性，其吸收波长也在近红外区域，能够高效快速、高选择性、高灵敏度地对焦磷酸根和碱性磷酸酯酶进行实时检测。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针，所述荧光分子探针的结构式如下式(Ⅰ)所示：

其中，R为氢原子、卤素、甲基、甲氧基中的一种。

本发明还提供了一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针用于定性或定量检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的应用。

进一步的，所述荧光分子探针用于定性或定量检测焦磷酸根的具体步骤包括：

(1)将荧光分子探针溶于DMSO中配置成浓度为5mmol/L的分子探针溶液储备液，使用时用超纯水稀释成500μmol/L；

(2)向含有5μmol/L铜离子的PBS缓冲溶液中加入不同量的焦磷酸根标准溶液，配制成不同浓度的焦磷酸根标准样品，孵育5-20min后，再加入9μL500μmol/L的分子探针储备液，荧光分子探针的最终浓度为15μmol/L，孵育30-120min后得到标准样品液，测试标准样品液的荧光光谱或者紫外光谱信号，构建不同浓度的焦磷酸根待测样品与分子探针的荧光或紫外线性关系；

(3)按照步骤(2)方法对待测样品进行预处理，然后测试预处理后的待测样品中的荧光光谱或者紫外光谱信号，根据待测样品的荧光强度或者紫外强度，结合步骤(2)中构建的不同浓度的焦磷酸根标准样品与分子探针的线性关系，即可检测待测样品中焦磷酸根的浓度。

优选的，步骤(2)中，所述焦磷酸根标准样品为Na₄O₇P₂；所述焦磷酸根标准溶液的浓度为5mmol/L，焦磷酸根标准样品的浓度范围为2～400μmol/L。

进一步的，所述荧光分子探针用于定性或定量检测碱性磷酸酯酶的具体步骤包括：

(1)将荧光分子探针溶于DMSO中配置成浓度为5mmol/L的分子探针储备液，使用时用超纯水稀释成500μmol/L；

(2)在含有5μmol/L铜离子的PBS缓冲溶液中加入12μL 5mmol/L的焦磷酸根标准溶液，使标准样品中焦磷酸的浓度为200μmol/L，混合后于20-50℃条件下培养10-30min，再加入不同浓度的碱性磷酸酯酶标准溶液，配制成不同浓度的碱性磷酸酯酶标准样品，于20-50℃条件下培养10-30min，再加入9μL500μmol/L分子探针储备液，荧光分子探针的最终浓度为15μmol/L，于20-50℃条件下孵育30-120min后，测试标准样品液的荧光光谱或者紫外光谱信号，构建不同浓度的碱性磷酸酯酶标准样品与分子探针的荧光或紫外线性关系；

(3)按照步骤(2)所述方法用荧光光谱测量待测样品中的碱性磷酸酯酶，根据待测样品的荧光强度，结合步骤(2)中碱性磷酸酯酶与分子探针的线性关系即可检测待测样品中碱性磷酸酯酶的含量。

优选的，所述碱性磷酸酯酶标准样品为浓度为10U/ml的碱性磷酸酶，碱性磷酸酯酶标准样品的浓度范围为5～180U/L。

本发明荧光分子探针检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的的检测机理为：当铜离子存在时，铜离子与菁染料荧光探针分子作用，促使菁染料荧光探针分子荧光淬灭。利用铜离子萃灭方酸菁染料的荧光信号，加入焦磷酸根恢复其荧光，再加入碱性磷酸酯酶萃灭体系的荧光信号，构建了“on-off-on”传感平台，不同浓度的焦磷酸、碱性磷酸酯酶于方酸菁染料的不同荧光响应强度，构建线性关系，实现对焦磷酸和碱性磷酸酯酶的特异性和高灵敏度检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用方酸菁染料荧光探针分子来定性或定量检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶，该荧光分子探针具有较小的背景干扰性、组织穿透性强且组织损伤小等优点，另外，该荧光分子探针还具有较好的溶解性，其吸收波长也在近红外区域，能够高效快速、高选择性、高灵敏度地对焦磷酸根和碱性磷酸酯酶进行实时检测，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是不同浓度焦磷酸根存在下F-0的紫外吸收光谱图；

图2是不同浓度焦磷酸根存在下F-0的荧光光谱图谱图；

图3是660nm处F-0荧光强度与焦磷酸根浓度的线性关系图；

图4是F-0对焦磷酸根的特异性识别图；

图5是不同浓度碱性磷酸酯酶根存在下F-0的紫外吸收光谱图；

图6是不同浓度碱性磷酸酯酶存在下F-0的荧光光谱图谱图；

图7是660nm处F-0荧光强度与碱性磷酸酯酶浓度的线性关系图；

图8是是F-0对碱性磷酸酯酶的特异性识别图；

图9是加入焦磷酸根和碱性磷酸酯酶后F-0的荧光强度变化图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本实施例中使用的方酸菁染料荧光探针分子的结构式如下式(Ⅰ)所示：

其中，R为氢原子。其合成路线如下：

具体制备过程为：在避光和氮气保护的条件下，将2-甲基-3-磺丙基苯并噻唑(0.46g,0.18mmol)、方酸(0.1g,0.09mmol)加入2mL吡啶和4mL正丁醇中，反应24h，加入乙醚过滤沉淀，得到蓝黑色固体化合物0.26g，收率为48％，该蓝黑色固体化合物即为方酸菁染料荧光探针分子，简称F-0。

HR-MS(ESI)theoretical[M]^2-,618.03,found[M+3H]⁺,621.0654,[M+3H+Na]²⁺,643.0476,[M+3H+2Na]³⁺,665.0317,[M]^-,619.0463.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.82(t,J＝15.0Hz,2H),7.64(t,J＝12.9Hz,2H),7.43(t,J＝7.8Hz,2H),7.25(t,J＝7.6Hz,2H),5.84(s,2H),4.39(t,J＝7.4Hz,4H),2.61(t,J＝7.0Hz,4H),2.07–1.91(m,4H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ175.41,158.68,141.58,128.00,124.35,122.85,112.73,85.68,48.34,45.00,23.77.

所述F-0用于定性或定量检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的应用。

以下实施例中使用的铜离子PBS缓冲溶液的配制过程为：将硫酸铜溶于超纯水中配置成5mmol/L的Cu²⁺储备母液；将5mmol/L的Cu²⁺储备母液加入到1╳PBS缓冲液中，使缓冲体系中的Cu²⁺的浓度为5μmol/L。

以下实施例中使用的焦磷酸钠标准样品溶液配制过程为：将焦磷酸钠标准样品于超纯水中配置成5mmol/L的焦磷酸根标准样品溶液。

以下实施例中使用的碱性磷酸酯酶标准样品溶液配制过程为：将碱性磷酸酯酶溶于超纯水中配置成10U/mL的碱性磷酸酯酶标准样品溶液。

所述荧光分子探针F-0用于定性或定量检测焦磷酸根的具体步骤包括：

(1)将荧光分子探针F-0溶于DMSO中配置成浓度为5mmol/L的F-0储备液，使用时用超纯水稀释到500μmol/L；

(2)取17个相同大小的容器，向容器中分别加入一定体积的含5μmol/L铜离子的PBS缓冲溶液，再分别加入不同量的5mmol/L的焦磷酸根标准溶液，使17个容器中的焦磷酸根浓度分别为0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、70μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、160μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L、350μmol/L和400μmol/L，分别孵育20min后，再分别加入9μL 500μmol/L的F-0储备液，最终使标准样品的总体积为300μL，且使容器中的荧光分子探针F-0的浓度为15μmol/L，孵育30-120min后得到17份标准样品，测试17份标准样品液的荧光光谱或者紫外光谱信号，使用紫外-可见光谱仪测量不同浓度焦磷酸根对应体系的紫外吸收光谱(见图1)，使用荧光光谱仪测量不同浓度焦磷酸根对应体系的荧光光谱(见图2)，并绘制560nm处不同浓度焦磷酸根体系中荧光强度随焦磷酸根浓度变化的线性曲线(见图3)，从而构建不同浓度的焦磷酸根标准样品与分子探针的荧光或紫外线性关系。

由图1、图2可见，F-0的紫外吸收光谱和荧光强度受焦磷酸浓度的影响，随着焦磷酸浓度的增加，紫外吸收光谱和荧光强度增强，焦磷酸的加入后，能够与铜离子形成配合物，剥夺铜离子，F-0的紫外吸收和荧光都得以恢复(见图9)。由图3可见，当焦磷酸根的浓度为5～45μmol/L时，荧光强度与焦磷酸根浓度呈线性关系，线性方程为：y＝8.292x-37.878，式中，y为荧光强度，x为焦磷酸根浓度，相关系数R²为0.9959。由此说明，荧光强度与焦磷酸根浓度有很好的线性关系。利用最低检出限的公式3σ/s计算检出限，F-0对焦磷酸根的检出限为0.1030μmol/L。

(3)按照步骤(2)所述方法用荧光光谱测量待测样品中的焦磷酸根，在待测样品中加入Cu²⁺标准溶液，使待测样品中的Cu²⁺浓度为5μmol/L，待测样品中的焦磷酸根会与Cu²⁺形成配合物，孵育20min后，向待测样品中加入F-0储备液，使待测样品中F-0的浓度为15μmol/L，孵育120min后，使用荧光光谱仪测量待测样品体系的荧光光谱，根据待测样品的荧光强度，结合步骤(2)中焦磷酸根与分子探针荧光强度的线性关系即可检测待测样品中焦磷酸根的含量。

对焦磷酸根的特异性识别验证过程：准备11个1.5mL的微量离心管，向其中加入一定量的1╳PBS缓冲溶液，将3μL 500μmol/L的Cu²⁺溶液加入到1ⅹPBS缓冲液中，使Cu²⁺的浓度为5μmol/L，向其中依次加入配制好焦磷酸钠溶液、ATP、Na₂HPO₄溶液、NaH₂PO₄溶液、Na₂SO₄溶液、Na₂S₂O₄溶液、Na₂CO₃溶液、NaHCO₃溶液、NaCl溶液、NaClO₂溶液、CH₃COONa溶液，使混合液中焦磷酸根、ATP、HPO₄ ^2-、H₂PO^4-、SO₄ ^2-、S₂O₄ ^2-、CO₃ ^2-、HCO₃ ^-、Cl^-、ClO₂ ^-、CH₃COO^-浓度均为200μmol/L，在室温下放置20min后，向其中加入9μL500μmol/L的F-0溶液，使混合液中F-0的浓度为15μmol/L，使用荧光光谱仪测量不同阴离子对应体系的荧光光谱，并绘制不同阴离子体系中560nm处的荧光强度柱状图(见图4)。从图4中可以看出，只有加入焦磷酸根可以使F-0的荧光恢复，说明F-0可以特异性检测焦磷酸根。

所述荧光分子探针F-0用于定性或定量检测碱性磷酸酯酶的具体步骤包括：

(2)取11个相同大小的容器，向容器中分别加入一定体积的含5μmol/L铜离子的PBS缓冲溶液，再分别加入12μL 5mmol/L的焦磷酸根标准溶液，使容器中焦磷酸根的浓度为200μmol/L，于25℃条件下培养20min后，再加入不同体积的10U/mL的碱性磷酸酯酶标准溶液，使11个容器中的焦磷酸根浓度分别为0U/L、0U/L、5U/L、25U/L、45U/L、75U/L、100U/L、120U/L、140U/L、160U/L、180U/L，于25℃条件下分别培养30min后，再分别加入9μL 500μmol/L的F-0储备液，最终使标准样品的总体积为300μL，且使标准样品液F-0的浓度为15μmol/L，孵育30-120min后，得到11份标准样品液，后测试11份标准样品液的荧光光谱或者紫外光谱信号，使用紫外-可见光谱仪测量不同浓度碱性磷酸酯酶对应体系的紫外吸收光谱(见图5)，使用荧光光谱仪测量不同浓度碱性磷酸酯酶对应体系的荧光光谱(见图6)，并绘制560nm处不同浓度碱性磷酸酯酶体系中荧光强度随碱性磷酸酯酶浓度变化的线性曲线(见图7)，从而构建不同浓度的碱性磷酸酯酶标准样品与分子探针的荧光或紫外线性关系。

由图5、图6可见，F-0的紫外吸收光谱和荧光强度受磷酸酯酶浓度的影响，随着磷酸酯酶浓度的增加，紫外吸收光谱和荧光强度降低，磷酸酯酶加入后使得焦磷酸根水解，失去络合能力，释放出Cu²⁺，又使得体系的紫外吸收和荧光萃灭(见图9)，由图7可见，当磷酸酯酶的浓度为5～130U/L时，荧光强度与磷酸酯酶浓度呈线性关系，线性方程为：y＝-4.782x+683.341，式中，y为荧光强度，x为磷酸酯酶浓度，相关系数R²为0.983。由此说明，荧光强度与磷酸酯酶浓度有良好的线性关系。利用最低检出限的公式3σ/s计算检出限，F-0对磷酸酯酶的检出限为0.1786U/L。

(3)按照步骤(2)所述方法用荧光光谱测量待测样品中的碱性磷酸酯酶，在待测样品中加入Cu²⁺标准溶液，使待测样品中的Cu²⁺浓度为5μmol/L，加入5mmol/L的焦磷酸根标准液，使待测样品中焦磷酸根的浓度为200μmol/L，于25℃条件下孵育30min后，向待测样品中加入F-0储备液，使待测样品中F-0的浓度为15μmol/L，孵育120min后，使用荧光光谱仪测量待测样品体系的荧光光谱，根据待测样品的荧光强度，结合步骤(2)中碱性磷酸酯酶与分子探针荧光强度的线性关系即可检测待测样品中碱性磷酸酯酶的含量。

对碱性磷酸酶的特异性识别验证过程：准备7个1.5mL的微量离心管，向其中加入一定量的1╳PBS缓冲溶液，将3μL 500μmol/L的Cu²⁺溶液加入到1╳PBS缓冲液中，使Cu²⁺的浓度为5μmol/L，向其中分别加入12μL 5mmol/L的焦磷酸钠溶液，使混合液中焦磷酸根的浓度为200μmol/L在室温下放置20min后，向其中依次加入配置好磷酸酯酶(ALP)、凝血酶(Thrombin)、胰蛋白酶(Trypsin)、脂肪酶(Lipase)、溶菌酶(Lysozyme)、磷酸二酯酶(PEDs)、牛血清白蛋白(BSA)、使混合液中ALP、Thrombin、Trypsin、Lipase的浓度为200U/L，Lysozyme、PEDs、BSA的浓度为200μg/mL，放置30min后，向其中加入9μL 500μmol/L的F-0溶液，使混合液中F-0的浓度为15μmol/L，使用荧光光谱仪测量不同酶对应体系的荧光光谱，并绘制不同酶体系中560nm处的荧光强度柱状图(见图8)。从图8中可以看出，只有加入磷酸酯酶可以使F-0的荧光萃灭，说明F-0可以特异性检测磷酸酯酶。

Claims

1.一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针，其特征在于，所述荧光分子探针的结构式如下式(Ⅰ)所示：

其中，R为氢原子、卤素、甲基、甲氧基中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针用于定性或定量检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光分子探针用于定性或定量检测焦磷酸根的具体步骤包括：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述焦磷酸根标准样品为Na₄O₇P₂；所述焦磷酸根标准溶液的浓度为5mmol/L，焦磷酸根标准样品的浓度范围为2～400μmol/L。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光分子探针用于定性或定量检测碱性磷酸酯酶的具体步骤包括：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述碱性磷酸酯酶标准样品为浓度为10U/ml的碱性磷酸酶，碱性磷酸酯酶标准样品的浓度范围为5～180U/L。