CN117024331B - 一种识别检测锌离子的咔唑类希夫碱探针化合物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种识别检测锌离子的咔唑类希夫碱探针化合物、其制备方法及应用，属于荧光探针和分子检测技术领域。在应用该化合物检测锌离子的技术方案中，首先将该化合物分散在乙醇中形成探针化合物溶液，再向其中加入待测样品，充分接触后使用波长为410 nm的荧光进行激发，检测在466 nm处的最大发射荧光强度。与现有的锌离子探针相比较，本发明的探针具有灵敏度高，检测下限低，选择性高，稳定性强，具有良好的抗干扰能力等优点。同时，探针的制备方法具有简单、安全、反应条件温和、后处理简单、产率高、合成成本低等优势。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针和分子检测技术领域，进一步涉及基于激发态分子内质子转移（ESIPT）机制的锌离子荧光探针及该类探针代表性化合物CPMDP与锌离子的荧光性质研究，具体涉及一种识别检测锌离子的咔唑类希夫碱探针化合物、其制备方法及应用。
背景技术
锌是人体必需的微量元素之一，其含量仅次于铁元素，广泛分布于人体细胞和体液中。锌在生命体或人体中扮演重要的角色，承担许多生理功能，如参与酶的催化、蛋白质的结构稳定、神经信号传递、基因复制转录、DNA损伤修复、信号转导和免疫反应等生理过程。因此，各种原因导致的锌缺乏会导致消化功能障碍、生长及智力发育滞后、生殖及性器官发育异常或性功能减退、神经精神障碍、免疫功能低下等。因此，开发快速、准确、高效的锌离子检测方法是目前最受关注的研究热点之一。
由于Zn2+具有稳定的3d 104s 0满壳层电子构型，没有空的d轨道及未成对电子，故而无任何磁信号表现，因此无法使用如X射线、核磁共振、电子顺磁性共振等方法对体内的Zn2+进行实时检测。此外，传统的检测方法，例如原子吸收光谱法、电化学法、电感耦合等离子体质谱法等由于需要专属的大型仪器，因此并不适用于高效检测Zn2+。荧光离子探针由于其在选择性、灵敏度、实时性和原位检测等方面的优势，已经发展成为检测生物体内Zn2+动态分布的重要手段。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种识别检测锌离子的咔唑类希夫碱探针化合物、其制备方法及应用，以解决目前，基于磁信号的检测方法无法对体内的Zn2+进行实时检测的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是，原子吸收光谱法、电化学法、电感耦合等传统检测方法需要专属的大型仪器，因而不适用于高效检测Zn2+。
本发明要解决的再一技术问题是，目前缺少一种针对Zn2+的荧光离子探针。
本发明要解决的又一技术问题是，当采用荧光离子探针检测Zn2+时，如何保证探针化合物具有较高的选择性、灵敏度、稳定性以及抗干扰能力。
本发明要解决的又一技术问题是，如何扩展Zn2+检测探针的可选范围。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种识别检测锌离子的咔唑类希夫碱探针化合物，该化合物的分子结构如以下式1所示：
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述化合物的制备方法，该方法的合成路线如以下式2所示：
该制备方法包括以下步骤：
步骤1：N,N’-二甲基甲酰胺作为溶剂，加入咔唑和1-氟-4-硝基苯，分批加入氢化钠；氮气保护下升温至130~140摄氏度，保持24~48小时；得到中间物质NPC-NO2；
步骤2：在钯碳催化下，中间物质NPC-NO2在乙醇中被氢气还原，压力为30~50Psi，混合均匀后在60~100摄氏度下持续搅拌6~10小时，得到中间物质NPC-NH2；
步骤3：中间物质NPC-NH2和4-(二乙氨基)水杨醛在乙醇中均匀混合后在60~80摄氏度下回流10~15小时，得到锌离子探针化合物CPMDP，即为所述识别检测锌离子的咔唑类希夫碱探针化合物。
作为优选，步骤1中，咔唑与1-氟-4-硝基苯的摩尔量相等。
作为优选，步骤1中，在120~140摄氏度保持体系回流状态24~48小时。
作为优选，步骤3中，4-(二乙氨基)水杨醛的摩尔量是NPC-NH2摩尔量的1.2倍。
作为优选，步骤1中，在保持24~48小时的过程中，TLC跟踪反应进程，以原料咔唑消失作为反应终止点。
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述化合物用于检测锌离子的应用。
作为优选，在该应用中，将所述化合物分散在乙醇中形成探针化合物溶液，再向其中加入待测样品，充分接触后使用波长为410 nm的荧光进行激发，检测在466 nm处的最大发射荧光强度。
作为优选，由以下公式计算锌离子浓度：y = 301.53333x–2042.5557，R2 =0.97148；式中，y为在466 nm处的最大发射荧光强度，x为锌离子浓度。
作为优选，探针化合物溶液的体积为2 mL，探针化合物溶液的浓度为10 μM，待测样品体积为10~20 μL。
作为优选，待测样品和探针化合物溶液在20~25摄氏度下混合10~15min后进行扫谱，激发波长为410 nm，最大发射波长在466 nm。
在以上技术方案中，由待测样品和CPMDP溶液组成检测体系，选择将锌离子探针化合物CPMDP分散在乙醇溶剂形成探针化合物溶液，再向其中加入待测样品。探针化合物溶液的体积为毫升数量级，待测样品体积为微升数量级。实际应用表明，在0~10 μM锌离子浓度范围内该探针荧光强度呈现出良好的线性关系，检测下限可低至1.25×10-8 M。
与现有的锌离子探针相比较，本发明的探针具有灵敏度高，检测下限低（可达纳摩尔浓度nmol/L量级），选择性高，稳定性强，具有良好的抗干扰能力等优点。同时，探针的制备方法具有简单、安全、反应条件温和、后处理简单、产率高、合成成本低等优势。
本发明提供了一种识别检测锌离子的咔唑类希夫碱探针化合物、其制备方法及应用。咔唑类化合物具有良好的共平面性、稳定性及溶解性，并具有很强的分子内电荷转移，常常被用作荧光团，在荧光探针中具有很强的应用价值。希夫碱类荧光探针具有合成简单、光稳定性好、Stock' s 位移大、易于和金属离子络合等诸多优点，是荧光探针设计的优选结构。同时，希夫碱化合物由于其容易合成、合成成本低并具有巨大的应用，可作为化学传感器用于识别和监测金属离子。激发态分子内质子转移（ESIPT）机理是指一些有机分子受到光、热、电等作用后，分子内羟基或氨基上的质子经过氢键转移到邻近的O、N、S等原子上，形成互变异构体的过程。分子经激发后，分子的结构发生变化，并产生瞬时电子态的弛豫和排布，导致分子的光学性质发生变化。因此，本发明利用咔唑及希夫碱在荧光探针领域的应用，开发了一种合成步骤简单、灵敏度高、抗干扰能力强的锌离子荧光探针。
本发明采用具有咔唑希夫碱结构的小分子来开发ESIPT机制的荧光探针分子，基于此类结构针对锌离子开发的一种合成简便、检测迅速的荧光探针化合物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明荧光探针与锌离子形成的配合物在410 nm的最大激发波长的激发下，在最大发射光波长λem = 466 nm处具有很强的荧光峰。在0~10 μM锌离子浓度范围内该探针荧光强度呈现出良好的线性关系，y = 301.53333x - 2042.5557，R2 =0.97148。
2、本发明荧光探针分子的设计基于ESIPT原理，探针分子在结合锌离子前后荧光量子产率有大幅度的增长。荧光探针分子对锌离子有很好的选择性，且不受其他离子例如K+、Na+、Mg2+、Al3+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Ni2+、Ba2+、Pb2+、Mn2+、Ag+等的干扰，响应迅速。且阴离子对本探针几乎没有干扰荧光的现象。
3、本发明荧光探针分子与锌离子之间的络合后荧光检测在纳摩尔范围内，可以检测纳摩尔浓度的锌离子，其检测下限可低至1.25×10-8 M，灵敏度高。
附图说明
图1是实施例3探针化合物CPMDP的1H-NMR谱图。
图2是实施例3探针化合物CPMDP的13C-NMR谱图。
图3是实施例3探针化合物CPMDP的FT-IR谱图。
图4是实施例4中以探针化合物检测锌离子浓度，在锌离子浓度（0~10 μM）内的荧光线性关系图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1——中间体NPC-NO2的合成及表征
将10 g (59.8mmol)咔唑加入到50mL N,N’-二甲基甲酰胺再加入8.4 g（59.8mmol）1-氟-4-硝基苯，分批加入氢化钠5.3 g（119.6 mmol），搅拌均匀后。升温至130-140摄氏度，反应24-48小时。TLC跟踪反应进程，原料咔唑消失反应终止。降温至25摄氏度，加入饱和氯化铵水溶液150 mL，乙酸乙酯100 mL萃取分液。取上层有机相，用饱和氯化钠100 mL洗涤2-3次，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩。得到产物14.3 g，产率83%。
实施例2——中间体NPC-NH2的合成及表征
将10 g（34.7 mmol）NPC-NO2加入到100 mL无水乙醇中。加入5%的钯碳，搅拌均匀，氢气加压至30-50 Psi，升温至40-50摄氏度6-10个小时。TLC检测反应完毕后。进行后处理。体系降温至25摄氏度。将钯碳抽滤后。滤液浓缩。得到产物6.7 g，产率75%。
实施例3——探针化合物CPMDP的合成及表征
称取5 g (19.3 mmol) NPC-NH2溶于25 mL乙醇中，加入4-(二乙氨基)水杨醛（4.47 g，23.2 mmol）搅拌均匀后，升温至60-80摄氏度反应10-15个小时，TLC检测原料消失后直接浓缩。得到粗品。粗品通过柱层析进行纯化得到CPMDP棕黄色粉末6.7 g产率80%。1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.56 (s, 1H), 7.85 (dd, J = 5.8, 2.7 Hz, 1H), 7.74 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45 –7.37 (m, 2H), 7.32 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.04 (dd, J= 5.7, 2.6 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.37 (dd, J = 8.8, 3.6 Hz, 2H),6.28 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 2H), 6.25 – 6.13 (m, 2H), 3.39 (s, 3H), 3.32 –3.12 (m, 12H), 1.05 (q, J = 7.0 Hz, 13H). Main IR (KBr disk, cm-1): 3320.3,2967.7, 2932.7, 1669.6, 1634.6, 1613.5, 1545.6, 1514.6, 1118.2, 1087.0,1042.3, 881.4, 820.0. ESI-MS (m/z, M+): 668.3。
实施例4—探针化合物CPMDP对锌离子的灵敏性
使用合成并提纯的探针化合物CPMDP评价其对锌离子的灵敏性。将2 mL的2 μM探针化合物CPMDP（溶剂为乙醇）加入到样品池中，然后依次分别加入0−10 μM的氯化锌水溶液（2.5 μL）混合10分钟后进行扫谱，激发波长为410 nm，最大发射波长在466 nm，测试结果显示于表1中。从表1中可以看出配体CPMDP在乙醇中和锌离子络合时的荧光强度变化。
表1. CPMDP对不同浓度Zn2+的荧光响应，Imin为不添加锌离子时，在466 nm处的荧光强度；I为添加不同锌离子时，在466 nm处的荧光强度，由于最终检测体系由2 mL探针化合物溶液和2.5 μL氯化锌水溶液组成。
| [Zn2+] (μM) | 强度 ( a.u. / at 466 nm) | I / Imin |
| 0 | 676 | 1.00 |
| 1.25 | 2854 | 3.82 |
| 2.50 | 3096 | 4.57 |
| 3.75 | 3126 | 4.62 |
| 5.00 | 3532 | 5.22 |
| 6.25 | 3802 | 5.62 |
| 7.50 | 4322 | 6.39 |
| 8.75 | 4685 | 6.93 |
| 10.00 | 5051 | 7.47 |
锌离子浓度在0-10 μM内具有线性，λ激发波长 = 410 nm，λ发射波长 = 466 nm，如附图4所示，线性回归方程y = 301.53333x – 2042.5557，R2 =0.97148，y为荧光强度，x为锌离子浓度。根据该实验数据，探针化合物与锌离子的结合常数可有Benesi-Hildebrand方程计算而得从而推出结合常数为K a = 4.62 × 105 M−1。我们再将化合物CPMDP在466 nm处最小荧光强度和最大荧光强度间进行归一化处理后的结果与不同锌离子浓度的倒数进行线性拟合可得到线性回归方程y = 2.1647x + 0.7373，R2 = 0.9655，进而可以确定检测限值为1.25× 10−8 M。
实施例5—探针化合物CPMDP对锌离子的选择性
使用合成并提纯的探针化合物CPMDP评价其对锌离子的选择性。首先制备5 μM的CPMDP储备液（乙醇）以及各种常见钠盐、钾盐、钙盐、镁盐以及其他过渡金属盐水溶液，待金属与配体充分混合稳定30 分钟后，依次对其混合溶液进行荧光强度检测。实验结果表2所示：CPMDP对Zn2+ 的响应非常明显，而当与其它如, Na+, K+, Ag+, Fe3+, Al3+, Mg2+, Cr3+,Ni2+, Pb2+, Mn2+, Co2+, Cu2+, Ca2+, Ba2+等金属离子混合时荧光强度没有发生明显的变化，当与Cd2+混合时产生了一定的信号响应但远低于对Zn2+ 的响应。根据本实验现象可以推测，荧光探针CPMDP对锌离子具有较好的选择性。
表2. CPMDP对常见金属离子的荧光响应—CPMDP (5 μM) 在2 mL乙醇中对各种常见金属离子(15 μM)的荧光响应强度(λex = 410 nm，λem = 466 nm)，I0为CPMDP初始荧光强度，I为CPMDP和不同金属离子作用后的荧光强度。
| Intensity (a.u. / at 466 nm) | I / I0 | |
| CPMDP | 545 | 1.00 |
| CPMDP + K+ | 564 | 1.03 |
| CPMDP+ Na+ | 559 | 1.03 |
| CPMDP + Mg2+ | 524 | 0.96 |
| CPMDP + Al3+ | 421 | 0.77 |
| CPMDP + Cr3+ | 227 | 0.42 |
| CPMDP + Cu2+ | 223 | 0.41 |
| CPMDP + Co2+ | 407 | 0.75 |
| CPMDP + Ni2+ | 919 | 1.69 |
| CPMDP + Fe3+ | 544 | 1.00 |
| CPMDP + Cd2+ | 1067 | 1.96 |
| CPMDP + Pb2+ | 700 | 1.28 |
| CPMDP + Mn2+ | 549 | 1.01 |
| CPMDP + Ag+ | 594 | 1.09 |
| CPMDP + Ba2+ | 580 | 1.06 |
| CPMDP + Ca2+ | 689 | 1.26 |
| CPMDP + Zn2+ | 7158 | 13.12 |
在一组5 µM的CPMDP2 mL乙醇溶液中加入10 µM Zn2+水溶液，同时在上述混合溶液中分别加入10 µM其他金属离子水溶液，将样品在25℃下以100转/分钟的速度振摇2小时后检测其荧光强度的变化，记录如表3所示：可以看到，常见其他金属离子K+, Na+, Mg2+,Al3+,Cd2+, Co2+, Fe3+, Ni2+, Ba2+, Pb2+, Mn2+, Ag+等对CPMDP-Zn2+的荧光强度干扰较小。
表3. CPMDP检测锌离子的抗干扰性能—常见金属离子(10 μM)对CPMDP(5 μM)与Zn2+ (10 μM)配位结合产生荧光强度的干扰(λex = 410 nm，λem = 466 nm)，I0为CPMDP加入锌离子之后的荧光强度，I为CPMDP加入锌离子和不同金属离子后的荧光强度。
表4.仪器列表
| 名称 | 型号 | 生产厂家 |
| 傅立叶变换红外光谱 | Nicolet 380 | Thermo Electron |
| 核磁共振测定仪 | AVANCE III 400 | 美国Bruker |
| 荧光光谱仪 | RF-5301 | 日本岛津 |
| 紫外可见吸收光谱仪 | U-3310 | 日本日立 |
表5.原料、试剂列表
| 原料、试剂 | 纯度 | 生产厂家 |
| 咔唑 | 分析纯 | 安耐吉公司 |
| 1-氟-4-硝基苯 | 分析纯 | 安耐吉公司 |
| 氢化钠 | 分析纯 | 安耐吉公司 |
| 4-(二乙氨基)水杨醛 | 分析纯 | 安耐吉公司 |
| N,N’-二甲基甲酰胺 | 分析纯 | 天津市化学试剂六厂 |
| 无水乙醇 | 分析纯 | 天津市化学试剂六厂 |
| 金属氯化盐 | 分析纯 | 天津市化学试剂六厂 |
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.分子结构如以下式 1 所示的化合物用于以非诊断目的、非治疗目的检测
锌离子的应用；
式 1。
2.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，在该应用中，将所述化合物
分散在乙醇中形成探针化合物溶液，再向其中加入待测样品，充分接触后使用波
长为 410 nm 的荧光进行激发，检测在 466 nm 处的最大发射荧光强度。
3.根据权利要求 2 所述的应用，其特征在于，由以下公式计算锌离子浓度：
y = 301.53333x–2042.5557，R 2 = 0.97148；式中，y 为在 466 nm 处的最大发射
荧光强度，x 为锌离子浓度。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，探针化合物溶液的体积为2 mL，
探针化合物溶液的浓度为 10 μM，待测样品体积为 10~20 μL。
5.根据权利要求 4 所述的应用，其特征在于，待测样品和探针化合物溶液
在 20~25 摄氏度下混合 10~15min 后进行扫谱，激发波长为 410 nm，最大发射波
长在 466 nm。
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| Effects of substitution and conjugation on ESIPT behavior of Schiff base derivatives;Xiaoxiao Li et al;Effects of substitution and conjugation on ESIPT behavior of Schiff base derivatives;第2022卷(第279期);121377 * |
| Molecular Conformation- and Packing-Controlled Excited State Intramolecular Proton Transfer Induced Solid-State Fluorescence and Reversible Mechanofluorochromism;Anu Kundu et al;ChemistrySelect;第2018卷(第3期);7340-7345 * |
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