CN115623985A - 一种茶树红色愈伤组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种安吉白茶叶片诱导红色愈伤及增殖的方法,以安吉白茶叶片为外植体,使用含6‑BA和IBA的MS培养基诱导愈伤组织,实现了光照和黑暗条件下92.25%和99.07%的高频诱导。然后采用含TDZ和IBA的MS培养进行愈伤组织增殖培养,增殖倍数为4.73,而且获得了红色茶树愈伤组织,其花青苷含量达到1.02mg·g‑1。该方法为快速提取茶树中的花青苷提供了新的原料。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,特别涉及一种安吉白茶红色愈伤组织培养的方法。
背景技术
花青苷是一种次生代谢物,作为天然的抗氧化剂,能清除人体内的自由基、活性氧等有害物质;作为营养健康成分能够减少肥胖、增强人们的抵抗力、预防心血管疾病和恢复视力障碍。因此花青苷提取物逐渐被添加到食品、化妆品和饲料中开发功能产品。但普通茶树品种叶片中的花青苷含量较低。采用组织培养的技术快速增殖茶树红色愈伤组织,使得提取茶树花青苷的原料不受限制,实现花青苷生产的周年供应,是目前难以实现的一个技术难题。
发明内容
本发明的目的是克服茶树花青苷生产原料受限的难题,提供一种茶树红色愈伤组织诱导和增殖的方法。实现茶树红色愈伤组织大量扩繁,显著提高茶树花青苷生产原料的供应。
本发明提供了一种安吉白茶红色愈伤组织快速繁殖的方法,包括以下步骤:
A外植体选择,选用无病虫害叶片作为外植体;
B外植体消毒,流水清洗后,用消毒液浸泡,然后经无菌水漂洗,获得消毒的外植体;
C抑制外植体褐化,将步骤B获得的消毒的外植体接种到含抗氧化剂PVP的培养基上。
D诱导愈伤组织,将步骤C获得的消毒的外植体接种到诱导培养基,诱导愈伤组织;
E愈伤组织增殖培养,将步骤D诱导获得的愈伤组织接种于增殖培养基中,获得大量愈伤组织。
优选的,所述步骤A所述叶片为当年生新梢上生长良好的幼嫩叶片。
优选的,步骤B所述消毒的方法具体指用含洗洁精的清水浸泡叶片后,用清水清洗,然后依次用70%酒精和2%次氯酸钠处理,最后用无菌水清洗。
优选的,所述外植体消毒的方法具体为:外植体在含洗洁精的清水中浸泡15min,在流水下小心冲洗1-2h,然后在超净工作台中切割成0.5×0.5cm大小的叶盘,用无菌水清洗3次;
接着用70%酒精处理40s,用无菌水清洗3-4次;再用2%次氯酸钠溶液处理25min,最后用无菌水清洗3-4次。
优选的,步骤C所述抗氧化剂PVP的浓度为2.0g L-1。
优选的,步骤D所述诱导培养基为MS+6-BA 4.0mg·L-1+IBA 1.5mg·L-1+PVP2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1,pH为5.8,用于诱导愈伤组织。
优选的,步骤E所述增殖培养基为MS+TDZ 2.0mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1+PVP2.0g·L-1+蔗糖30·g L-1+琼脂8·g L-1,pH为5.8,用于愈伤组织增殖培养。
优选的,所述步骤D和步骤E中培养条件均为每天光照培养16h,光照强度90μmol·m-2·s-1条件下,温度为25-28℃;黑暗培养8h,温度为23-25℃,相对湿度为70%-85%。
本发明提供了一种安吉白茶红色愈伤组织培养和快繁的方法,包括诱导培养,增殖培养。该技术能够快速高效的繁殖安吉白茶红色愈伤组织,为提取花青苷提供大量优质原料,并为培育茶树新品种提供材料。因此实用性强、应用前景大。
附图说明
图1为安吉白茶愈伤组织。
图2为安吉白茶愈伤组织花青苷含量
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
(1)外植体预处理
选择安吉白茶当年生新梢上生长良好的幼嫩叶片,用0.5%洗洁精溶液中浸泡15min,冲洗干净后,在自来水下冲洗1h。
(2)外植体消毒
叶片消毒:将预处理的外植体移至超净工作台中,用70%酒精消毒40s,无菌水清洗3-4次后,用2%次氯酸钠消毒25min,无菌水清洗5-6次。将消毒后的外植体放入带有滤纸的培养皿内(均灭菌),吸干表面水分,切割成0.5×0.5cm大小的叶盘,平铺于培养基中。
(3)抑制外植体褐化
将消毒后的叶片接种于不同浓度的PVP培养基,20天后统计褐化率,筛选出抑制外植体褐化的最适浓度为2.0g·L-1。
(4)诱导愈伤组织
将消毒后的叶片接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养,诱导培养基为MS+6-BA4.0mg·L-1+IBA 1.5mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1,pH为5.8,培养20天后叶片边缘脱分化出颗粒状红色愈伤组织,选用诱导30天后的愈伤组织进行增殖培养(图1A)。
(5)愈伤组织增殖培养
选取诱导的愈伤组织放置于增殖培养基上,进行增殖培养,培养基为MS+TDZ0.5mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1,pH为5.8,培养30天后获得大量愈伤组织。(图1B)
步骤(4)和(5)培养条件均为每天光照培养16h,光照强度90μmol·m-2·s-1条件下,温度为25-28℃;黑暗培养8h,温度为23-25℃,相对湿度为70%-85%。
实施例2
(1)外植体预处理
选择安吉白茶当年生新梢上生长良好的幼嫩叶片,用0.5%洗洁精溶液中浸泡15min,冲洗干净后,在自来水下冲洗1h。
(2)外植体消毒
叶片消毒:将预处理的外植体移至超净工作台中,用70%酒精消毒40s,无菌水清洗3-4次后,用2%次氯酸钠消毒25min,无菌水清洗5-6次。将消毒后的外植体放入带有滤纸的培养皿内(均灭菌),吸干表面水分,切割成0.5×0.5cm大小的叶盘,平铺于培养基中。
(3)抑制外植体褐化
将消毒后的茎段接种于不同浓度的PVP培养基,20天后统计褐化率,筛选出抑制外植体褐化的最适浓度为2.0g·L-1。
(4)诱导愈伤组织
将消毒后的叶片接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养,诱导培养基为MS+6-BA4.0mg·L-1+IBA 1.5mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1,pH为5.8,培养20天后叶片边缘脱分化出颗粒状愈伤组织,选用诱导40天后的愈伤组织进行增殖培养(图1A)。
(5)愈伤组织增殖培养
选取诱导的愈伤组织放置于增殖培养基上,进行增殖培养,培养基为MS+TDZ2.0mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1,培养30天后获得大量愈伤组织。(图1C)步骤(4)和(5)培养条件均为每天光照培养16h,光照强度90μmol·m-2·s-1条件下,温度为25-28℃;黑暗培养8h,温度为23-25℃,相对湿度为70%-85%。
实施例3
(1)外植体预处理
选择安吉白茶当年生新梢上生长良好的幼嫩叶片,用0.5%洗洁精溶液中浸泡15min,冲洗干净后,在自来水下冲洗1h。
(2)外植体消毒
叶片消毒:将预处理的外植体移至超净工作台中,用70%酒精消毒40s,无菌水清洗3-4次后,用2%次氯酸钠消毒25min,无菌水清洗5-6次。将消毒后的外植体放入带有滤纸的培养皿内(均灭菌),吸干表面水分,切割成0.5×0.5cm大小的叶盘,平铺于培养基中。
(3)抑制外植体褐化
将消毒后的茎段接种于不同浓度的PVP培养基,20天后统计褐化率,筛选出抑制外植体褐化的最适浓度为2.0g·L-1。
(4)诱导愈伤组织
将消毒后的叶片接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养,诱导培养基为MS+6-BA4.0mg·L-1+IBA 1.5mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1,pH为5.8,培养20天后叶片边缘脱分化出颗粒状愈伤组织,选用诱导40天后的愈伤组织进行增殖培养(图1A)。
(5)愈伤组织增殖培养
选取诱导的愈伤组织放置于增殖培养基上,进行增殖培养,培养基为MS+TDZ2.0mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30·g L-1+琼脂8·g L-1,pH为5.8,培养30天后获得大量愈伤组织。(图1D)
步骤(4)和(5)培养条件均为每天光照培养16h,光照强度90μmol·m-2·s-1条件下,温度为25-28℃;黑暗培养8h,温度为23-25℃,相对湿度为70%-85%。
对比例1
一种与实施例1相似的组培方法,区别在于,步骤(5)增殖培养基为MS+6-BA0.5mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1(图1E)。
对比例2
一种与实施例1相似的组培方法,区别在于,步骤(5)增殖培养基为增殖培养基为MS+6-BA 1.0mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1。
对比例3
一种与实施例1相似的组培方法,区别在于,步骤(5)增殖培养基为增殖培养基为MS+6-BA 2.0mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1。
对比例4
一种与实施例1相似的组培方法,区别在于,步骤(5)增殖培养基为MS+TDZ1.0mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30·g L-1+琼脂8·g L-1。
对比例5
一种与实施例3相似的组培方法,区别在于,步骤(5)增殖培养基为MS+TDZ2.0mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30·g L-1+琼脂8·g L-1。
对比例6
一种与实施例3相似的组培方法,区别在于,步骤(5)增殖培养基为MS+TDZ2.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30·g L-1+琼脂8·g L-1(图1F)。
观察和统计实施例1-3与对比例1-6利用外植体诱导愈伤组织并促进愈伤组织增殖的情况,初代培养时IBA和6-BA诱导的愈伤组织比较疏松,色泽呈现绿中带红(图1A)。继代增殖培养时含有6-BA的增殖培养基培养的愈伤组织增殖倍数较低,呈显绿色(图1E和表1)。含有TDZ的增殖培养基培养的愈伤组织增殖倍数较高,并且愈伤组织质地更为疏松,颜色为红色(图1B-C和表1)。在TDZ的基础上加入IBA能将红色愈伤组织的增殖倍数提高至4.73(图1D和表1),而且红色愈伤组织的颜色加深,花青苷含量达到1.02·mg g-1(图2)。培养基中加入NAA愈伤的增殖倍数降低,愈伤生长速度变慢,质地变硬,绿色愈伤组织增多,红色愈伤组织减少(图1F和表1)。
表1安吉白茶红色愈伤组织的增殖优化
增殖倍数 | 生长状态 | |
实施例1 | 3.00±0.02b | 红色带微绿较疏松 |
实施例2 | 3.49±0.07a | 红色带微绿疏松 |
实施例3 | 4.73±0.36a | 红色疏松 |
对比例1 | 1.59±0.02b | 绿色脆硬 |
对比例2 | 1.85±0.3b | 绿色脆硬 |
对比例3 | 1.72±0.12b | 绿色脆硬 |
对比例4 | 3.39±0.29b | 红色带微绿疏松 |
对比例5 | 4.13±0.7a | 红色带微绿疏松 |
对比例6 | 2.15±0.32b | 绿色微红色较硬 |
本发明提供了一种安吉白茶红色愈伤组织培养方法,筛选出适合安吉白茶红色愈伤组织诱导和繁殖的培养基,实现安吉白茶红色愈伤组织快速繁殖,为短时间内提取茶树花青苷提供大量优质原料。
以上对本发明的具体实施方案例进行了描述。但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做各种改动和修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种安吉白茶叶片诱导红色愈伤及增殖的方法,其特征在于,包括以下步骤:
A外植体选择,选用无病虫害叶片作为外植体;
B外植体消毒,流水清洗后,用消毒液浸泡,然后经无菌水漂洗,获得消毒的外植体;
C抑制外植体褐化,将步骤B获得的消毒的外植体接种到含抗氧化剂PVP的培养基上;
D诱导愈伤组织,将步骤C获得的消毒的外植体接种到诱导培养基,诱导愈伤组织;
E愈伤增殖培养,将步骤D诱导获得的愈伤组织接种于增殖培养基中,获得大量愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤A所述叶片为当年生新梢上生长良好的幼嫩叶片。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤B所述获得消毒的外植体具体指用含洗洁精的清水浸泡叶片后,用清水清洗,然后依次用70%酒精和2%次氯酸钠处理,最后用无菌水清洗。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述获得消毒的外植体具体为:外植体在含洗洁精的清水中浸泡15min,在流水下小心冲洗1-2h,然后在超净工作台中切割成0.5×0.5cm大小的叶盘,用无菌水清洗3次;接着用70%酒精处理40s,用无菌水清洗3-4次;再用2%次氯酸钠溶液处理25min,最后用无菌水清洗3-4次。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤C抗氧化剂PVP的浓度为2.0g L-1。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤D所述诱导培养基为MS+6-BA 4.0mg·L-1+IBA 1.5mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1,pH为5.8。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤E所述增殖培养基为MS+TDZ 2.0mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1+PVP 2.0g·L-1+蔗糖30·g L-1+琼脂8·g L-1,pH为5.8。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤D和步骤E中培养条件均为每天光照培养16h,光照强度90μmol·m-2·s-1条件下,温度为25-28℃;黑暗培养8h,温度为23-25℃,相对湿度为70%-85%。
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Citations (4)
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2022
- 2022-08-18 CN CN202210995595.3A patent/CN115623985A/zh active Pending
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