CN115558651A

CN115558651A - 一种能够催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的糖基转移酶CaUGT

Info

Publication number: CN115558651A
Application number: CN202111680606.0A
Authority: CN
Inventors: 宋浩; 汪振洋; 马媛媛; 魏晓珍; 洪解放
Original assignee: Tianjin University; Sinochem Health Co Ltd
Current assignee: Tianjin University; Sinochem Health Co Ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-01-03

Abstract

本发明公开了一种能够催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的糖基转移酶CaUGT，构建该酶在大肠杆菌重组中的重组菌，获得的重组酶粗酶液及纯化酶能将低值的催化莱鲍迪苷A生成高值的多种甜菊糖苷衍生物。其核酸序列为：a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或与a)的核苷酸序列不同，能够编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。将该酶基因克隆到大肠杆菌表达载体上，实现了该酶在大肠杆菌中的异源表达，获得的重组蛋白CaUGT实现了以UDPG为糖基供体，催化底物莱鲍迪苷A直接生成莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2，能一步将低值的甜菊糖苷转化为高值的甜菊糖苷，对生化法绿色转化高值甜菊糖苷的产业经济具有重大意义。

Description

一种能够催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的糖基转移酶CaUGT

技术领域

本发明涉及生物工程及分子生物学领域，具体涉及一种糖基转移酶CaUGT在糖苷类化合物生产中的应用。

背景技术

甜菊糖苷是来自南美洲甜叶菊的一种天然甜味剂，因其高甜度(约为蔗糖的250-400倍)，零热量的特性，在南美洲地区广泛使用。近年来，在天然甜叶菊体内发现了多种甜菊糖苷等衍生物(包括甜菊糖苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M等)。此后，在生物催化反应中，发现莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M存在同分异构体莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2。其结构式如下：

莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M分别于2008年、2013年、2014年获得美国食品药物管理局(USFDA)的一般安全(GRAS)认证。

甜菊糖苷分别以β-1，β-(1-2)，β-(1-3)，β-(1-6)糖苷键连接不同数量的葡萄糖基，从而形成多种甜菊糖苷衍生物，但甜菊糖苷衍生物的最终均可以代谢为甜菊醇。因此，单一甜菊糖苷的安全性数据可用于支持其他甜菊糖苷衍生物的使用安全性。

在天然甜叶菊体内莱鲍迪苷A在UGT91D2的催化下生成莱鲍迪苷D，同时也可在UGT76G1的催化下生成莱鲍迪苷I，莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷I可进一步糖基化生成莱鲍迪苷M和莱鲍迪苷M2。随着糖基数量的增多，甜度逐渐提高，后苦味逐渐降低，但天然含量也逐渐降低，导致从天然种植物中直接提取高值的甜菊糖苷的经济效益较低。莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷M2为莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的同分异构体，其差异仅在于糖基位置的不同，具有潜在的经济价值。此发明可以廉价的莱鲍迪苷A为底物，一步法直接催化生成多种甜菊糖苷衍生物(包括包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2)，尤其在莱鲍迪苷M2的合成中，无需外源加入直接底物莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷I，对甜菊糖苷的经济化生产具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种能够催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的糖基转移酶CaUGT以及重组菌在催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2)方面的应用，解决现有技术中从天然种植物中直接提取高值的甜菊糖苷的经济效益较低的问题。

本发明的具体方案为：

一种催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的辣椒糖基转移酶CaUGT，所述辣椒来源糖基转移酶CaUGT核酸序列为：

a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

b)或与a)的核苷酸序列不同，能够编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

一种重组载体，是将权利要求1所述辣椒来源糖基转移酶CaUGT基因克隆到包括pPICZα-A/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33、YEplac195、pHT01、pHT08、pHT43、pET系列载体、pMAL、pCOLD系列载体和pBAD系列载体中的任意一种，构建得到重组载体。

一种重组菌，将所述的重组载体转化到宿主细胞中，得到的重组菌；所述宿主细胞包括埃希氏菌属、巴斯德毕赤酵母菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的任意一种。

所述埃希氏菌属包括E.coli BL21(DE3)、BL21star(DE3)、Tuner(DE3)、T7Express和BL21-A1中的任意一种。

糖基转移酶CaUGT在催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的应用，包括如下步骤：

(1)将能够表达辣椒糖基转移酶CaUGT的重组菌接种在含有诱导剂的培养基中培养；

(2)收集步骤(1)中获得的重组蛋白纯化后，获得纯化酶CaUGT；

(3)将步骤(2)获得的纯化酶加入到含有莱鲍迪苷A、UDPG、金属阳离子及缓冲液的反应体系中，进行糖基化反应催化生成多种甜菊糖苷衍生物。

所述步骤(1)重组菌的诱导表达方式是为：将重组菌接种到LB培养基中培养至OD600＝0.5-0.9时，加入0.1-1.2M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。

所述的重组菌诱导表达温度在18-30℃，诱导表达时间5-17h；将诱导后菌液离心，收集菌体，破胞后离心得到重组酶。

所述的多种甜菊糖苷产物包括莱鲍迪苷D莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2中的任意一种。

所述步骤(3)糖基化反应的温度为18℃-60℃，糖基化反应时间为6～96h，糖基化反应体系的pH为5.0-10.5。

步骤(1)优选为：将能够表达糖基转移酶CaUGT的重组菌接种在含有IPTG的培养基中培养5-18h；

步骤(2)优选为：收集步骤(1)获得的重组蛋白，超声破碎后收集粗酶液，离心收集上清即为重组酶，重组酶利用GE公司的镍树脂柱进行蛋白纯化，获得纯化酶CaUGT；

步骤(3)优选为：构建含有1-20g/L莱鲍迪苷A、1-6mM UDPG、1-6mM金属阳离子、pH6.0-10.5的缓冲液及CaUGT纯化酶的反应体系，置于25-50℃，反应1-48h，得到多种甜菊糖苷衍生物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2)。为了节约UDPG的成本，y也可以通过添加蔗糖合酶+蔗糖底物+UDP的方式实现UDPG的添加，利用蔗糖合酶将蔗糖分解成为葡萄糖和果糖，葡萄糖与UDP结合，形成UDPG。

所述重组菌株的构建方法为：将辣椒糖基转移酶CaUGT核酸序列连接至表达载体后，构建至宿主细胞，获得重组菌。

在一些实施案例中，本发明提供了一种重组酶，所述重组酶包含SEQ ID NO.2具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列。

所述重组酶由上述的任一重组菌诱导制备。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将诱导后菌液离心，收集菌体，破胞后离心得到重组酶。

在一些实施方案中，所述粗酶液采用GE公司的Ni-NTAHis.Bind树脂对进行纯化。

有益效果：

本发明公开了一种来自辣椒的糖基转移酶CaUGT，能够催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2)。将该酶基因克隆到大肠杆菌表达载体上，实现了该酶在大肠杆菌中的异源表达，获得的重组蛋白CaUGT实现了以UDPG为糖基供体，催化底物莱鲍迪苷A直接生成莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2的突破，反应中不需添加莱鲍迪苷M2的直接底物莱胞迪苷D，节约了经济成本，简化了工艺过程，收率较高，对甜菊糖苷的工业经济化生产具有重大意义。

附图说明

图1为实施例1中得到的含有辣椒糖基转移酶CaUGT核酸序列的质粒图谱；

图2为实施例2重组蛋白CaUGT粗酶液的SDS-PAGE蛋白电泳图谱；

图3为实施例3中重组蛋白CaUGT催化反应HPLC结果图；

图4为实施例3中三种产物的MS及NMR检测图谱；A：HPLC保留时间为3.8min的产物MS及NMR检测图谱；B：HPLC保留时间为6.4min的产物MS及NMR检测图谱；C：HPLC保留时间为8.4min的产物MS及NMR检测图谱；

图5为实施例4中各种UDPG浓度下CaUGT酶促反应的相对催化活性；

图6为实施例5中不同反应温度条件下CaUGT酶促反应的相对催化活性；

图7为实施例6中不同反应pH条件下CaUGT酶促反应的相对催化活性；

图8为实施例7中不同金属离子对CaUGT酶促反应的影响；以不加金属离子为对照计算相对活性；A：以RA转化计算相对活性；B：以RM2生成计算相对活性；C：以RD生成计算相对活性；D：以RI生成计算相对活性。

具体实施方式

本发明中所使用的简称如下：

莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷M2分别简称为RebA、Reb D、Reb I和Reb M2。

二磷酸尿苷葡糖简称为UDPG；

二磷酸尿苷简称为UDP；

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷简称为IPTG；

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

糖基转移酶CaUGT基因的获取及重组菌株的构建

从GenBank中下载辣椒(Capsicum annuum L.)糖基转移酶氨基酸序列(SEQ IDNO：2)及核酸序列(SEQ ID NO：1)，由GenScript公司对核酸序列进行密码子优化，并将优化后的合成基因通过酶切位点Nco1和Xho1连接至载体pET28a(+)，得到质粒pET28a(+)-CaUGT，质粒图谱见图1。

将所得质粒pET28a-CaUGT转化至E.coli BL21感受态细胞中，采用含有50μg/ml(也可以是50～100μg/ml)卡那霉素的LB(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl，1.6％琼脂粉)固体平板进行筛选，将筛选出的单克隆转化子进行菌落PCR鉴定，得到重组菌株E.coliBL21(pET28a-CaUGT)。

上述重组质粒也可转化至E.coli Tuner(DE3)、BL21star(DE3)和T7Express和BL21-A1等感受态细胞，并获得相应的重组菌株。

实施例2

重组菌株的诱导表达及粗酶液的制备

以重组菌株BL21(DE3)(pET28a-CaUGT)为例，说明辣椒糖基转移酶CaUGT基因在大肠杆菌中的表达方式。

菌株BL21(DE3)(pET28a-CaUGT)在含有50μg/ml(也可以是50-100μg/ml中任一数值)卡那霉素的TB液体培养基(1.2％蛋白胨，2.4％酵母粉，0.4％甘油)中于37℃、220rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.9，加入终浓度0.1-1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在18℃-30℃条件下诱导表达5-17h。

将诱导表达的培养物离心(12000rpm、4℃、10min)，弃去上清液，收集菌体沉淀。再将收集的菌体用10mM PBS(pH7.2)洗涤1次，除净菌体上残留的培养基；按原菌液体积1/20的比例用10mM PBS(pH7.2)重悬菌体，在冰浴中超声破胞，条件：150W，工作5s，间歇8s，全程8min。离心(12000rpm、4℃、10min)收集上清，上清即为糖基转移酶CaUGT的粗酶液。

取5～20μL粗酶液，加入5×蛋白上样loading buffer，混匀后，100℃高温条件下进行10min的变性失活处理，离心(12000rpm、4℃、2～10min)，上清用于10％SDS-PAGE凝胶蛋白电泳，从图2可知在52kDa处有一条明显的条带，与预估的目的蛋白的大小基本一致，说明成功的制备出了重组蛋白CaUGT的粗酶液。

实施例3

CaUGT催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的糖基化反应

将实施例2中所制粗酶液加入0.5ml体系的酶促反应体系中(1g/L RebA，1mMUDPG，3mM MgCl₂，50mM PBS缓冲液，加入粗酶溶液361μL)。30℃静置反应24h后，加入0.2mL100％色谱乙腈停止反应，混匀后静置10min，12000rpm离心10min，过0.22μm有机膜，用HPLC分析底物和产物的浓度。

HPLC采用岛津TECAN INFINITE200M PLEX高效液相色谱进行检测，流动相为25％乙腈，流速1ml/min，柱温40℃，检测器波长210nm，进样量50μL。

通过液相分析发现，糖基转移酶CaUGT能够以UDPG为糖基供体，催化RebA生成三种甜菊糖苷衍生物，保留时间分别为3.8min，6.4min，8.4min(图3)，将三种产物利用高效液相色谱分离后，结合质谱及核磁共振波普确认了所产生的化合物结构(图4)。

保留时间为3.8min的产物质谱图(图4A左)显示离子峰的质荷比为1313.5199[M+Na]+,对比其理论值(1314.2928,C₅₆H₉₀NaO₃₃),提示样品分子式为C₅₆H₉₀O₃₃,与Reb M2的结构一致。核磁共振氢谱(图4A右)数据分析发现化学位移在0.5ppm-2.5ppm附近处主要为该结构苷元部分的亚甲基氢信号；3.0ppm-4.0ppm附近处，主要为葡萄糖上除端基的氢信号；5.5-4.8ppm处的氢信号,为葡萄糖的端基氢信号对应结构的H-20,25,32,44,60,67,79。此处积分面积约为10H。将该核磁氢谱与RD核磁氢谱比较发现在3.8-4.3ppm附近处，标红处有更多的氢信号，进一步证明为该产物为Reb M2。

保留时间为6.4min的产物质谱图(图4B左)显示离子峰的质荷比为1151.4665[M+Na]+,对比其理论值(1151.4734,C₅₀H₈₀NaO₂₈),提示样品分子式为C₅₀H₈₀O₂₈,与RD的结构一致。核磁共振氢谱(图4B右)数据分析发现化学位移在在0.5ppm-2.5ppm附近处主要为该结构的苷元部分的亚甲基氢信号，3.0ppm-4.0ppm附近处，主要为葡萄糖上除端基的氢信号，5.5-4.8ppm处的氢信号，为葡萄糖的端基氢信号对应结构的H-20,25,32,44,60,67。此处积分面积约为12H。再结合RD的液相保留时间与标准品一致，进一步证明为RD的结构。

保留时间为6.4min的产物质谱图(图4C左)质谱图中显示离子峰的质荷比为1151.4668[M+Na]⁺,对比其理论值(1151.4734,C₅₀H₈₀NaO₂₈),提示样品分子式为C₅₀H₈₀O₂₈,与RI的结构一致。

核磁共振氢谱(图4C右)数据分析发现化学位移在0.5ppm-2.5ppm附近处主要为该结构的苷元部分的亚甲基氢信号，3.0ppm-4.0ppm附近处，主要为葡萄糖上除端基的氢信号，在5.5-4.8ppm处的氢信号,为葡萄糖的端基氢信号对应结构的H-20,25,32,44,60,67。此处积分面积约为12H。将RD核磁氢谱与RI核磁氢谱比较发现在两个氢谱基本一致，但在4.0-4.5ppm附近处氢信号稍有差异，因为RD与RI葡萄糖的连接方式不同，是此处的氢化学环境不同导致，再结合RD的液相保留时间与RD标准品一致，进一步证明为RI的结构。

实施例4

在含有各种UDPG浓度的反应体系中CaUGT催化活性

将纯化酶CaUGT加入含有1g/LRebA、50mM PBS(pH＝7.2)和3mM Mg²⁺(氯化镁)的0.5mL反应混合物中，再分别加入1mM、2mM、3mM、4mM的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，30℃静置反应24h，对反应样品进行液相分析检测其催化活性，以观察不同UDPG浓度对酶促反应的影响。由图2可知，UDPG终浓度为1mM–4mM时，催化活性随着UDPG浓度的增加而显著增加，并逐渐趋于平衡，当UDPG浓度为4mM时，催化活性达到最大值，RA转化率为85.53％。UDPG浓度为3mM时，催化活性可达最高催化活性的98.71％，接近最高值，比1mM浓度UDPG的催化活性提高了48.23％，结合经济因素考虑可选用3mM的UDPG浓度作为最佳酶促反应条件。

实施例5

在各种反应温度下CaUGT的催化活性

将纯化酶CaUGT加入含有1g/L RebA、50mM PBS(pH＝7.2)、1mM尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和3mM Mg²⁺⁽氯化镁)的0.5mL反应混合物中，分别在25–50℃的温度条件下静置反应24h，对反应样品进行液相分析检测其催化活性，以确定最适酶促反应温度(图3)。40℃为酶促反应的最佳温度，30℃–40℃时显示出75％以上的相对活性。因而CaUGT在30℃–40℃温度范围内能有效的催化RA的转化。

实施例6

在各种反应pH下CaUGT的催化活性

将纯化酶CaUGT加入含有1g/LRebA、1mM尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和3mM Mg²⁺(氯化镁)的0.5mL反应混合物中，再分别加入不同pH值的缓冲液：磷酸钾缓冲液(pH6.0–8.0)、Tris-HCl缓冲液(pH8.0–9.0)和甘氨酸缓冲液(pH9.0–10.5)，30℃静置反应24h，对反应样品进行液相分析检测其催化活性，测定CaUGT在pH5.0–10.5范围内的活性，以确定最适酶促反应pH(图4)。CaUGT的最适反应缓冲液为Tris-Hcl pH8.5，在pH8.0-9.5显示出87％以上的活性。因而CaUGT在pH8.0-9.5范围内能有效的催化RA的转化。

实施例7

在各种金属离子的反应体系中CaUGT的催化倾向性

将纯化酶CaUGT加入含有1g/LRebA、1mM尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、50mM PBS(pH＝7.2)的0.5mL反应混合物中，再分别加入三种不同浓度(1mM、3mM、6mM)六种二价金属离子，分别为Ca²⁺(硝酸钙)、Pb²⁺(醋酸铅)、Ba²⁺(氯化钡)、Zn²⁺(硫酸锌)、、Mn2+(氯化锰)、Mg²⁺(氯化镁)，在30℃的温度条件下静置反应24h，对反应样品进行液相分析检测其催化活性，以不加金属离子的反应作为对照组，计算各种金属离子反应条件下的相对活性，以确定反应最适的金属离子及浓度(图5)。

在酶促反应催化体系中加入Zn²⁺会明显抑制CaUGT酶的催化活性，使CaUGT相对活性了降低至12％-62％；Mg²⁺的使用会增强酶的催化活性，Mg²⁺终浓度为6mM时，CaUGT的相对活性最高，RA转化(121.36％)及三种产物(RM2：137.70％；RD：124.63％：RI：119.55％)的生成相对活性均最高。推测主要原因是由于不同金属离子能以不同的方式与底物、酶的活性产物和酶本身产生极强的亲和力，而导致酶活性的改变。因此可选择6mM Mg²⁺作为最优反应体系金属离子进行下一步探究。

SEQUENCE LISTING

<110> 中化健康产业发展有限公司天津大学

<120> 一种能够催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的糖基转移酶CaUGT

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<211> 1362

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

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atgggtaccc tgcgtgttct gatgttcccg tttctggcgt acggccacat cagcccgtat 60

ctgaacgtgg cgaagaaact ggcggatcgt ggtttcctga tctacttttg cagcaccgcg 120

atcaacctga agtacaccat caagaaaatt ccggagaagt atagcgacag catccagctg 180

gttgaactgc acctgccgga gctgccggaa ctgccgccgc actatcatac caccaacggc 240

ctgccgccgc acctgaacca caccctgcaa aaggcgctga aaatgagcaa gccgaacttc 300

gcgaaaatcc tgcgtagcct gaagccggat ctggtgattt acgacgttct gcaacaatgg 360

gcgcagagcg tggcgaacga tcaaaacatc ccggcggtta aaatgctgac cagcggtgcg 420

gcggtgatta gctatttctt taacctgcgt aagaaaccgg gcgtggagtt cccgtacccg 480

gcgatctatc tgaccaaaat tgagcaggtg aaggttgcgg aactgctggc gaaggcggat 540

aaggagaaag aaccggacga tgttgatccg tttgcggacg gtaacatgca aatcatgctg 600

atgagcacca gccgtgtgct ggaggcgaaa tacattgact tctttaccga actgggtcac 660

tggaaggttg ttccggtggg tccgccggtt caggacccga tcattgacga ggtggacgat 720

gttgaactga tcgattggct gggtatgaaa gacgagagca gcaccgtgtt cgttagcttt 780

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ggttggaaca gcattatgga aagcatggat tttggcgttc cgatcattgc gatcccgatg 1080

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gttcgtgacg atgacggcaa gttccaccgt ggcgagattg cggaaaccct gaaagatgtg 1200

atcacccgta agcgtggcga gattctgcgt gcgaaagttc gtgacatcag caaaaacctg 1260

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<212> PRT

<213> Capsicum annuum

<400> 2

Met Gly Thr Leu Arg Val Leu Met Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Gly His

1 5 10 15

Ile Ser Pro Tyr Leu Asn Val Ala Lys Lys Leu Ala Asp Arg Gly Phe

20 25 30

Leu Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Ala Ile Asn Leu Lys Tyr Thr Ile Lys

35 40 45

Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ser Asp Ser Ile Gln Leu Val Glu Leu His

50 55 60

Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn Gly

65 70 75 80

Leu Pro Pro His Leu Asn His Thr Leu Gln Lys Ala Leu Lys Met Ser

85 90 95

Lys Pro Asn Phe Ala Lys Ile Leu Arg Ser Leu Lys Pro Asp Leu Val

100 105 110

Ile Tyr Asp Val Leu Gln Gln Trp Ala Gln Ser Val Ala Asn Asp Gln

115 120 125

Asn Ile Pro Ala Val Lys Met Leu Thr Ser Gly Ala Ala Val Ile Ser

130 135 140

Tyr Phe Phe Asn Leu Arg Lys Lys Pro Gly Val Glu Phe Pro Tyr Pro

145 150 155 160

Ala Ile Tyr Leu Thr Lys Ile Glu Gln Val Lys Val Ala Glu Leu Leu

165 170 175

Ala Lys Ala Asp Lys Glu Lys Glu Pro Asp Asp Val Asp Pro Phe Ala

180 185 190

Asp Gly Asn Met Gln Ile Met Leu Met Ser Thr Ser Arg Val Leu Glu

195 200 205

Ala Lys Tyr Ile Asp Phe Phe Thr Glu Leu Gly His Trp Lys Val Val

210 215 220

Pro Val Gly Pro Pro Val Gln Asp Pro Ile Ile Asp Glu Val Asp Asp

225 230 235 240

Val Glu Leu Ile Asp Trp Leu Gly Met Lys Asp Glu Ser Ser Thr Val

245 250 255

Phe Val Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu

260 265 270

Glu Ile Ala Phe Gly Leu Glu Asn Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val

275 280 285

Ala Arg Phe Pro Lys Gly Glu Glu Gln Asn Leu Glu Asp Val Leu Pro

290 295 300

Lys Gly Phe Leu Glu Arg Ile Gly Asp Arg Gly Arg Val Leu Asn Lys

305 310 315 320

Phe Ala Pro Gln Pro Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe

325 330 335

Ile Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Met Glu Ser Met Asp Phe Gly

340 345 350

Val Pro Ile Ile Ala Ile Pro Met His Leu Asp Gln Pro Met Asn Ala

355 360 365

Arg Leu Met Val Glu Leu Gly Val Ala Ile Glu Ile Val Arg Asp Asp

370 375 380

Asp Gly Lys Phe His Arg Gly Glu Ile Ala Glu Thr Leu Lys Asp Val

385 390 395 400

Ile Thr Arg Lys Arg Gly Glu Ile Leu Arg Ala Lys Val Arg Asp Ile

405 410 415

Ser Lys Asn Leu Lys Ser Val Arg Asp Glu Glu Ala Asp Val Val Ala

420 425 430

Lys Glu Leu Ile Gln Leu Cys Lys Asp Ser Asn Lys Cys Asn Leu Glu

435 440 445

His His His His His His

450

Claims

1.一种催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的辣椒糖基转移酶CaUGT，其特征在于，所述辣椒来源糖基转移酶CaUGT核酸序列为：

a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.一种重组载体，其特征在于，是将权利要求1所述辣椒来源糖基转移酶CaUGT基因克隆到包括pPICZα-A/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33、YEplac195、pHT01、pHT08、pHT43、pET系列载体、pMAL、pCOLD系列载体和pBAD系列载体中的任意一种，构建得到重组载体。

3.一种重组菌，其特征在于，将权利要求2所述的重组载体转化到宿主细胞中，得到的重组菌；所述宿主细胞包括埃希氏菌属、巴斯德毕赤酵母菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述埃希氏菌属包括E.coliBL21(DE3)、BL21star(DE3)、Tuner(DE3)、T7Express和BL21-A1中的任意一种。

5.糖基转移酶CaUGT在催化莱鲍迪苷A生成多种甜菊糖苷衍生物的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(2)收集步骤(1)中获得的重组蛋白纯化后，获得纯化酶CaUGT；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)重组菌的诱导表达方式是为：将重组菌接种到LB培养基中培养至OD600＝0.5-0.9时，加入0.1-1.2M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的重组菌诱导表达温度在18-30℃，诱导表达时间5-17h；将诱导后菌液离心，收集菌体，破胞后离心得到重组酶。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的多种甜菊糖苷产物包括莱鲍迪苷D莱鲍迪苷I和莱鲍迪苷M2中的任意一种。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)糖基化反应的温度为18℃-60℃，糖基化反应时间为6～96h，糖基化反应体系的pH为5.0-10.5。