CN115558037A - 一种灵芝β-葡聚糖提取物及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种灵芝β‑葡聚糖提取物及其制备方法和检测方法，包括：S1.将灵芝子实体粉碎后与溶剂混合，再加入胰酶，酶解0.5～2h，分离得灵芝子实体滤渣；S2.将灵芝子实体滤渣与碱溶液混合，在加热条件下超声提取，所得滤液调pH值至中性并浓缩，得灵芝粗多糖；S3.将灵芝粗多糖进行醇析，分离所得沉淀并冷冻干燥，得灵芝β‑葡聚糖粗提物；S4.灵芝β‑葡聚糖粗提物采用葡萄糖凝胶柱层析纯化，得到灵芝β‑葡聚糖提取物。制备方法简便，产品纯度高，提取效率高，检测方法简便快速、灵敏准确。

Description

一种灵芝β-葡聚糖提取物及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种灵芝β-葡聚糖提取物及其制备方法和检测方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum(Curtis)P.Karst.)，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科植物紫芝赤芝的全株。自古以来是一种名贵的中药材，原均为野生，主要生长于浙江、广西、江西、湖南等地，现随着人类栽培技术的提高，主要以栽培为主，其中山东的产量最多。随着研究的不断深入，灵芝更多的生物活性被挖掘，主要用于保肝解毒、治疗糖尿病、改善心血管系统、预防衰老、提高机体免疫力等。

灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，是从灵芝孢子或灵芝子实体中提取而得，目前分离得到的灵芝多糖有200多种，其中大部分为β-葡聚糖，少数为α-葡聚糖。β-葡聚糖是灵芝多糖中最具活性的成分，因具有免疫调节、抗肿瘤、抗结肠炎、抗菌、抗病毒等多种活性，在临床中发挥着重要的作用，因此，对其制备分离方法并定量检测分析进行研究具有很大的医学意义。

目前主要用于制备灵芝β-葡聚糖的方法有热水提法、超声提取法、微波提取法等，提取效率低、用时长、产物所含杂质多，迫切需要一种高含量灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种灵芝β-葡聚糖提取物及其制备方法和检测方法，制备方法简便，产品纯度高，提取效率高，检测方法简便快速、灵敏准确。

本发明通过以下技术方案实现：

一种灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，包括：

S1.将灵芝子实体粉碎后与溶剂混合，再加入胰酶，酶解0.5～2h，分离得灵芝子实体滤渣；

S2.将灵芝子实体滤渣与碱溶液混合，在加热条件下超声提取，所得滤液调pH值至中性并浓缩，得灵芝粗多糖；

S3.将灵芝粗多糖进行醇析，分离所得沉淀并冷冻干燥，得灵芝β-葡聚糖粗提物；

S4.灵芝β-葡聚糖粗提物采用葡萄糖凝胶柱层析纯化，得到灵芝β-葡聚糖提取物。

优选的，S1中，所述溶剂为乙醇溶液、甲醇溶液或N，N-二甲基甲酰胺溶液。

优选的，S1中，所述溶剂为乙醇溶液。

优选的，S2中，加热温度为60～80℃。

优选的，S2中，所述碱溶液为氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液的浓度为0.01～1mol/mL。

优选的，S3具体为：将灵芝粗多糖加入2～5倍体积的90％乙醇溶液中，室温下放置8～12h醇析，收集沉淀并冷冻干燥，得灵芝β-葡聚糖粗提物。

优选的，S4中，以0.1mol/L NaOH溶液作为流动相进行层析纯化。

采用所述的制备方法得到灵芝β-葡聚糖提取物。

一种灵芝β-葡聚糖提取物的检测方法，包括：

采用葡萄糖标准品制备不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液进行高效液相色谱分析，得到色谱峰面积，根据标准品溶液的浓度和色谱峰面积绘制出浓度-峰面积标准曲线；

取灵芝β-葡聚糖提取物，溶于盐酸中，加水加压进行水解，所得水解液冷却后，加KOH溶液调节pH值至6～7；加入用0.2mol/L pH 5.2醋酸钠缓冲液稀释的β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶液，混匀，酶解反应1～2h，将得到的酶解液作为供试品溶液；

供试品溶液进行高效液相色谱分析，得到色谱峰面积，根据色谱峰面积和浓度-峰面积标准曲线，计算出灵芝β-葡聚糖提取物中β-葡聚糖的含量。

优选的，所述灵芝β-葡聚糖提取物为上述提取方法得到的灵芝β-葡聚糖提取物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明方法采用溶剂-胰酶预处理，结合超声辅助碱水热提取灵芝中的β-葡聚糖，本发明综合了超声提取，碱水热提的优势，以获得更高的提取率，因此提取效率高，产品纯度高，方法简便。

本发明以葡萄糖为标准品，建立高压-酸酶水解-HPLC法检测制备的灵芝β-葡聚糖提取物，该酶的水解模式是与底物结合后从β-葡聚糖的非还原性末端开始依次切开底物的葡萄糖糖苷键，释放单一的葡萄糖。检测方法即HPLC法，其原理为同一时刻进入色谱柱的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解，吸附，渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱两相之间进行反复多次的分配。由于各组分在色谱柱中的移动速度不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来。按顺序流出色谱柱，进入信号检测器，在记录仪上或数据处理装置上显示出各组分的谱峰数值。根据保留时间对照定性，依据峰面积用外标法定量，本发明简便快速、灵敏准确，应用前景广阔，为具有多种生物活性的灵芝β-葡聚糖的测定提供了一种有效可靠的分析方法。

附图说明

图1为葡萄糖对照品色谱图

图2为葡萄糖标准曲线图

图3为实施例1灵芝β-葡聚糖样品色谱图

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。

本发明一种高含量灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法及其高效快速检测方法，是采用乙醇-胰酶预处理结合超声辅助碱水热提取灵芝中的β-葡聚糖，用DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝胶柱层析纯化，并通过高压-酸酶水解-HPLC方法测定制备的灵芝β-葡聚糖提取物中β-葡聚糖的含量。经过方法学考察，该方法检测灵敏度高，稳定性好，重现性好，检测的准确度高。

具体制备方法如下：

S1.乙醇-胰酶预处理灵芝子实体

称取灵芝子实体，粉碎过筛，置于具塞试管中，加入一定浓度的乙醇溶液，置于涡旋混合器上混合，再加入胰酶，酶解0.5～2h，以去除子实体中的油脂、色素、蛋白等杂质。离心，过滤，弃去滤液，得灵芝子实体滤渣。

S2.碱水热提取灵芝粗多糖

将灵芝子实体滤渣置于圆底烧瓶中，加NaOH溶液，置于超声清洗器中，温度60～80℃，超声。超声完毕，离心，过滤，所得滤渣重复以上步骤，再碱水热提一次，离心，过滤，合并两次提取所得滤液。用盐酸溶液调pH值至中性。将所得中性提取液置于旋转蒸发仪真空减压浓缩至原体积1/4。

S3.醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物

在S2所得浓缩液中加入2～5倍体积的90％乙醇溶液，室温下放置8～12h醇析，离心，过滤，弃去上清液，收集沉淀冷冻干燥，得灵芝β-葡聚糖粗提物。

S4.灵芝β-葡聚糖的纯化

取上述灵芝β-葡聚糖粗提物，加入一定量的蒸馏水溶解，离心取上清液，以0.1mol/L NaOH溶液作为流动相，于DEAE Sephadex A-25葡萄糖凝胶柱层析纯化，收集含有β-葡聚糖的组分，浓缩，冷冻干燥，得高含量、高纯度灵芝β-葡聚糖。

具体检测方法如下：

S1.标准品溶液的配制

取葡萄糖标准品，精密称定，加高纯水制成标准品储备溶液。

S2.供试品溶液的制备

精密称取灵芝β-葡聚糖，置于具塞试管中，加入一定量的盐酸，置于漩涡混合器上混匀。将试管置于恒温水浴锅中水浴20～40min，每隔一段时间放置于混合器混合一定时间，以确保所有的β-葡聚糖溶解。然后将混合均匀的样品转移到Schott瓶中，加高纯水，振荡摇匀后将Schott瓶放入高压灭菌锅中水解。水解后，取出，冷却至室温，加KOH溶液调节pH值至6～7。

将高压水解液转移至容量瓶中，用0.2mol/L pH 5.2醋酸钠缓冲液洗涤试管，并合并于容量瓶中，定容、过滤。取滤液，加一定量用0.2mol/L pH 5.2醋酸钠缓冲液稀释的β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶液，置于混合器上混匀，40℃反应1～2h，将得到的酶解液转移至容量瓶中定容，得供试品溶液。

S3.标准曲线的绘制

分别取S1中所得的标准品储备液1.0、2.0、4.0、5.0、10.0mL置于25mL容量瓶中，用高纯水定容至刻度线，得浓度为20、40、80、100、200μg/mL的标准品溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，依次准确吸取滤液20μL注入高效液相色谱仪，进行标准曲线的绘制。

S4.样品含量测定

将S2中供试品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，后准确吸取滤液20μL注入高效液相色谱仪，洗脱结束后，根据浓度-峰面积标准曲线，计算出灵芝中β-葡聚糖的含量和提取率。

上述S2与S3的高效液相色谱条件为：

色谱柱：Shodex SH1011色谱柱(8.0mm×300mm,6μm)

流动相：高纯水

流速：0.5mL/min

柱温：80℃

示差折光检测器温度：35℃

进样量：20μL

方法学考察

(1)精密度试验

按上述方法，制备浓度为60μg/mL的葡萄糖标准品溶液。在相同条件下，将已知浓度的葡萄糖标准品溶液重复进样6次，测得其保留时间和峰面积，并计算RSD值(应小于3％)，考察仪器的精密度。

(2)重复性试验

将上述过程所得的供试品溶液，在相同条件下，重复进样6次，测得保留时间和峰面积，并计算RSD值(应小于3％)，考察仪器的重复性。

(3)稳定性试验

将上述过程所制备的供试品溶液，放置0，2，4，8，12h和24h后按上述色谱条件进样，检验样品的稳定性。

(4)回收试验

分别取标准储备液0.16mL,0.20mL,0.24mL置于2mL容量瓶中高纯水定容，得3个浓度分别为40μg/mL，50μg/mL，60μg/mL的葡萄糖标准溶液。将3个不同浓度的葡萄糖标准溶液分别加入已知浓度供试品溶液，在相同条件下，进样测定，每个浓度平行测定3次。

本发明所用仪器如下：

岛津-LabSolutions(日本岛津LC-16)；RID-20A示差折光检测器(日本岛津)；BSA224S万分之一电子天平(赛多利斯(上海)贸易有限公司)；ES1035A十万分之一电子天平(天津市德安特传感技术有限公司)；GL2202-1SCN百分之一电子天平(赛多利斯(上海)贸易有限公司)；KQ-300DE超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)；RV-S旋转蒸发仪(无锡星海王生化设备有限公司)；JC-XW-I旋涡混合器(青岛聚创世纪环保科技有限公司)；LS-75HD高压灭菌锅(江阴滨江)；YB-2000A粉碎机(永康市速锋工贸有限公司)；SJIA-10N冻干机(宁波市双嘉仪器有限公司)。

本发明所用试剂与材料如下：

食品级胰酶(纯度99％，浙江福轩生物科技有限公司)；DEAE–Sephadex A-25(纯度99％，上海泽叶生物科技有限公司)；葡萄糖标准品(纯度为HPLC≥99.6％，中国计量科学研究院)；灵芝多糖(纯度GC≥95％，中国计量科学研究院)；高纯水：实验室自制；醋酸钠缓冲液(3mol/L，pH5.2,无菌，雷根生物)；β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶(BR，谱析(上海)生物科技有限公司)。

实施例1

灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法的具体制备步骤如下：

1.乙醇-胰酶预处理灵芝子实体

称取灵芝子实体10g，粉碎过50目筛，置于具塞试管中，加入80％的乙醇溶液15mL，置于涡旋混合器上混合20min，再加入胰酶1g，酶解1h，以去除子实体中的油脂、色素、蛋白等杂质。在5000r/min条件下离心20min，过滤，弃去滤液，得灵芝子实体滤渣。

2.碱水热提取灵芝粗多糖

将灵芝子实体滤渣置于100mL圆底烧瓶中，加20mL NaOH溶液(0.1mol/mL)，置于超声清洗器中，频率380W，温度70℃，超声40min。超声完毕，在5000r/min条件下离心20min，过滤，所得滤渣重复以上步骤，再碱水热提一次，离心，过滤，合并两次提取所得滤液。用盐酸溶液(0.2mol/mL)调pH值至中性。将所得中性提取液置于旋转蒸发仪真空减压浓缩至原体积1/4。

3.醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物

在步骤2所得提取液中加入3倍体积的90％乙醇溶液，室温下放置10h醇析，在5000r/min条件下离心20min，过滤，弃去上清液，收集沉淀冷冻干燥，得灵芝β-葡聚糖粗提物。

4.灵芝β-葡聚糖的纯化

取上述固体，加入50ml的蒸馏水溶解，离心取上清液，以0.1mol/L NaOH溶液作为流动相，于DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝胶柱层析纯化，收集含有β-葡聚糖的组分，浓缩，冷冻干燥，得高含量、高纯度灵芝β-葡聚糖提取物。

检测灵芝β-葡聚糖提取物的方法的具体检测步骤如下：

1.标准品溶液的配制

取葡萄糖标准品，精密称定，加高纯水制成每1mL含500μg的溶液，即得标准品储备溶液。

2.供试品溶液的制备

精密称取灵芝β-葡聚糖1.0000g，置于50mL具塞试管中，加入1ml的盐酸，置于漩涡混合器上混匀。将试管置于40℃恒温水浴锅中水浴30min，每隔10min放置于混合器混合15s，以确保所有的β-葡聚糖溶解。然后将混合均匀的样品转移到100mL Schott瓶中，高纯水加至40mL，振荡摇匀后将Schott瓶放入121℃高压灭菌锅中水解60min。水解后，取出，冷却至室温，加KOH溶液(2mol/L)调节pH值至7。

将高压水解液转移至50mL容量瓶中，用0.2mol/L pH 5.0醋酸钠缓冲液洗涤试管，并合并于容量瓶中，定容、过滤。取0.1mL滤液，加5ml用0.2mol/L pH 5.0醋酸钠缓冲液稀释的β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶液，置于混合器上混匀，40℃反应1.5h，将得到的酶解液转移至50mL的容量瓶中定容，得供试品溶液。

3.标准曲线的绘制

分别取步骤1中所得的标准品储备液1.0、2.0、4.0、5.0、10.0mL置于25mL容量瓶中，并用高纯水定容至刻度线，得浓度为20、40、80、100、200μg/mL的标准品溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，依次准确吸取滤液20μL注入高效液相色谱仪，得到的HPLC色谱图如图1，测得系列浓度标准品的峰面积见表1：

表1 葡萄糖标准品浓度峰面积

根据表1，以浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得到标准曲线，见图2。其葡萄糖标准曲线方程为Y＝13099X+28469，其相关系数R²＝0.9998，具有良好的线性关系。

4.样品含量测定

步骤2中供试品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，后准确吸取滤液20μL注入高效液相色谱仪进行洗脱，得色谱图3。根据浓度-峰面积标准曲线，计算出1g样品中β-葡聚糖的含量为0.918g，计算得提取产率为91.8％。

方法学考察：

(1)精密度试验

按上述方法，制备浓度为60μg/mL的葡萄糖标准品溶液。在相同条件下，将已知浓度葡萄糖标准品溶液重复进样6次，测得其保留时间和峰面积并计算RSD值，见表2。计算RSD值均小于3％，结果表明该设备平行进样精密度良好。

表2 精密度研究保留时间和峰面积

(2)重复性试验

将上述过程所得的供试品溶液，在相同条件下，重复进样6次，分析测得的保留时间和峰面积并计算RSD值，见表3。计算RSD值均小于3％，结果表明该方法重现性良好。

表3 重复性研究保留时间和峰面积

(3)稳定性试验

将上述过程所制备的供试品溶液，放置0，2，4，8，12h和24h后按上述色谱条件进样，分析测得的保留时间和峰面积并计算RSD值，见表4。计RSD值均小于3％，表明灵芝多糖样品溶液在室温下24h内具有良好的稳定性。

表4 稳定性研究保留时间和峰面积

(4)回收试验

分别取标准储备液0.16mL,0.2mL,0.24mL置于2mL容量瓶中高纯水定容，得3个浓度分别为40μg/mL，50μg/mL，60μg/mL的葡萄糖标准溶液。将3个不同浓度的葡萄糖标准溶液分别加入已知浓度的供试品溶液，在相同条件下，进样测定，每个浓度平行测定3次。分析测得的保留时间和峰面积并计算RSD值，结果见表5。计算RSD值均小于3％。其中加样回收率在98.7％～104.525％之间，表明该方法准确性良好。

表5 加样回收率

实施例2

灵芝子实体预处理条件的优化比较，按以下方法进行。

1.预处理灵芝子实体

称取灵芝子实体10g，粉碎过50目筛，置于具塞试管中，分别加入80％的乙醇、甲醇、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液15mL，置于涡旋混合器上混合20min，再加入胰酶1g，酶解1h，以去除子实体中的油脂、色素、蛋白等杂质。在5000r/min条件下离心20min，过滤，弃去滤液，得灵芝子实体滤渣。

2.碱水热提取灵芝粗多糖

碱水热提取灵芝粗多糖制备方法同上述实施例1具体制备步骤。

3.醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物

醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

4.灵芝β-葡聚糖的纯化

灵芝β-葡聚糖的纯化操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

5.供试品溶液的制备

按上述实施例1具体检测步骤处理纯化的β-葡聚糖，得3个供试品溶液。

6.样品含量测定

将步骤5中3个供试品溶液分别用0.45μm微孔滤膜过滤，后准确吸取滤液20μL注入高效液相色谱仪进行洗脱。根据浓度-峰面积标准曲线，将所得峰面积换算为浓度，结果见表6：

表6 灵芝子实体预处理条件的优化

结果表明，使用乙醇结合胰酶预处理灵芝子实体提取灵芝β-葡聚糖效率更高。因此，选用乙醇作为预处理得试剂。

实施例3

碱水热提取灵芝粗多糖中提取温度的比较，按以下方法进行。

1.乙醇-胰酶预处理灵芝子实体

乙醇-胰酶预处理灵芝子实体操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

2.碱水热提取灵芝粗多糖

将灵芝子实体滤渣置于100mL圆底烧瓶中，加20mL NaOH溶液(0.1mol/mL)，置于超声清洗器中，频率380W，温度分别为60℃、70℃、80℃，超声40min。超声完毕，在5000r/min条件下离心20min，过滤，所得滤渣重复以上步骤，再碱水热提一次，离心，过滤，合并两次提取所得滤液。用盐酸溶液(0.2mol/mL)调pH至中性。将所得中性提取液置于旋转蒸发仪真空减压浓缩至原体积1/4。

3.醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物

醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

4.灵芝β-葡聚糖的纯化

灵芝β-葡聚糖的纯化操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

5.供试品溶液的制备

按上述实施例1具体检测步骤处理纯化的β-葡聚糖，得3个供试品溶液。

6.样品含量测定

将步骤5中3个供试品溶液分别用0.45μm微孔滤膜过滤，后准确吸取滤液20μL注入高效液相色谱仪进行洗脱。根据浓度-峰面积标准曲线，将所得峰面积换算为浓度，结果见表7：

表7 不同温度提取灵芝β-葡聚糖的含量

结果表明，超声辅助碱水热提取灵芝粗多糖中所用超声温度为70℃时，制备灵芝β-葡聚糖效率更高。因此，选用70℃作为超声温度。

实施例4

碱水热提取灵芝粗多糖中用不同碱水浓度的比较，按以下方法进行。

1.乙醇-胰酶预处理灵芝子实体

乙醇-胰酶预处理灵芝子实体操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

2.碱水热提取灵芝粗多糖

将灵芝子实体滤渣置于100mL圆底烧瓶中，分别加20mL0.01mol/mLNaOH溶液、0.1mol/mLNaOH溶液、1mol/mLNaOH溶液置于超声清洗器中，频率380W，温度分别为60～80℃，超声40min。超声完毕，在5000r/min条件下离心20min，过滤，所得滤渣重复以上步骤，再碱水热提一次，离心，过滤，合并两次提取所得滤液。用盐酸溶液(0.2mol/mL)调pH至中性。将所得中性提取液置于旋转蒸发仪真空减压浓缩至原体积1/4。

3.醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物

醇析得灵芝β-葡聚糖粗提物操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

4.灵芝β-葡聚糖的纯化

灵芝β-葡聚糖的纯化操作方法同上述实施例1具体制备步骤。

5.供试品溶液的制备

按上述实施例1具体检测步骤处理纯化的β-葡聚糖，得3个供试品溶液。

6.样品含量测定

将步骤5中3个供试品溶液分别用0.45μm微孔滤膜过滤，后准确吸取滤液20μL注入高效液相色谱仪进行洗脱。根据浓度-峰面积标准曲线，将所得峰面积换算为浓度，结果见表8：

表8 不同碱水浓度提取灵芝β-葡聚糖的含量

结果表明，超声辅助碱水热提取灵芝粗多糖中所用NaOH溶液浓度为0.1mol/mL时，制备灵芝β-葡聚糖效率更高。因此，选用0.1mol/mLNaOH溶液作为提取液。

Claims (10)

1.一种灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于，包括：

S1.将灵芝子实体粉碎后与溶剂混合，再加入胰酶，酶解0.5～2h，分离得灵芝子实体滤渣；

S2.将灵芝子实体滤渣与碱溶液混合，在加热条件下超声提取，所得滤液调pH值至中性并浓缩，得灵芝粗多糖；

S3.将灵芝粗多糖进行醇析，分离所得沉淀并冷冻干燥，得灵芝β-葡聚糖粗提物；

S4.灵芝β-葡聚糖粗提物采用葡萄糖凝胶柱层析纯化，得到灵芝β-葡聚糖提取物。

2.根据权利要求1所述的灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于，S1中，所述溶剂为乙醇溶液、甲醇溶液或N，N-二甲基甲酰胺溶液。

3.根据权利要求1所述的灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于，S1中，所述溶剂为乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于，S2中，加热温度为60～80℃。

5.根据权利要求1所述的灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于，S2中，所述碱溶液为氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液的浓度为0.01～1mol/mL。

6.根据权利要求1所述的灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于，S3具体为：将灵芝粗多糖加入2～5倍体积的90％乙醇溶液中，室温下放置8～12h醇析，收集沉淀并冷冻干燥，得灵芝β-葡聚糖粗提物。

7.根据权利要求1所述的灵芝β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于，S4中，以0.1mol/L NaOH溶液作为流动相进行层析纯化。

8.采用权利要求1～7任一项所述的制备方法得到灵芝β-葡聚糖提取物。

9.一种灵芝β-葡聚糖提取物的检测方法，其特征在于，包括：

采用葡萄糖标准品制备不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液进行高效液相色谱分析，得到色谱峰面积，根据标准品溶液的浓度和色谱峰面积绘制出浓度-峰面积标准曲线；

取灵芝β-葡聚糖提取物，溶于盐酸中，加水加压进行水解，所得水解液冷却后，加KOH溶液调节pH值至6～7；加入用0.2mol/L pH 5.2醋酸钠缓冲液稀释的β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶液，混匀，酶解反应1～2h，将得到的酶解液作为供试品溶液；

供试品溶液进行高效液相色谱分析，得到色谱峰面积，根据色谱峰面积和浓度-峰面积标准曲线，计算出灵芝β-葡聚糖提取物中β-葡聚糖的含量。

10.根据权利要求9所述的灵芝β-葡聚糖提取物的检测方法，其特征在于，所述灵芝β-葡聚糖提取物为权利要求8所述的灵芝β-葡聚糖提取物。

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