JP2024060613A - 霊芝β－グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明は、霊芝β－グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法を提供する。【解決手段】この調製方法は、Ｓ１．霊芝実物を粉砕して溶媒と混合した後、トリプシンを加えて０．５～２ｈ酵素消化し、分離して霊芝実物残渣を得る工程と、Ｓ２．霊芝実物残渣をアルカリ水溶液と混合し、加熱条件下で超音波抽出し、得られたろ液のｐＨ値を中性に調整して濃縮して霊芝粗製多糖を得る工程と、Ｓ３．霊芝粗製多糖をアルコール分解し、得られた沈殿物を分離、凍結乾燥して霊芝β－グルカン粗抽出物を得る工程と、Ｓ４．霊芝β－グルカン粗抽出物をグルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製して霊芝β－グルカン抽出物を得る工程と、を含む。本発明の調製方法は、簡単で、生成物の純度が高く、抽出効率が高く、検出方法が簡単で迅速であり、高感度で正確である。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬技術分野に属し、霊芝β－グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法に関する。
霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ（Ｃｕｒｔｉｓ） Ｐ．Ｋａｒｓｔ．）は、外観が傘状で、腎臓形の半円形または亜円形のキャップを有し、サルノコシカケ科植物Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｓｉｎｅｎｓｉｓとＧａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍの全草である。古来、貴重な漢方薬の一種であり、もともとはすべて野生で、主に浙江省、広西、江西、湖南省などに生育していたが、人類の栽培技術の向上により、現在は主に栽培されており、その中でも山東省の生産量は最も多い。研究が深まるにつれて、霊芝はより多くの生物活性が掘り起こされ、主に肝臓の保護と解毒、糖尿病の治療、循環器系の改善、老化の防止、免疫力の強化などに使用されている。
霊芝多糖類は霊芝の最も有効な成分の一つで、霊芝の胞子または霊芝実物から抽出され、現在、２００種類の霊芝多糖類が分離されており、そのほとんどはβ－グルカンであり、少数はα－グルカンである。β－グルカンは霊芝多糖類の中で最も活性の高い成分であり、免疫調節作用、抗腫瘍作用、抗胆汁炎作用、抗菌作用、抗ウイルス作用など様々な作用があることから、その調製・分離方法を検討し、定量的な検出により分析することは医学的に大きな意義がある。
現在、霊芝β－グルカンの調製には、熱水抽出法、超音波抽出法、マイクロ波抽出法などの方法が主に用いられているが、抽出効率が低く、抽出時間が長く、生成物に不純物が多いため、高含有量の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法が急務となっている。
本発明の目的は、調製方法が簡単で、生成物の純度が高く、抽出効率が高く、検出方法が簡単で迅速であり、高感度で正確である、霊芝β－グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法を提供することである。
本発明は以下の技術的解決策によって達成される。
霊芝β－グルカン抽出物の調製方法は、
Ｓ１．霊芝実物（ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ）を粉砕して溶媒と混合した後、トリプシンを加えて、０．５～２ｈ酵素消化し、分離して霊芝実物残渣を得る工程と、
Ｓ２．霊芝実物残渣をアルカリ水溶液と混合し、加熱条件下で超音波抽出し、得られたろ液のｐＨ値を中性に調整して濃縮して霊芝粗製多糖を得る工程と、
Ｓ３．霊芝粗製多糖をアルコール分解（ａｌｃｏｈｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）し、得られた沈殿物を分離、凍結乾燥して霊芝β－グルカン粗抽出物を得る工程と、
Ｓ４．霊芝β－グルカン粗抽出物をグルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製して霊芝β－グルカン抽出物を得る工程と、を含む。
好ましくは、Ｓ１において、前記溶媒は、エタノール溶液であり、メタノール溶液またはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液である。
好ましくは、Ｓ１において、前記溶媒は、エタノール溶液である。
好ましくは、Ｓ２において、加熱温度は６０～８０℃である。
好ましくは、Ｓ２において、前記アルカリ水溶液は水酸化ナトリウム溶液であり、水酸化ナトリウム溶液の濃度は０．０１～１ｍｏｌ／ｍＬである。
好ましくは、Ｓ３は、具体的に、霊芝粗製多糖を２～５倍体積の９０％エタノール溶液に加え、室温下で８～１２ｈ放置してアルコール分解し、沈殿物を収集、冷凍乾燥して霊芝β－グルカン粗抽出物を得ることである。
好ましくは、Ｓ４において、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を移動相としてクロマトグラフィー精製を行う。
前記の調製方法によって霊芝β－グルカン抽出物を得る。
霊芝β－グルカン抽出物の検出方法は、
グルコース標準品を用いて異なる濃度の標準液を調製し、異なる濃度の標準液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、標準液の濃度とクロマトグラフィーピーク面積に基づいて濃度－ピーク面積標準曲線をプロットする工程と、
霊芝β－グルカン抽出物を塩酸に溶解し、加圧下で加水分解し、得られた加水分解液を冷却した後、ＫＯＨ溶液を加えてｐＨ値を６～７に調整し、０．２ｍｏｌ／ＬのｐＨ５．２の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈したβ－（１，３）－グルカンエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏ－１，３－ｂｅｔａ－ｇｌｕｃａｎａｓｅ）およびβ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）溶液を加えてよく混合し、１～２ｈ酵素消化反応して得られた酵素消化液を試験液とする工程と、
試験液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、クロマトグラフィーピーク面積と濃度－ピーク面積標準曲線に基づいて、霊芝β－グルカン抽出物中のβ－グルカンの含有量を算出する工程とを含む。
好ましくは、前記霊芝β－グルカン抽出物は、上記抽出方法によって得られた霊芝β－グルカン抽出物である。
従来技術と比較すると、本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明の方法は、溶媒－トリプシン前処理を採用し、超音波とアルカリ水熱抽出を組み合わせて霊芝中のβ－グルカンを抽出し、本発明は、超音波抽出、アルカリ水熱抽出の利点を組み合わせて、より高い抽出率を得るので、抽出効率が高く、生成物の純度が高く、方法が簡単である。
本発明は、グルコースを標準品として、高圧－酸酵素加水分解－ＨＰＬＣ法により調製された霊芝β－グルカン抽出物を検出し、この酵素は、基質と結合し、β－グルカンの非還元性末端から順次基質のグルコシド結合を切断し、単一のグルコースを放出するモードで加水分解する。検出方法、すなわちＨＰＬＣ法は、移動相と固定相の間の可溶化、吸着、浸透またはイオン交換の異なる効果により、同じ瞬間にカラムに入った成分が、カラムの２相間で移動相とともに繰り返し何度も分配されるという原理に基づいている。カラム内の成分の移動速度が異なるため、カラムの一定長さが経過すると、成分は互いに分離される。成分は順にカラムから流出し、信号検出器に入り、成分のピーク値をレコーダーやデータ処理装置に表示する。外部標準法によるピーク面積定量に基づく保持時間制御定性によれば、本発明は簡単で、迅速、高感度、高精度で、応用の見込みが広く、複数の生物活性を有する霊芝β－グルカンの測定に有効で信頼性の高い分析方法を提供する。
グルコース対照品のクロマトグラムである。 グルコース標準曲線図である。 実施例１の霊芝β－グルカンのサンプルのクロマトグラムである。
本発明をさらに理解するために、以下、実施例に関連して本発明を説明するが、これらの説明は、本発明の特徴および利点をさらに説明するために使用され、本発明の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明の高い含有量の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法およびその効率的かつ迅速な検出方法は、エタノール－トリプシン前処理と超音波補助アルカリ水熱を組み合わせて霊芝中のβ－グルカンを抽出し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５グルカンゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、高圧－酸酵素加水分解－ＨＰＬＣ方法により調製された霊芝β－グルカン抽出物中のβ－グルカンの含有量を測定するものである。方法論的検討の結果、この方法は、検出感度が高く、安定性、再現性、検出精度が高いことが分かった。
具体的な調製方法は以下のとおりである。
Ｓ１．霊芝実物のエタノール－トリプシン前処理
霊芝実物を秤量し、粉砕、ふるい分けて、栓付き試験管に入れ、一定濃度のエタノール溶液を加え、ボルテックスミキサーにかけて混合した後、トリプシンを加えて、０．５～２ｈ酵素消化し、霊芝実物中の油脂、色素、タンパク質などの不純物を除去する。遠心分離、濾過し、ろ液を捨て、霊芝実物残渣を得る。
Ｓ２．霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を丸底フラスコに入れ、ＮａＯＨ溶液を加え、超音波洗浄器に放置し、温度６０～８０℃で超音波をかける。超音波処理後、遠心分離、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、１回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離、濾過し、２回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液でｐＨ値を中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターで原液体積の１／４に真空減圧濃縮する。
Ｓ３．アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得
Ｓ２で得られた濃縮液に２～５倍体積の９０％エタノール溶液を加え、室温で８～１２ｈ放置してアルコール分解し、遠心分離、濾過し、上清を捨て、沈殿物を収集し、冷凍乾燥して霊芝β－グルカン粗抽出物を得る。
Ｓ４．霊芝β－グルカンの精製
上記霊芝β－グルカン粗抽出物を取り、一定量の蒸留水を加えて溶解し、遠心分離して上清を得、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を移動相としてＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５グルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、β－グルカン含有の成分を収集し、濃縮、冷凍乾燥して高い含有量、高純度の霊芝β－グルカンを得る。
具体的な検出方法は以下のとおりである。
Ｓ１．標準液の調製
グルコース標準品を正確に秤量し、高純度水を加えて標準予備溶液とする。
Ｓ２．試験液の調製
霊芝β－グルカンを正確に秤量し、栓付き試験管に入れ、一定量の塩酸を加え、ボルテックスミキサーにかけて良く混合する。試験管を恒温水槽に入れ２０～４０ｍｉｎ水浴し、一定時間ごとにミキサーにかけて混合し、β－グルカンがすべて溶解したことを確認した。その後、良く混合されたサンプルをＳｃｈｏｔｔ瓶に移し、高純度水を加えて、よく振り混ぜた後Ｓｃｈｏｔｔ瓶をオートクレーブに入れて加水分解する。加水分解後、取り出し、室温まで冷却し、ＫＯＨ溶液を加えてｐＨ値を６～７に調整する。
高圧加水分解液をメスフラスコに移し、０．２ｍｏｌ／ＬのｐＨ５．２の酢酸ナトリウム緩衝液で試験管を洗浄し、メスフラスコに合わせて、定量、濾過する。ろ液を取り、０．２ｍｏｌ／ＬのｐＨ５．２の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈した一定量β－（１，３）－グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ－グルコシダーゼ溶液を加え、ミキサーにかけて良く混合し、４０℃で１～２ｈ反応させ、得られた酵素消化液をメスフラスコに移し、定量して試験液を得る。
Ｓ３．標準曲線の描き
Ｓ１で得られた標準予備液をそれぞれ１．０、２．０、４．０、５．０、１０．０ｍＬを取り、２５ｍＬのメスフラスコに入れ、高純度水で目盛線まで定量し、濃度２０、４０、８０、１００、２００μｇ／ｍＬの標準液を得、０．４５μｍの微多孔膜で濾過し、ろ液を高速液体クロマトグラフィーに２０μＬずつ正確に吸引し、標準曲線を描く。
Ｓ４．サンプル含有量の測定
Ｓ２中の試験液を０．４５μｍの微多孔膜で濾過した後、ろ液を高速液体クロマトグラフィーに２０μＬずつ正確に吸引し、溶出後、濃度－ピーク面積標準曲線から、霊芝中のβ－グルカンの含有量および抽出率を算出する。
上記Ｓ２とＳ３の高速液体クロマトグラフィー条件は以下のとおりである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ１０１１カラム（８．０ｍｍ×３００ｍｍ，６μｍ）
移動相：高純度水
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：８０℃
オシロメトリック屈折検出器温度：３５℃
サンプル注入量：２０μＬ
方法論的検討
（１）精度試験
上記方法に従い、濃度６０μｇ／ｍＬのグルコース標準液を調製する。同一条件下で、濃度既知のグルコース標準液の注入を６回繰り返し、保持時間とピーク面積を測定し、ＲＳＤ値（３％未満）を算出し、装置の精度を調べる。
（２）再現性試験
上記操作で得られた試験液を、同一条件下で６回注入し、保持時間とピーク面積を測定し、ＲＳＤ値（３％未満）を算出し、装置の再現性を調べる。
（３）安定性試験
上記操作で調製された試験液を、０、２、４、８、１２ｈおよび２４ｈ静置した後、上記クロマトグラム条件に従い注入し、サンプルの安定性を調べる。
（４）回収試験
標準予備液をそれぞれ０．１６ｍＬ、０．２０ｍＬ、０．２４ｍＬを取り、２ｍＬメスフラスコに入れて高純度水で定量し、３つの濃度４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬのグルコース標準液を得る。３つの異なる濃度のグルコース標準液をそれぞれ濃度既知の試験液に加え、同一条件下で注入測定し、各濃度を並行して３回測定する。
本発明で使用した装置は以下のとおりである。
島津－ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（日本島津ＬＣ－１６）、ＲＩＤ－２０Ａオシロメトリック屈折検出器（日本島津）、ＢＳＡ２２４Ｓ １万分の１ 電子天秤（ザルトリウス（上海）貿易有限公司）、ＥＳ１０３５Ａ １万分の１ 電子天秤（天津市徳安特センシング技術有限公司）、ＧＬ２２０２－１ＳＣＮ １００分の１電子天秤（ザルトリウス（上海）貿易有限公司）、ＫＱ－３００ＤＥ 超音波洗浄器（昆山超音波装置有限公司）、ＲＶ－Ｓロータリーエバポレーター（无錫星海王生物化学設備有限公司）、ＪＣ－ＸＷ－Ｉボルテックスミキサー（青島聚創世紀環境保護科学技術有限公司）、ＬＳ－７５ＨＤオートクレーブ（江陰濱江）、ＹＢ－２０００Ａ粉砕機（永康市速鋒工業貿易有限公司）、ＳＪＩＡ－１０Ｎ凍結乾燥機（寧波市双嘉装置有限公司）。
本発明で使用した試薬と材料は以下のとおりである。
食品用トリプシン（純度９９％、浙江福軒生物科学技術有限公司）、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５（純度９９％、上海沢葉生物科学技術有限公司）、グルコース標準品（純度ＨＰＬＣ≧９９．６％、中国計量研究院）、霊芝多糖類（純度ＧＣ≧９５％、中国計量研究院）、高純度水：実験室自家製、酢酸ナトリウム緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．２，無菌、Ｒｅｇａｎ Ｂｉｏ社）、β－（１，３）－グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ－グルコシダーゼ（ＢＲ、スペクトラム分析（上海）生物科学技術有限公司）。
実施例１
霊芝β－グルカン抽出物の調製方法の具体的な調製工程は以下のとおりである。
１．霊芝実物のエタノール－トリプシン前処理
霊芝実物１０ｇを秤量し、粉砕して５０メッシュの篩にかけ、栓付き試験管に入れ、８０％のエタノール溶液１５ｍＬを加え、ボルテックスミキサーにかけて２０ｍｉｎ混合し、トリプシン１ｇを加え、１ｈ酵素消化し、霊芝実物中の油脂、色素、タンパク質などの不純物を除去する。５０００ｒ／ｍｉｎ条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、濾過し、ろ液を捨て、霊芝実物残渣を得る。
２．霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を１００ｍＬの丸底フラスコに入れ、２０ｍＬのＮａＯＨ溶液（０．１ｍｏｌ／ｍＬ）を加え、超音波洗浄器に入れ、周波数３８０Ｗ、温度７０℃で、４０ｍｉｎ超音波処理する。超音波処理後、５０００ｒ／ｍｉｎ条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、１回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離し、濾過し、２回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液（０．２ｍｏｌ／ｍＬ）でｐＨ値を中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターに入れて原液体積の１／４に真空減圧濃縮する。
３．アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得
工程２で得られた抽出液に３倍体積の９０％エタノール溶液を加え、室温で下１０ｈ静置してアルコール分解し、５０００ｒ／ｍｉｎ条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、濾過し、上清を捨て、沈殿物を収集して冷凍乾燥し、霊芝β－グルカン粗抽出物を得る。
４．霊芝β－グルカンの精製
上記固体を取り、５０ｍｌの蒸留水を加えて溶解し、遠心分離して上清を取り、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を移動相として、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５グルカンゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、β－グルカン含有の成分を収集し、濃縮し、冷凍乾燥して、高含有量、高純度の霊芝β－グルカン抽出物を得る。
霊芝β－グルカン抽出物の検出方法の具体的な検出工程は以下のとおりである。
１．標準液の調製
グルコース標準品を正確に秤量し、高純度水を加えて１ｍＬあたり５００μｇの溶液を調製し、標準品予備液を得る。
２．試験液の調製
霊芝β－グルカン１．００００ｇを正確に秤量し、５０ｍＬの栓付き試験管に入れ、１ｍｌの塩酸を加え、ボルテックスミキサーにかけて良く混合する。試験管を４０℃恒温水槽に入れて３０ｍｉｎ水浴し、１０ｍｉｎごとにミキサーにかけて１５ｓ混合し、β－グルカンがすべて溶解したことを確認する。その後、良く混合されたサンプルを１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔ瓶に移し、高純度水を４０ｍＬまで加え、よく振り混ぜた後Ｓｃｈｏｔｔ瓶を１２１℃オートクレーブに入れて６０ｍｉｎ加水分解する。加水分解後、取り出し、室温まで冷却し、ＫＯＨ溶液を加えて（２ｍｏｌ／Ｌ）、ｐＨ値を７に調整する。
高圧加水分解液を５０ｍＬのメスフラスコに移し、０．２ｍｏｌ／ＬのｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液で試験管を洗浄し、メスフラスコに合わせ、定量して濾過する。０．１ｍＬのろ液を取り、０．２ｍｏｌ／ＬのｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈した５ｍｌのβ－（１，３）－グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ－グルコシダーゼ溶液を加え、ミキサーにかけて良く混合し、４０℃で１．５ｈ反応させ、得られた酵素消化液を５０ｍＬのメスフラスコに移し、定量して試験液を得る。
３．標準曲線の描き
工程１で得られた標準予備液をそれぞれ１．０、２．０、４．０、５．０、１０．０ｍＬを取り、２５ｍＬのメスフラスコに入れ、高純度水で目盛線まで定量し、濃度２０、４０、８０、１００、２００μｇ／ｍＬの標準液を得、０．４５μｍの微多孔膜で濾過し、ろ液を高速液体クロマトグラフィーに２０μＬずつ正確に吸引し、得られたＨＰＬＣクロマトグラムは図１に示され、一連の濃度の標準品のピーク面積は表１に示され：
Figure 2024060613000001
表１によると、図２に示すように、濃度を横座標Ｘ、ピーク面積を縦座標Ｙとして標準曲線を得る。そのグルコース標準曲線方程式はＹ＝１３０９９Ｘ＋２８４６９であり、その相関係数はＲ２＝０．９９９８であり、良好な直線関係を有する。
４．サンプル含有量の測定
工程２の試験液を０．４５μｍの微多孔膜で濾過した後、ろ液２０μＬを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させ、クロマトグラム３を得る。濃度－ピーク面積標準曲線から、１ｇサンプル中のβ－グルカンの含有量が０．９１８ｇ、抽出収率が９１．８％であると算出する。
方法論的検討：
（１）精度試験
上記方法に従い、濃度６０μｇ／ｍＬのグルコース標準液を調製する。表２に示すように、同一条件下で、濃度既知のグルコース標準液の注入を６回繰り返し、その保持時間とピーク面積を測定してＲＳＤ値を算出する。ＲＳＤ値がすべて３％未満であり、本装置の並行注入の精度が良好であることが示される。
Figure 2024060613000002
（２）繰り返し試験
表３に示すように、上記工程で得られた試験液を、同一条件下で、注入を６回繰り返し、測定した保持時間とピーク面積を分析し、ＲＳＤ値を算出する。ＲＳＤ値がすべて３％未満であり、本方法の再現性が良好であることが示される。
Figure 2024060613000003
（３）安定性試験
表４に示すように、上記工程で調製された試験液を、０、２、４、８、１２ｈおよび２４ｈ静置した後、上記クロマトグラム条件に従い注入し、分析して保持時間とピーク面積を測定し、ＲＳＤ値を算出する。ＲＳＤ値がすべて３％未満であり、霊芝多糖類サンプル溶液が室温下で２４ｈ以内に良好な安定性を有することが示される。
Figure 2024060613000004
（４）回収試験
標準予備液をそれぞれ０．１６ｍＬ、０．２ｍＬ、０．２４ｍＬとり、２ｍＬのメスフラスコに入れ、高純度水で定量し、３つの濃度４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬのグルコース標準液を得る。３つの異なる濃度のグルコース標準液をそれぞれ濃度既知の試験液に加え、同一条件下で、注入して測定し、各濃度を並行して３回測定する。表５の結果に示すように、分析して保持時間とピーク面積を測定し、ＲＳＤ値を算出する。ＲＳＤ値がすべて３％未満であると算出する。注入回収率が９８．７％～１０４．５２５％であり、本方法の精度が良好であることが示される。
Figure 2024060613000005
実施例２
霊芝実物の前処理条件の最適化と比較は、以下のように行われる。
１．霊芝実物の前処理
霊芝実物１０ｇを秤量し、粉砕して５０メッシュの篩にかけ、栓付き試験管に入れ、それぞれ８０％のエタノール、メタノール、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）溶液１５ｍＬを加え、ボルテックスミキサーにかけて２０ｍｉｎ混合し、その後、トリプシン１ｇを加え、１ｈ酵素消化し、霊芝実物中の油脂、色素、タンパク質などの不純物を除去する。５０００ｒ／ｍｉｎ条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、濾過し、ろ液を捨て、霊芝実物残渣を得る。
２．霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
アルカリ水熱抽出による霊芝粗製多糖の調製方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
３．アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得
アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得の操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
４．霊芝β－グルカンの精製
霊芝β－グルカンの精製操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
５．試験液の調製
上記実施例１の具体的な検出工程に従い、精製したβ－グルカンを処理して３つの試験液を得る。
６．サンプル含有量の測定
工程５中の３つの試験液をそれぞれ０．４５μｍの微多孔膜で濾過した後、ろ液２０μＬを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させる。濃度－ピーク面積標準曲線から、得られたピーク面積を濃度に換算し、結果が表６に示され：
Figure 2024060613000006
結果から分かるように、トリプシン前処理にエタノールを併用すると、霊芝実物からの霊芝β－グルカンの抽出効率がより高い。したがって、エタノールを前処理試薬として選択する。
実施例３
霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出における抽出温度の比較は、以下のように行われる。
１．霊芝実物のエタノール－トリプシン前処理
エタノール－トリプシン前処理による霊芝実物の操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
２．霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を１００ｍＬの丸底フラスコに入れ、２０ｍＬのＮａＯＨ溶液（０．１ｍｏｌ／ｍＬ）を加え、超音波洗浄器に入れ、周波数３８０Ｗ、温度６０℃、７０℃、８０℃で、４０ｍｉｎ超音波処理する。超音波処理後、５０００ｒ／ｍｉｎ条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、１回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離し、濾過し、２回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液（０．２ｍｏｌ／ｍＬ）でｐＨを中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターに入れて原液体積の１／４に真空減圧濃縮する。
３．アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得
アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得の操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
４．霊芝β－グルカンの精製
霊芝β－グルカンの精製操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
５．試験液の調製
上記実施例１の具体的な検出工程に従い、精製したβ－グルカンを処理して３つの試験液を得る。
６．サンプル含有量の測定
工程５中の３つの試験液をそれぞれ０．４５μｍの微多孔膜で濾過した後、ろ液２０μＬを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させる。濃度－ピーク面積標準曲線から、得られたピーク面積を濃度に換算し、結果が表７に示され：
Figure 2024060613000007
結果から分かるように、霊芝粗製多糖の超音波補助アルカリ水熱抽出において使用した超音波温度は７０℃である場合、霊芝β－グルカンの調製効率がより高い。したがって、７０℃を超音波温度として選択する。
実施例４
霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出において使用した異なるアルカリ水濃度の比較は、以下のように行われる。
１．霊芝実物のエタノール－トリプシン前処理
霊芝実物のエタノール－トリプシン前処理の操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
２．霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を１００ｍＬの丸底フラスコに入れ、それぞれ２０ｍＬの０．０１ｍｏｌ／ｍＬＮａＯＨ溶液、０．１ｍｏｌ／ｍＬＮａＯＨ溶液、１ｍｏｌ／ｍＬＮａＯＨ溶液を加えて超音波洗浄器に入れ、周波数３８０Ｗ、温度６０～８０℃で、４０ｍｉｎ超音波処理する。超音波処理後、５０００ｒ／ｍｉｎ条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、１回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離し、濾過し、２回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液（０．２ｍｏｌ／ｍＬ）でｐＨを中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターに入れて原液体積の１／４に真空減圧濃縮する。
３．アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得
アルコール分解による霊芝β－グルカン粗抽出物の取得の操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
４．霊芝β－グルカンの精製
霊芝β－グルカンの精製操作方法は、上記実施例１の具体的な調製工程と同様である。
５．試験液の調製
上記実施例１の具体的な検出工程に従い、精製したβ－グルカンを処理して３つの試験液を得る。
６．サンプル含有量の測定
工程５中の３つの試験液をそれぞれ０．４５μｍの微多孔膜で濾過した後、ろ液２０μＬを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させる。濃度－ピーク面積標準曲線から、得られたピーク面積を濃度に換算し、結果が表８に示され：
Figure 2024060613000008
結果から分かるように、霊芝粗製多糖の超音波補助アルカリ水熱抽出において使用したＮａＯＨ溶液濃度が０．１ｍｏｌ／ｍＬである場合、霊芝β－グルカンの調製効率がより高い。したがって、０．１ｍｏｌ／ｍＬＮａＯＨ溶液を抽出液として選択する。

Claims (10)

  1. Ｓ１．霊芝実物を粉砕して溶媒と混合した後、トリプシンを加えて、０．５～２ｈ酵素消化し、分離して霊芝実物残渣を得る工程と、
    Ｓ２．霊芝実物残渣をアルカリ水溶液と混合し、加熱条件下で超音波抽出し、得られたろ液のｐＨ値を中性に調整して濃縮して霊芝粗製多糖を得る工程と、
    Ｓ３．霊芝粗製多糖をアルコール分解し、得られた沈殿物を分離、凍結乾燥して霊芝β－グルカン粗抽出物を得る工程と、
    Ｓ４．霊芝β－グルカン粗抽出物をグルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製して霊芝β－グルカン抽出物を得る工程と、を含む、ことを特徴とする霊芝β－グルカン抽出物的調製方法。
  2. Ｓ１において、前記溶媒は、エタノール溶液、メタノール溶液またはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液である、ことを特徴とする請求項１に記載の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法。
  3. Ｓ１において、前記溶媒は、エタノール溶液である、ことを特徴とする請求項１に記載の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法。
  4. Ｓ２において、加熱温度は６０～８０℃である、ことを特徴とする請求項１に記載の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法。
  5. Ｓ２において、前記アルカリ水溶液は水酸化ナトリウム溶液であり、水酸化ナトリウム溶液の濃度は０．０１～１ｍｏｌ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法。
  6. Ｓ３は、具体的に、霊芝粗製多糖を２～５倍体積の９０％エタノール溶液に加え、室温下で８～１２ｈ放置してアルコール分解し、沈殿物を収集、冷凍乾燥して霊芝β－グルカン粗抽出物を得ることである、ことを特徴とする請求項１に記載の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法。
  7. Ｓ４において、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を移動相としてクロマトグラフィー精製を行う、ことを特徴とする請求項１に記載の霊芝β－グルカン抽出物の調製方法。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の調製方法により得られた霊芝β－グルカン抽出物。
  9. グルコース標準品を用いて異なる濃度の標準液を調製し、異なる濃度の標準液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、標準液の濃度とクロマトグラフィーピーク面積に基づいて濃度－ピーク面積標準曲線をプロットすることと、
    霊芝β－グルカン抽出物を塩酸に溶解し、加圧下で加水分解し、得られた加水分解液を冷却した後、ＫＯＨ溶液を加えてｐＨ値を６～７に調整し、０．２ｍｏｌ／ＬのｐＨ５．２の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈したβ－（１，３）－グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ－グルコシダーゼ溶液を加えてよく混合し、１～２ｈ酵素消化反応し、得られた酵素消化液を試験液とすることと、
    試験液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、クロマトグラフィーピーク面積と濃度－ピーク面積標準曲線に基づいて、霊芝β－グルカン抽出物中のβ－グルカンの含有量を算出することと、を含む、ことを特徴とする霊芝β－グルカン抽出物の検出方法。
  10. 前記霊芝β－グルカン抽出物は、請求項８に記載の霊芝β－グルカン抽出物である、ことを特徴とする請求項９に記載の霊芝β－グルカン抽出物の検出方法。
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CN105039459B (zh) * 2015-07-30 2018-07-17 中南林业科技大学 一种乙醇-酶体系预处理结合水提法提取灵芝子实体中β-葡聚糖的方法
CN105418781A (zh) * 2015-11-23 2016-03-23 宁国千方中药发展有限公司 一种灵芝多糖的超声波抽提方法
CN108976314A (zh) * 2018-05-07 2018-12-11 中国海洋大学 一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫调节药物中的应用
CN109400741B (zh) * 2018-11-06 2021-05-18 中科健康产业集团江苏药业有限公司 一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法
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