JP2024060613A - 霊芝β-グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、霊芝β-グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法を提供する。【解決手段】この調製方法は、S1.霊芝実物を粉砕して溶媒と混合した後、トリプシンを加えて0.5~2h酵素消化し、分離して霊芝実物残渣を得る工程と、S2.霊芝実物残渣をアルカリ水溶液と混合し、加熱条件下で超音波抽出し、得られたろ液のpH値を中性に調整して濃縮して霊芝粗製多糖を得る工程と、S3.霊芝粗製多糖をアルコール分解し、得られた沈殿物を分離、凍結乾燥して霊芝β-グルカン粗抽出物を得る工程と、S4.霊芝β-グルカン粗抽出物をグルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製して霊芝β-グルカン抽出物を得る工程と、を含む。本発明の調製方法は、簡単で、生成物の純度が高く、抽出効率が高く、検出方法が簡単で迅速であり、高感度で正確である。【選択図】なし
Description
本発明は、医薬技術分野に属し、霊芝β-グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法に関する。
霊芝(Ganoderma lucidum(Curtis) P.Karst.)は、外観が傘状で、腎臓形の半円形または亜円形のキャップを有し、サルノコシカケ科植物Ganoderma sinensisとGanoderma lucidumの全草である。古来、貴重な漢方薬の一種であり、もともとはすべて野生で、主に浙江省、広西、江西、湖南省などに生育していたが、人類の栽培技術の向上により、現在は主に栽培されており、その中でも山東省の生産量は最も多い。研究が深まるにつれて、霊芝はより多くの生物活性が掘り起こされ、主に肝臓の保護と解毒、糖尿病の治療、循環器系の改善、老化の防止、免疫力の強化などに使用されている。
霊芝多糖類は霊芝の最も有効な成分の一つで、霊芝の胞子または霊芝実物から抽出され、現在、200種類の霊芝多糖類が分離されており、そのほとんどはβ-グルカンであり、少数はα-グルカンである。β-グルカンは霊芝多糖類の中で最も活性の高い成分であり、免疫調節作用、抗腫瘍作用、抗胆汁炎作用、抗菌作用、抗ウイルス作用など様々な作用があることから、その調製・分離方法を検討し、定量的な検出により分析することは医学的に大きな意義がある。
現在、霊芝β-グルカンの調製には、熱水抽出法、超音波抽出法、マイクロ波抽出法などの方法が主に用いられているが、抽出効率が低く、抽出時間が長く、生成物に不純物が多いため、高含有量の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法が急務となっている。
本発明の目的は、調製方法が簡単で、生成物の純度が高く、抽出効率が高く、検出方法が簡単で迅速であり、高感度で正確である、霊芝β-グルカン抽出物およびその調製方法並びに検出方法を提供することである。
本発明は以下の技術的解決策によって達成される。
霊芝β-グルカン抽出物の調製方法は、
S1.霊芝実物(fruiting bodies)を粉砕して溶媒と混合した後、トリプシンを加えて、0.5~2h酵素消化し、分離して霊芝実物残渣を得る工程と、
S2.霊芝実物残渣をアルカリ水溶液と混合し、加熱条件下で超音波抽出し、得られたろ液のpH値を中性に調整して濃縮して霊芝粗製多糖を得る工程と、
S3.霊芝粗製多糖をアルコール分解(alcohol precipitation)し、得られた沈殿物を分離、凍結乾燥して霊芝β-グルカン粗抽出物を得る工程と、
S4.霊芝β-グルカン粗抽出物をグルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製して霊芝β-グルカン抽出物を得る工程と、を含む。
S1.霊芝実物(fruiting bodies)を粉砕して溶媒と混合した後、トリプシンを加えて、0.5~2h酵素消化し、分離して霊芝実物残渣を得る工程と、
S2.霊芝実物残渣をアルカリ水溶液と混合し、加熱条件下で超音波抽出し、得られたろ液のpH値を中性に調整して濃縮して霊芝粗製多糖を得る工程と、
S3.霊芝粗製多糖をアルコール分解(alcohol precipitation)し、得られた沈殿物を分離、凍結乾燥して霊芝β-グルカン粗抽出物を得る工程と、
S4.霊芝β-グルカン粗抽出物をグルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製して霊芝β-グルカン抽出物を得る工程と、を含む。
好ましくは、S1において、前記溶媒は、エタノール溶液であり、メタノール溶液またはN,N-ジメチルホルムアミド溶液である。
好ましくは、S1において、前記溶媒は、エタノール溶液である。
好ましくは、S2において、加熱温度は60~80℃である。
好ましくは、S2において、前記アルカリ水溶液は水酸化ナトリウム溶液であり、水酸化ナトリウム溶液の濃度は0.01~1mol/mLである。
好ましくは、S3は、具体的に、霊芝粗製多糖を2~5倍体積の90%エタノール溶液に加え、室温下で8~12h放置してアルコール分解し、沈殿物を収集、冷凍乾燥して霊芝β-グルカン粗抽出物を得ることである。
好ましくは、S4において、0.1mol/LのNaOH溶液を移動相としてクロマトグラフィー精製を行う。
前記の調製方法によって霊芝β-グルカン抽出物を得る。
霊芝β-グルカン抽出物の検出方法は、
グルコース標準品を用いて異なる濃度の標準液を調製し、異なる濃度の標準液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、標準液の濃度とクロマトグラフィーピーク面積に基づいて濃度-ピーク面積標準曲線をプロットする工程と、
霊芝β-グルカン抽出物を塩酸に溶解し、加圧下で加水分解し、得られた加水分解液を冷却した後、KOH溶液を加えてpH値を6~7に調整し、0.2mol/LのpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈したβ-(1,3)-グルカンエキソヌクレアーゼ(exo-1,3-beta-glucanase)およびβ-グルコシダーゼ(β-glucosidase)溶液を加えてよく混合し、1~2h酵素消化反応して得られた酵素消化液を試験液とする工程と、
試験液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、クロマトグラフィーピーク面積と濃度-ピーク面積標準曲線に基づいて、霊芝β-グルカン抽出物中のβ-グルカンの含有量を算出する工程とを含む。
グルコース標準品を用いて異なる濃度の標準液を調製し、異なる濃度の標準液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、標準液の濃度とクロマトグラフィーピーク面積に基づいて濃度-ピーク面積標準曲線をプロットする工程と、
霊芝β-グルカン抽出物を塩酸に溶解し、加圧下で加水分解し、得られた加水分解液を冷却した後、KOH溶液を加えてpH値を6~7に調整し、0.2mol/LのpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈したβ-(1,3)-グルカンエキソヌクレアーゼ(exo-1,3-beta-glucanase)およびβ-グルコシダーゼ(β-glucosidase)溶液を加えてよく混合し、1~2h酵素消化反応して得られた酵素消化液を試験液とする工程と、
試験液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、クロマトグラフィーピーク面積と濃度-ピーク面積標準曲線に基づいて、霊芝β-グルカン抽出物中のβ-グルカンの含有量を算出する工程とを含む。
好ましくは、前記霊芝β-グルカン抽出物は、上記抽出方法によって得られた霊芝β-グルカン抽出物である。
従来技術と比較すると、本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明の方法は、溶媒-トリプシン前処理を採用し、超音波とアルカリ水熱抽出を組み合わせて霊芝中のβ-グルカンを抽出し、本発明は、超音波抽出、アルカリ水熱抽出の利点を組み合わせて、より高い抽出率を得るので、抽出効率が高く、生成物の純度が高く、方法が簡単である。
本発明は、グルコースを標準品として、高圧-酸酵素加水分解-HPLC法により調製された霊芝β-グルカン抽出物を検出し、この酵素は、基質と結合し、β-グルカンの非還元性末端から順次基質のグルコシド結合を切断し、単一のグルコースを放出するモードで加水分解する。検出方法、すなわちHPLC法は、移動相と固定相の間の可溶化、吸着、浸透またはイオン交換の異なる効果により、同じ瞬間にカラムに入った成分が、カラムの2相間で移動相とともに繰り返し何度も分配されるという原理に基づいている。カラム内の成分の移動速度が異なるため、カラムの一定長さが経過すると、成分は互いに分離される。成分は順にカラムから流出し、信号検出器に入り、成分のピーク値をレコーダーやデータ処理装置に表示する。外部標準法によるピーク面積定量に基づく保持時間制御定性によれば、本発明は簡単で、迅速、高感度、高精度で、応用の見込みが広く、複数の生物活性を有する霊芝β-グルカンの測定に有効で信頼性の高い分析方法を提供する。
本発明をさらに理解するために、以下、実施例に関連して本発明を説明するが、これらの説明は、本発明の特徴および利点をさらに説明するために使用され、本発明の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明の高い含有量の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法およびその効率的かつ迅速な検出方法は、エタノール-トリプシン前処理と超音波補助アルカリ水熱を組み合わせて霊芝中のβ-グルカンを抽出し、DEAE Sephadex A-25グルカンゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、高圧-酸酵素加水分解-HPLC方法により調製された霊芝β-グルカン抽出物中のβ-グルカンの含有量を測定するものである。方法論的検討の結果、この方法は、検出感度が高く、安定性、再現性、検出精度が高いことが分かった。
具体的な調製方法は以下のとおりである。
S1.霊芝実物のエタノール-トリプシン前処理
霊芝実物を秤量し、粉砕、ふるい分けて、栓付き試験管に入れ、一定濃度のエタノール溶液を加え、ボルテックスミキサーにかけて混合した後、トリプシンを加えて、0.5~2h酵素消化し、霊芝実物中の油脂、色素、タンパク質などの不純物を除去する。遠心分離、濾過し、ろ液を捨て、霊芝実物残渣を得る。
S2.霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を丸底フラスコに入れ、NaOH溶液を加え、超音波洗浄器に放置し、温度60~80℃で超音波をかける。超音波処理後、遠心分離、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、1回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離、濾過し、2回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液でpH値を中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターで原液体積の1/4に真空減圧濃縮する。
S3.アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得
S2で得られた濃縮液に2~5倍体積の90%エタノール溶液を加え、室温で8~12h放置してアルコール分解し、遠心分離、濾過し、上清を捨て、沈殿物を収集し、冷凍乾燥して霊芝β-グルカン粗抽出物を得る。
S4.霊芝β-グルカンの精製
上記霊芝β-グルカン粗抽出物を取り、一定量の蒸留水を加えて溶解し、遠心分離して上清を得、0.1mol/LのNaOH溶液を移動相としてDEAE Sephadex A-25グルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、β-グルカン含有の成分を収集し、濃縮、冷凍乾燥して高い含有量、高純度の霊芝β-グルカンを得る。
具体的な検出方法は以下のとおりである。
S1.標準液の調製
グルコース標準品を正確に秤量し、高純度水を加えて標準予備溶液とする。
S2.試験液の調製
霊芝β-グルカンを正確に秤量し、栓付き試験管に入れ、一定量の塩酸を加え、ボルテックスミキサーにかけて良く混合する。試験管を恒温水槽に入れ20~40min水浴し、一定時間ごとにミキサーにかけて混合し、β-グルカンがすべて溶解したことを確認した。その後、良く混合されたサンプルをSchott瓶に移し、高純度水を加えて、よく振り混ぜた後Schott瓶をオートクレーブに入れて加水分解する。加水分解後、取り出し、室温まで冷却し、KOH溶液を加えてpH値を6~7に調整する。
高圧加水分解液をメスフラスコに移し、0.2mol/LのpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液で試験管を洗浄し、メスフラスコに合わせて、定量、濾過する。ろ液を取り、0.2mol/LのpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈した一定量β-(1,3)-グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ-グルコシダーゼ溶液を加え、ミキサーにかけて良く混合し、40℃で1~2h反応させ、得られた酵素消化液をメスフラスコに移し、定量して試験液を得る。
S3.標準曲線の描き
S1で得られた標準予備液をそれぞれ1.0、2.0、4.0、5.0、10.0mLを取り、25mLのメスフラスコに入れ、高純度水で目盛線まで定量し、濃度20、40、80、100、200μg/mLの標準液を得、0.45μmの微多孔膜で濾過し、ろ液を高速液体クロマトグラフィーに20μLずつ正確に吸引し、標準曲線を描く。
S4.サンプル含有量の測定
S2中の試験液を0.45μmの微多孔膜で濾過した後、ろ液を高速液体クロマトグラフィーに20μLずつ正確に吸引し、溶出後、濃度-ピーク面積標準曲線から、霊芝中のβ-グルカンの含有量および抽出率を算出する。
上記S2とS3の高速液体クロマトグラフィー条件は以下のとおりである。
カラム:Shodex SH1011カラム(8.0mm×300mm,6μm)
移動相:高純度水
流速:0.5mL/min
カラム温度:80℃
オシロメトリック屈折検出器温度:35℃
サンプル注入量:20μL
移動相:高純度水
流速:0.5mL/min
カラム温度:80℃
オシロメトリック屈折検出器温度:35℃
サンプル注入量:20μL
方法論的検討
(1)精度試験
上記方法に従い、濃度60μg/mLのグルコース標準液を調製する。同一条件下で、濃度既知のグルコース標準液の注入を6回繰り返し、保持時間とピーク面積を測定し、RSD値(3%未満)を算出し、装置の精度を調べる。
(2)再現性試験
上記操作で得られた試験液を、同一条件下で6回注入し、保持時間とピーク面積を測定し、RSD値(3%未満)を算出し、装置の再現性を調べる。
(3)安定性試験
上記操作で調製された試験液を、0、2、4、8、12hおよび24h静置した後、上記クロマトグラム条件に従い注入し、サンプルの安定性を調べる。
(4)回収試験
標準予備液をそれぞれ0.16mL、0.20mL、0.24mLを取り、2mLメスフラスコに入れて高純度水で定量し、3つの濃度40μg/mL、50μg/mL、60μg/mLのグルコース標準液を得る。3つの異なる濃度のグルコース標準液をそれぞれ濃度既知の試験液に加え、同一条件下で注入測定し、各濃度を並行して3回測定する。
本発明で使用した装置は以下のとおりである。
島津-LabSolutions(日本島津LC-16)、RID-20Aオシロメトリック屈折検出器(日本島津)、BSA224S 1万分の1 電子天秤(ザルトリウス(上海)貿易有限公司)、ES1035A 1万分の1 電子天秤(天津市徳安特センシング技術有限公司)、GL2202-1SCN 100分の1電子天秤(ザルトリウス(上海)貿易有限公司)、KQ-300DE 超音波洗浄器(昆山超音波装置有限公司)、RV-Sロータリーエバポレーター(无錫星海王生物化学設備有限公司)、JC-XW-Iボルテックスミキサー(青島聚創世紀環境保護科学技術有限公司)、LS-75HDオートクレーブ(江陰濱江)、YB-2000A粉砕機(永康市速鋒工業貿易有限公司)、SJIA-10N凍結乾燥機(寧波市双嘉装置有限公司)。
本発明で使用した試薬と材料は以下のとおりである。
食品用トリプシン(純度99%、浙江福軒生物科学技術有限公司)、DEAE-Sephadex A-25(純度99%、上海沢葉生物科学技術有限公司)、グルコース標準品(純度HPLC≧99.6%、中国計量研究院)、霊芝多糖類(純度GC≧95%、中国計量研究院)、高純度水:実験室自家製、酢酸ナトリウム緩衝液(3mol/L、pH5.2,無菌、Regan Bio社)、β-(1,3)-グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ-グルコシダーゼ(BR、スペクトラム分析(上海)生物科学技術有限公司)。
実施例1
霊芝β-グルカン抽出物の調製方法の具体的な調製工程は以下のとおりである。
1.霊芝実物のエタノール-トリプシン前処理
霊芝実物10gを秤量し、粉砕して50メッシュの篩にかけ、栓付き試験管に入れ、80%のエタノール溶液15mLを加え、ボルテックスミキサーにかけて20min混合し、トリプシン1gを加え、1h酵素消化し、霊芝実物中の油脂、色素、タンパク質などの不純物を除去する。5000r/min条件下で20min遠心分離し、濾過し、ろ液を捨て、霊芝実物残渣を得る。
2.霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を100mLの丸底フラスコに入れ、20mLのNaOH溶液(0.1mol/mL)を加え、超音波洗浄器に入れ、周波数380W、温度70℃で、40min超音波処理する。超音波処理後、5000r/min条件下で20min遠心分離し、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、1回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離し、濾過し、2回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液(0.2mol/mL)でpH値を中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターに入れて原液体積の1/4に真空減圧濃縮する。
3.アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得
工程2で得られた抽出液に3倍体積の90%エタノール溶液を加え、室温で下10h静置してアルコール分解し、5000r/min条件下で20min遠心分離し、濾過し、上清を捨て、沈殿物を収集して冷凍乾燥し、霊芝β-グルカン粗抽出物を得る。
4.霊芝β-グルカンの精製
上記固体を取り、50mlの蒸留水を加えて溶解し、遠心分離して上清を取り、0.1mol/LのNaOH溶液を移動相として、DEAE Sephadex A-25グルカンゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、β-グルカン含有の成分を収集し、濃縮し、冷凍乾燥して、高含有量、高純度の霊芝β-グルカン抽出物を得る。
霊芝β-グルカン抽出物の検出方法の具体的な検出工程は以下のとおりである。
1.標準液の調製
グルコース標準品を正確に秤量し、高純度水を加えて1mLあたり500μgの溶液を調製し、標準品予備液を得る。
2.試験液の調製
霊芝β-グルカン1.0000gを正確に秤量し、50mLの栓付き試験管に入れ、1mlの塩酸を加え、ボルテックスミキサーにかけて良く混合する。試験管を40℃恒温水槽に入れて30min水浴し、10minごとにミキサーにかけて15s混合し、β-グルカンがすべて溶解したことを確認する。その後、良く混合されたサンプルを100mLのSchott瓶に移し、高純度水を40mLまで加え、よく振り混ぜた後Schott瓶を121℃オートクレーブに入れて60min加水分解する。加水分解後、取り出し、室温まで冷却し、KOH溶液を加えて(2mol/L)、pH値を7に調整する。
高圧加水分解液を50mLのメスフラスコに移し、0.2mol/LのpH5.0の酢酸ナトリウム緩衝液で試験管を洗浄し、メスフラスコに合わせ、定量して濾過する。0.1mLのろ液を取り、0.2mol/LのpH5.0の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈した5mlのβ-(1,3)-グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ-グルコシダーゼ溶液を加え、ミキサーにかけて良く混合し、40℃で1.5h反応させ、得られた酵素消化液を50mLのメスフラスコに移し、定量して試験液を得る。
3.標準曲線の描き
工程1で得られた標準予備液をそれぞれ1.0、2.0、4.0、5.0、10.0mLを取り、25mLのメスフラスコに入れ、高純度水で目盛線まで定量し、濃度20、40、80、100、200μg/mLの標準液を得、0.45μmの微多孔膜で濾過し、ろ液を高速液体クロマトグラフィーに20μLずつ正確に吸引し、得られたHPLCクロマトグラムは図1に示され、一連の濃度の標準品のピーク面積は表1に示され:
表1によると、図2に示すように、濃度を横座標X、ピーク面積を縦座標Yとして標準曲線を得る。そのグルコース標準曲線方程式はY=13099X+28469であり、その相関係数はR2=0.9998であり、良好な直線関係を有する。
4.サンプル含有量の測定
工程2の試験液を0.45μmの微多孔膜で濾過した後、ろ液20μLを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させ、クロマトグラム3を得る。濃度-ピーク面積標準曲線から、1gサンプル中のβ-グルカンの含有量が0.918g、抽出収率が91.8%であると算出する。
方法論的検討:
(1)精度試験
上記方法に従い、濃度60μg/mLのグルコース標準液を調製する。表2に示すように、同一条件下で、濃度既知のグルコース標準液の注入を6回繰り返し、その保持時間とピーク面積を測定してRSD値を算出する。RSD値がすべて3%未満であり、本装置の並行注入の精度が良好であることが示される。
(2)繰り返し試験
表3に示すように、上記工程で得られた試験液を、同一条件下で、注入を6回繰り返し、測定した保持時間とピーク面積を分析し、RSD値を算出する。RSD値がすべて3%未満であり、本方法の再現性が良好であることが示される。
(3)安定性試験
表4に示すように、上記工程で調製された試験液を、0、2、4、8、12hおよび24h静置した後、上記クロマトグラム条件に従い注入し、分析して保持時間とピーク面積を測定し、RSD値を算出する。RSD値がすべて3%未満であり、霊芝多糖類サンプル溶液が室温下で24h以内に良好な安定性を有することが示される。
(4)回収試験
標準予備液をそれぞれ0.16mL、0.2mL、0.24mLとり、2mLのメスフラスコに入れ、高純度水で定量し、3つの濃度40μg/mL、50μg/mL、60μg/mLのグルコース標準液を得る。3つの異なる濃度のグルコース標準液をそれぞれ濃度既知の試験液に加え、同一条件下で、注入して測定し、各濃度を並行して3回測定する。表5の結果に示すように、分析して保持時間とピーク面積を測定し、RSD値を算出する。RSD値がすべて3%未満であると算出する。注入回収率が98.7%~104.525%であり、本方法の精度が良好であることが示される。
実施例2
霊芝実物の前処理条件の最適化と比較は、以下のように行われる。
1.霊芝実物の前処理
霊芝実物10gを秤量し、粉砕して50メッシュの篩にかけ、栓付き試験管に入れ、それぞれ80%のエタノール、メタノール、DMF(N,N-ジメチルホルムアミド)溶液15mLを加え、ボルテックスミキサーにかけて20min混合し、その後、トリプシン1gを加え、1h酵素消化し、霊芝実物中の油脂、色素、タンパク質などの不純物を除去する。5000r/min条件下で20min遠心分離し、濾過し、ろ液を捨て、霊芝実物残渣を得る。
2.霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
アルカリ水熱抽出による霊芝粗製多糖の調製方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
3.アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得
アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得の操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
4.霊芝β-グルカンの精製
霊芝β-グルカンの精製操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
5.試験液の調製
上記実施例1の具体的な検出工程に従い、精製したβ-グルカンを処理して3つの試験液を得る。
6.サンプル含有量の測定
工程5中の3つの試験液をそれぞれ0.45μmの微多孔膜で濾過した後、ろ液20μLを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させる。濃度-ピーク面積標準曲線から、得られたピーク面積を濃度に換算し、結果が表6に示され:
結果から分かるように、トリプシン前処理にエタノールを併用すると、霊芝実物からの霊芝β-グルカンの抽出効率がより高い。したがって、エタノールを前処理試薬として選択する。
実施例3
霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出における抽出温度の比較は、以下のように行われる。
1.霊芝実物のエタノール-トリプシン前処理
エタノール-トリプシン前処理による霊芝実物の操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
2.霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を100mLの丸底フラスコに入れ、20mLのNaOH溶液(0.1mol/mL)を加え、超音波洗浄器に入れ、周波数380W、温度60℃、70℃、80℃で、40min超音波処理する。超音波処理後、5000r/min条件下で20min遠心分離し、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、1回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離し、濾過し、2回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液(0.2mol/mL)でpHを中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターに入れて原液体積の1/4に真空減圧濃縮する。
3.アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得
アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得の操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
4.霊芝β-グルカンの精製
霊芝β-グルカンの精製操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
5.試験液の調製
上記実施例1の具体的な検出工程に従い、精製したβ-グルカンを処理して3つの試験液を得る。
6.サンプル含有量の測定
工程5中の3つの試験液をそれぞれ0.45μmの微多孔膜で濾過した後、ろ液20μLを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させる。濃度-ピーク面積標準曲線から、得られたピーク面積を濃度に換算し、結果が表7に示され:
結果から分かるように、霊芝粗製多糖の超音波補助アルカリ水熱抽出において使用した超音波温度は70℃である場合、霊芝β-グルカンの調製効率がより高い。したがって、70℃を超音波温度として選択する。
実施例4
霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出において使用した異なるアルカリ水濃度の比較は、以下のように行われる。
1.霊芝実物のエタノール-トリプシン前処理
霊芝実物のエタノール-トリプシン前処理の操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
2.霊芝粗製多糖のアルカリ水熱抽出
霊芝実物残渣を100mLの丸底フラスコに入れ、それぞれ20mLの0.01mol/mLNaOH溶液、0.1mol/mLNaOH溶液、1mol/mLNaOH溶液を加えて超音波洗浄器に入れ、周波数380W、温度60~80℃で、40min超音波処理する。超音波処理後、5000r/min条件下で20min遠心分離し、濾過し、得られた残渣に対して以上の工程を繰り返し、1回のアルカリ水熱抽出を行い、遠心分離し、濾過し、2回の抽出で得られたろ液を合わせる。塩酸溶液(0.2mol/mL)でpHを中性に調整する。得られた中性抽出液をロータリーエバポレーターに入れて原液体積の1/4に真空減圧濃縮する。
3.アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得
アルコール分解による霊芝β-グルカン粗抽出物の取得の操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
4.霊芝β-グルカンの精製
霊芝β-グルカンの精製操作方法は、上記実施例1の具体的な調製工程と同様である。
5.試験液の調製
上記実施例1の具体的な検出工程に従い、精製したβ-グルカンを処理して3つの試験液を得る。
6.サンプル含有量の測定
工程5中の3つの試験液をそれぞれ0.45μmの微多孔膜で濾過した後、ろ液20μLを高速液体クロマトグラフィーに正確に吸引して溶出させる。濃度-ピーク面積標準曲線から、得られたピーク面積を濃度に換算し、結果が表8に示され:
結果から分かるように、霊芝粗製多糖の超音波補助アルカリ水熱抽出において使用したNaOH溶液濃度が0.1mol/mLである場合、霊芝β-グルカンの調製効率がより高い。したがって、0.1mol/mLNaOH溶液を抽出液として選択する。
Claims (10)
- S1.霊芝実物を粉砕して溶媒と混合した後、トリプシンを加えて、0.5~2h酵素消化し、分離して霊芝実物残渣を得る工程と、
S2.霊芝実物残渣をアルカリ水溶液と混合し、加熱条件下で超音波抽出し、得られたろ液のpH値を中性に調整して濃縮して霊芝粗製多糖を得る工程と、
S3.霊芝粗製多糖をアルコール分解し、得られた沈殿物を分離、凍結乾燥して霊芝β-グルカン粗抽出物を得る工程と、
S4.霊芝β-グルカン粗抽出物をグルコースゲルカラムクロマトグラフィーで精製して霊芝β-グルカン抽出物を得る工程と、を含む、ことを特徴とする霊芝β-グルカン抽出物的調製方法。 - S1において、前記溶媒は、エタノール溶液、メタノール溶液またはN,N-ジメチルホルムアミド溶液である、ことを特徴とする請求項1に記載の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法。
- S1において、前記溶媒は、エタノール溶液である、ことを特徴とする請求項1に記載の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法。
- S2において、加熱温度は60~80℃である、ことを特徴とする請求項1に記載の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法。
- S2において、前記アルカリ水溶液は水酸化ナトリウム溶液であり、水酸化ナトリウム溶液の濃度は0.01~1mol/mLである、ことを特徴とする請求項1に記載の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法。
- S3は、具体的に、霊芝粗製多糖を2~5倍体積の90%エタノール溶液に加え、室温下で8~12h放置してアルコール分解し、沈殿物を収集、冷凍乾燥して霊芝β-グルカン粗抽出物を得ることである、ことを特徴とする請求項1に記載の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法。
- S4において、0.1mol/LのNaOH溶液を移動相としてクロマトグラフィー精製を行う、ことを特徴とする請求項1に記載の霊芝β-グルカン抽出物の調製方法。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の調製方法により得られた霊芝β-グルカン抽出物。
- グルコース標準品を用いて異なる濃度の標準液を調製し、異なる濃度の標準液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、標準液の濃度とクロマトグラフィーピーク面積に基づいて濃度-ピーク面積標準曲線をプロットすることと、
霊芝β-グルカン抽出物を塩酸に溶解し、加圧下で加水分解し、得られた加水分解液を冷却した後、KOH溶液を加えてpH値を6~7に調整し、0.2mol/LのpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈したβ-(1,3)-グルカンエキソヌクレアーゼおよびβ-グルコシダーゼ溶液を加えてよく混合し、1~2h酵素消化反応し、得られた酵素消化液を試験液とすることと、
試験液を高速液体クロマトグラフィー分析に供し、クロマトグラフィーピーク面積を求め、クロマトグラフィーピーク面積と濃度-ピーク面積標準曲線に基づいて、霊芝β-グルカン抽出物中のβ-グルカンの含有量を算出することと、を含む、ことを特徴とする霊芝β-グルカン抽出物の検出方法。 - 前記霊芝β-グルカン抽出物は、請求項8に記載の霊芝β-グルカン抽出物である、ことを特徴とする請求項9に記載の霊芝β-グルカン抽出物の検出方法。
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