CN115518087A - 一种白果活性成分的综合提取分离方法 - Google Patents

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Abstract

一种白果活性成分的综合提取分离方法，其包括如下步骤：(1)脂溶性成分提取；(2)水溶性成分提取；(3)白果油的分离；(4)白果烷基酚酸的分离；(5)白果黄酮与内酯的分离；(6)白果多糖的分离；(7)白果蛋白的分离；(8)白果淀粉的提取分离。一种白果活性成分的综合提取分离方法，解决现有白果提取单一成分问题，本发明从全部产品的集成化提取分离考虑，从整体上发明了白果中活性成分的综合提取分离方法，不只是注重单个产品的提取分离，做到了银杏叶的“吃干榨尽”，是资源综合利用的价值取向。在追求资源“吃干榨尽”的同时，对生产过程中产生的废弃物，变废为宝，化害为利，以达到综合利用的目的，促使循环经济的发展，实现资源节约，环境友好的经济模式。

Description

一种白果活性成分的综合提取分离方法
技术领域
一种白果活性成分的综合提取分离方法。
背景技术
白果(学名：Ginkgo biloba)，本品为银杏科植物银杏(白果树、公孙树)Ginkgobiloba L.的干燥成熟种子。秋季种子成熟时采收，除去肉质外种皮，洗净，稍蒸或略煮后，烘干。生于海拔500～1000m的酸性土壤，排水良好地带的天然林中。分布于北自沈阳，南达广州，东起华东，西南至贵州、云南都有栽培。干燥的种子呈倒卵形或椭圆形，一端稍尖，另端钝，略扁，长径1.5～3.0cm，短径1～1.5cm。外壳(外种皮)白色或灰白色。外壳(中种皮)骨质，光滑，表面黄白色或淡棕黄色，基部有一圆点状突起，边缘各有1条棱线，偶见2～3条棱线。壳内有长而扁圆形的种仁，剥落时一端有淡棕色的薄膜。内种皮膜质，红褐色或淡黄棕色。种仁扁球形，宽卵球形或椭圆形，胚乳肥厚，粉质，中间有空隙，胚极小，一端淡棕色，另一端金黄色，横断面外层黄色，胶质样，内层白色、淡黄色或淡绿色，粉质，中心有空隙，靠近顶端有子叶2枚或更多。气微，味甘、微苦涩。以外壳白色、种仁饱满、断面色淡黄、里面色白者佳。全国大部分地区有产。主产广西、四川、河南、山东、湖北、辽宁等地。功能主治：敛肺气，定喘嗽，止带浊，缩小便。治遗精，淋病，小便频数，痰多喘咳，带下白浊，遗尿尿频、无名肿毒、皶鼻、癣疮。
1.化学成分
《中药大辞典》中记载种子含少量氰甙、赤霉素和动力精样物质，内胚乳中还分离出两种核糖核酸酶，一般组成为：蛋白质6.4、脂肪2.4、碳水化物36％，钙10毫克、磷218毫克、铁1毫克％，胡萝卜素320微克、核黄素50微克，以及多种氨基酸，外种皮含有毒成分白果酸、氢化白果酸、氢化白果亚酸、白果酚和白果醇，尚含天门冬素、甲酸、丙酸、丁酸、辛酸、廿九烷醇-10等，花粉含多种氨基酸、谷氨酰胺、天门冬素、蛋白质、柠檬酸、蔗糖等，雄花含棉子糖可达鲜重的4％。《中华本草》中记载种子含有毒成分为4-O-甲基吡哆醇，称为银杏毒素，还含6-(8-十五碳烯基)-2，4-二羟基苯甲酸，6-十三烷基-2，4-二羟基苯甲酸，腰果酸和钾、磷、镁、钙、锌、铜等25种无素，种仁含蛋白质，脂肪、碳水化合物、糖等。夏梦雨等报道白果的化学成分主要有黄酮类化合物有银杏双黄酮、异银杏黄素、松柏苷等、萜内酯类化合物有银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C等、酚酸类化合物有白果酸、白果酚和白果二酚、有机酸类化合物有油酸、亚油酸和二十碳三烯酸(中国药房，2020，31，123-128)。周梦怡等报道白果中粗蛋白含量为18.06～20.96g/100g，氨基酸总含量为38.69～62.13g/100g蛋白，其中必需氨基酸总含量为15.85～24.08g/100g蛋白，白果第一限制性氨基酸为Lys(河北农业大学学报，2019，42，74-80)。周桂生对银杏外种皮、中种皮和种仁化学成分进行了系统分离，外种皮中分离得到(7S，8R，11S)-二十九烷三醇、(10R，12R，15S)-二十九烷三醇、二十八烷酸、二十四烷酸、二十烷酸、二十九烷-10-醇、β-谷甾醇、6-(十五烷基)-水杨酸、6-(8-十五碳烯)-水杨酸、6-(10-十七碳烯)-水杨酸、二十烷酸-1-甘油酯、芹菜素、槲皮素、山奈酚、金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、胡萝卜苷、D-葡萄糖、蔗糖；中种皮分离得到十八烷酸、棕榈酸、二十九烷-10-醇、β-谷甾醇、正三十二烷醇、正二十二烷醇、6-(十五烷基)-水杨酸、6-(8-十五碳烯)-水杨酸、正二十二烷酸-1-甘油酯、正二十烷酸-1-甘油酯、正十六烷酸-1-甘油酯、1，3-十六烷酸-甘油酯、1，3-二亚油酸-甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、银杏内酯B、银杏内酯C、胡萝卜苷。种仁中分离得到二十六烷酸、棕榈酸、二十九烷-10-醇、β-谷甾醇、正十六烷酸-1-甘油酯、熊果酸、金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、胡萝卜苷、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、尿嘧啶、松柏苷、daphnenosid、甘草苷、腺苷、葡萄糖和蔗糖(2013，南京中医药大学)。黄文等报道白果中含类胡萝卜素总量约489μg/100g；其中叶黄质、β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，分别占总类胡萝卜素的69.20％、15.80％和7.45％(营养学报，2003，25，324-326)。陈金铭等从银杏种子的乙酸乙酯部位分离鉴定出芹菜素、槲皮素、山奈酚、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、β-胡萝卜苷、3-咖啡酸酰基-2-甲基-D-赤藓糖酸-1，4内酯、7，8，3′，4′-四羟基二氢黄酮醇、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖(1″-6′)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(辽宁中医药大学学报，2015，17，46-49)。
2.药理作用
①抗菌作用白果肉、白果汁、白果酚，尤其是白果酸体外试验时对人型结核杆菌和牛型结核杆菌有抑制作用，油浸白果之果浆含有的抗菌成分对若干种革兰氏阳性及阴性细菌均有作用(葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌等)，对结核杆菌作用极显着，此菌成分经加热85℃则对大肠杆菌失去作用，而经100℃ 30分钟对结核扦菌仍有抑制性的作用，白果的水浸液(1∶2)在体外对堇色毛癣菌、奥杜盎氏小芽胞癣菌、星形奴犬氏菌等7种皮肤真菌表现为抑菌作用，白果果肉的抗菌力较果皮强。②对呼吸系统的作用白果乙醇提取物给小鼠腹腔注射，可使呼吸道酚红排泌增加，似有祛痰作用，对离体豚鼠气管平滑肌表现有微弱的松弛作用。③对循环系统的作用白果二酚500mg/kg对兔有短暂的降压作用。毛细血管的通透性增加，以豚鼠最为明显，其次是大鼠和兔，大鼠下肢灌流实验表明，白果二酚有组胺释放作用、引起毛细管通透性增加，导致水肿，此作用又为扑尔敏所对抗。④对自由基的清除作用：银杏外种皮水溶性成分能清除在有氧存在下黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧自由基，抑制化学发光；老年小鼠口服12天后，能阻止脾脏组织的老年色素颗粒形成，并使已形成的色素颗粒变得分散，数量减少。⑤其他作用：新鲜白果中提出的白果酚甲，对离休兔肠有麻痹作用，使离体子宫收缩，对蛙心无影响。白果种仁含无氮的中性成分，给小鼠皮下注射6mg/13g，半小时后可致惊厥，延髓麻痹，随即呼吸、心跳停止而死。旧说其中含氢氰酸，能镇咳并致中毒，但未能检得氢氰酸的存在；也有说不能证明白果中含有对小鼠引起惊厥的物质。白果肉尚有收敛作用。沈楠报道了银杏果粉提取液可延长线虫寿命，改善了部分与衰老相关的生理功能，显著增强了线虫的头摆动和身体弯曲能力，减少了线虫的脂肪积累，提高了线虫在氧化应激和热应激逆境下的抵抗能力，降低了活性氧水平(扬州大学，2021学位论文)。邓乾春等研究白果清蛋白的分子量为29248u，能抑制体内S180实体瘤和体外S180肿瘤细胞的生长，具有较强的体外清除OH及O2的能力(营养学报，2006，28，259-262)。
3.制备方法
3.1白果油
刘真阳等以白果为原料，以乙醇为提取溶剂，使用超声波辅助提取法，最佳工艺为超声时间6min、料液比1∶15g/mL、超声功率350W，此时可得最大甾醇提取率为0.878mg/(g·dw)(中国食物与营养，2020，26，19-23)。周昊等以亚临界萃取白果油，最佳工艺条件为萃取压力0.5MPa、萃取温度40℃、每次萃取时间60min、萃取次数3次、料液比1∶6，在此条件下白果出油率为96.16％(中国油脂，2017，42，72-76)。王佳宏等采用石油醚(沸程60～90℃)为提取溶剂，出油率为3.88％，白果粉粉碎度80目，提取温度25℃，超声波提取功率200W，料液比1∶25(g/mL)，每次提取时间40min，提取次数2次，出油率为3.86％(林业科技开发，2012，26，79-82)。李迎霞等对白果油的超临界萃取工艺参数进行了优选，确定了其最佳工艺为：萃取压力29.01Mpa，萃取温度40.38℃，萃取时间120min，得率为4.46％(中药材，2011，34，298-301)。陈西娟等采用超临界CO2萃取白果油，最佳工艺条件为：温度40℃、压力20MPa、流速15L/h、时间3h并添加石油醚夹带剂，不同品种白果干粉中油脂得率为3.6％(西北植物学报，2010，30，838-843)。
3.2白果烷基酚酸
郭舒航以银杏外种皮为原料，用溶剂提取法提取银杏酸，通过大孔树脂和硅胶对银杏酸进行纯化，经纯化后，银杏酸的纯度由20.07％提高到69.18％，分别为白果亚酸C13：0、白果酸C15：1、银杏酚C17：2、氢化白果酸C15：0、银杏二酚C17：1(大连工业大学，2018学位论文)。孙国娟建立了一种以异丙醇为提取溶剂，对白果中的银杏酸进行振荡提取的方法，确定了转速为130r·min-1振荡提取法的最佳提取温度为28℃、最佳时间为120min、最佳液料比为25∶1(mL/g)(天津科技大学，2015学位论文)。韩军成得到的最佳的提取工艺条件为：提取溶剂85％乙醇，料液比15(W∶V)，提取温度60℃，提取次数2次，每次提取时间5h，银杏外种皮醇提掖中银杏酸的得率为8.95％，所得浸膏纯度为33.34％，D101大孔树脂动态吸附与解吸，进样流速选择1.0mL/min，100％乙醇作为解吸液，洗脱流速选择1.0mL/min，解吸液用量为10倍柱体积(BV)，所得浸膏中银杏酸的纯度由粗提物中33.34％，提高至80.79％(合肥工业大学，2013学位论文)。尹秀莲采用S-8树脂分离纯化银杏酸，银杏酸纯度可达到85.59％，回收率达92.35％，萃取的最适条件为萃取压力30MPa、萃取温度45℃、萃取时间6h，对银杏外种皮的石油醚浸膏进行了超临界CO2萃取研究，银杏酸的回收率为91.16％，平均纯度为77.66％(江苏大学，2003学位论文)。田路飞提取分离了银杏酚酸，称取40～80目银杏外种皮粉末5.00±0.01g，提取溶剂为石油醚(60～90℃)，液固比为11.3mL·g-1，超声提取时间为65min，最佳工艺条件下银杏酚酸提取率的预测值为69.58mg·g-1，实际值为68.95mg·g-1，称取40～80目银杏外种皮粉末5.00±0.01g，破壁助剂61.5％乙醇，破壁助剂用量11mL，微波辐射时间55s，微波功率336W，回流提取温度65℃，回流提取时间86mmin，液固比10mL·g-1，银杏酚酸提取率实际值为78.48mg·g-1；采用超临界CO2萃取法工艺：称取40～80目银杏外种皮粉末5.00±0.01g，夹带剂为80％乙醇，夹带剂用量为30mL，静态浸取时间为1h，动态浸取时间为2h，萃取温度为46.1℃，萃取压力为31.3MPa，CO2流量11.1g·min-1，最佳工艺条件下银杏酚酸提取率实际值为74.00mg·g-1(东南大学，2015学位论文)。唐仕荣等采用大孔树脂及高速逆流色谱联合分离银杏酸，最佳纯化条件为：DM130大孔树脂为吸附树脂，60mL银杏酸提取液动态吸附2h，100mL 75％乙醇溶液动态解吸2h，银杏酸的纯度可提高到40.18％，以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(5∶1∶5∶1，v/v)为溶剂体系，上相为固定相、下相为流动相，流速2mL/min，转速800r/min，高速逆流色谱进一步分离得到3个色谱峰，分别为C13：0、C15：1和C17：1，面积百分比分别达到了81.5％、95.1％和98.3％(食品科技，2020，45，280-285+293)。将洗净后的银杏外种皮研磨至细，加入重量5～10倍的水中搅拌浸泡5～12h，将滤液泵入浓缩锅中，减压分馏浓缩，浓缩液中加酸溶液调节pH值2～3，冷却至-5～10℃，析出棕色晶体，抽滤得60～70％的银杏酸，用醇溶液溶解，滤去不溶物，冷却至-5～20℃，析出浅棕色晶体，过滤得90～95％的银杏酸，浅棕色晶体加入重量5～8倍的水中，用液碱调节pH值8～10，充分溶解后，加入活性炭，在搅拌状态升温，保温脱色，滤去活性炭，母液冷却至20～30℃，用酸溶液调节pH值2～3，冷却至-5～0℃，析出白色或类白色固体，过滤得大于98％的银杏酸(CN103159612B)。
3.3白果蛋白
沈凤俊报道银杏白果蛋白的最佳提取条件为料液比1∶30，碱提pH值10，提取温度为50℃，水浴时间为2h，此时的蛋白提取率为10.6％(中国食品科学技术学会第十五届年会论文摘要集)。沈丽对白果蛋白进行碱溶酸沉提取，用正交实验确定白果蛋白提取的最佳工艺为料液比1∶25，pH9.0，提取温度50℃，提取时间1.5h，NaCl浓度0.1mol/L，在此条件下，白果蛋白提取率为82.18％(南京师范大学，2018学位论文)。张秀云对白果提取蛋白质的最适条件为：提取液浓度0.16mol/L，pH8.7，料液比1∶26，提取时间5h，此条件下，白果蛋白质的提取率为82.76％(食品工业科技，2016，37，299-302+308)。白果抗菌蛋白提取最佳工艺条件为硫酸铵质量分数为55.6％，提取时间为3.9h，硫酸摩尔浓度为0.07mol/L，料液比为1∶7.1(g/mL)(食品工业，2014，35，131-134)。孙小斐以白果为原料，经过筛选去壳、低温烘干、粉碎过筛和脱脂步骤制取脱脂白果粉，并采用碱提酸沉法从脱脂白果粉中提取白果蛋白，白果中的蛋白质含量达到80.36％(食品工业，2012，33，156-158)。李莹莹等经过冷冻干燥处理的白果采用Tris-HCl提取法获得的白果蛋白含量较高，Tris-HCl法提取白果蛋白的最佳工艺为pH8.5、0.15mol/L Tris-HCl溶液、料液比1∶20(g/mL)、提取时间4h，白果蛋白质的提取率达到75.01％(食品科学，2010，31，36-40)。陈西娟采用盐溶液提取蛋白质的最佳工艺条件：时间30min，3次提取，料液比1∶7，溶剂pH值8，蛋白质得率4.38％，采用60％和70％的硫酸铵两次沉淀，时间12h，pH 6，不同孔径膜切割分离分子量10,000Da～30,000Da的蛋白质，采用DEAE纤维素树脂纯化蛋白质，缓冲液pH值7.5，pH值8的0.4mol/L的NaCl溶液洗脱，纯化的样品中蛋白质含量62.8％(中国林业科学研究院，2010)。黄文以脱脂白果为原料，采用盐溶和盐析的方法，首次从白果中制备出清蛋白(GAP)、球蛋白(GGP)和盐溶蛋白(GSP)，利用DEAE-Cellulose离子交换层析，采用分步式结合梯度式的洗脱模式成功地将清蛋白分成为两个级分(GAPI和GAPII)，采用DEAE-Sephadex-A50柱层析，进一步纯化GAPH，得到较均一的GAPIIa，分光光度法、层析法、电泳法和质谱法鉴定其为具有色谱纯和电泳纯的样品(华中农业大学，2002学位论文)。吴海霞采用硫酸铵分级盐析、透析、纤维素DE-52阴离子交换柱层析及Sephadex G-75凝胶过滤柱层析对银杏种仁蛋白进行分离纯化(食品科学，2014，35，108-113)。华菁采用最佳提取工艺参数为：料液比1∶20(g/mL)，提取时间12h，提取液浓度为0.05mol/L，提取液pH 7.0，此时银杏种仁粗蛋白的提取率达到最高达到90.67％；通过40％和80％饱和度硫酸铵分级沉淀，去除水溶性杂质和杂蛋白，获得初步纯化的银杏种仁抑菌粗蛋白利用DEAE-Cellulose52离子交换层析对银杏种仁抑菌粗蛋白进行分离，上样浓度10mg/mL，上样量10mL，洗脱液流速为5mL/min，用含0.1mol/L(170mL)-0.3mol/L(80mL)-0.8mol/L(270mL)NaCl的0.02mol/L PBS(pH7.0)缓冲液进行阶段式洗脱(南京林业大学，2014学位论文)。贾韶千等通过碱法提取银杏种仁中的蛋白质，最佳工艺条件为：提取时间12h，料液比1∶26，NaOH溶液质量分数0.2％，提取量为99.99mg/g，提取率达到了89.14％(食品科学，2011，32，18-20)。孟如杰等将银杏种仁破碎，提取缓冲液4℃浸取后离心得上清液，上清液经硫酸铵沉淀，DEAE-52离子交换层析，MonoQ离子交换层析，UltroGelACA-54凝胶过滤层析，分离得到一种具有抗氧化活性的蛋白(天然产物研究与开发，2010，22，388-391+432)。张风梅等采用盐溶和盐析的最佳条件为：NaCl浓度为0.14mol/L，pH 8.0，提取温度4℃，浸提时间4h，浸提次数大于3次(食品科技，2012，37，214-217)。李盼盼等利用超声波辅助提取银杏蛋白，最佳工艺条件为提取温度45℃，pH10，超声波提取时间20min，液料比20mL/g，超声波功率300W，在此试验条件下蛋白溶出量为61.748g/mL(中国食品学报，2012，12，88-95)。
3.4白果淀粉
王梅桂报道了银杏淀粉中直链淀粉含量为33.90％，银杏淀粉颗粒呈球形或椭圆形，颗粒大小约为5-18μm，属于CA型晶体结构，重均分子质量为3.45×107g/mol，旋转半径为125.75nm，糊化温度范围为73.1-77.9-85.0℃(江南大学，2014学位论文)。敖自华等报道了银杏淀粉颗粒的大小为3.5-45.9μm，平均粒径为15.5μm，呈单粒球形、椭球形或多面体形，无明显的层状结构，具典型的偏光十字，DSC测定银杏淀粉的糊化温度To、Tp、Tc分别为71.5℃、74.7℃和80.6℃，糊化热(ΔH)为4.9J/g，银杏淀粉糊的粘度降落值低，热稳定性好(食品科学，1999，20，35-39)。敖自华等用重结晶法可得纯度较高的银杏直链淀粉和支链淀粉，凝胶过滤色谱表明，银杏直链淀粉的分子量比玉米直链淀粉的小，含量为33％，而支链淀粉的分子量则具有较宽的分布，银杏直、支链淀粉的碘亲和力分别为19.19％和0.13％，蓝值分别是0.85和0.12，λmax为626nm和564nm，银杏淀粉中直链淀粉含量为33％(食品科学，2001，22，23-26)。汪兰等报道了银杏淀粉呈圆形或卵圆形，粒径范围分布在5～20μm，为C型晶体，结晶度39.9％(中国粮油学报，2007，22，66-70.)。敖自华等应用酶法研究了银杏支链淀粉的平均链长、外链和内链长分别为25、17和7，用异淀粉酶和普鲁兰酶作用于银杏支链淀粉β-极限糊精，得到银杏支链淀粉的A、B链比值为1.68∶1，分文化度为2.68(食品科学，2000，21，15-18)。耿敬章采用α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的最佳工艺条件：加酶量为8.0U/g，pH 5.8，酶解温度88.7℃，酶解时间为19.3min，高压处理温度120℃，高压处理时间35min，老化温度3℃，老化时间24h，在该工艺条件下银杏抗性淀粉得率可达24.12％(中国粮油学报，2016，31，25-30)。师绘敏以NaOH为浸泡剂进行银杏淀粉提取，最佳工艺条件为：碱液质量分数为0.4％，料液比1∶7，浸泡温度45℃，浸泡时间3h，在此条件下，银杏淀粉的提取率为73.5％(食品工业，2012，33，49-52)。
3.5白果多糖
吴海霞等白果多糖的最佳提取工艺条件如下：液料比45ml∶1g，95℃浸提3.0h，在该条件下多糖得率为19.67％(江苏农业学报，2020，361551-1558)。白果外种皮多糖的最佳提取工艺为：提取温度100℃、提取时间5.3h、液料比30∶1(mL/g)、提取4次。在此条件下，多糖提取率为(6.657±0.302)％，经活性炭脱色后，脱色率为98.39％(2018，锦州医科大学)。李新华等微波辅助提取银杏白果多糖的最佳工艺条件：料液比为1∶40、微波功率为700W、萃取温度为50℃、萃取时间为5min，在此条件下银杏白果多糖的提取率为4.87％(食品科技，2012，37，160-163)。安利国从银杏白果中分离银杏白果多糖，研究其组成性质，经热水提取，乙醇沉淀，Sevag法去蛋白，乙醇分级分离，SephadexG 200柱层析纯化银杏白果多糖，采用醋酸纤维纸电泳、Sepharose 4B柱层析及毛细管电泳对其进行分析和组成研究，提取纯化的银杏白果多糖是单一均匀的多糖，分子量为1.86×105，得率为0.87％(中国药学杂志，2002，37，331-333)。杨强采用热水浸提法，料液比为25mL/g、温度为90℃、时间为5h，在此条件下银杏果多糖的提取率为2.76％；采用微波辅助浸提法提取银杏白果多糖的最佳工艺条件为：料液比为40mL/g、微波功率为700W、萃取温度为50℃、萃取时间为5min，银杏果多糖的提取率为4.87％；选取了木瓜蛋白酶联合Sevage法脱蛋白的最佳条件：酶用量0.1g，酶解温度40℃，酶解时间1.5h、溶液pH为7，蛋白脱除率为71.2％，多糖损失率15.3％；采用大孔树脂法对银杏果多糖进行脱色，脱色1号是银杏果多糖脱色的理想树脂；色素脱除的优化条件为：pH值为4.5，温度为25℃，上柱速度为1.5mL/min，上样浓度为选择4mg/mL，柱容量为2BV的条件下，多糖的脱色率为82.37％，多糖保留率为79.12％，蛋白去除率为88.39％(沈阳农业大学，2013学位论文)。
所有以上文献报道，都只是对白果的某一种或几种成分的提取，并未对白果资源综合利用，本发明提供一种从白果中制备多种活性物质的方法，解决现有制备白果提取物提取单一成分问题，做到了银杏叶的“吃干榨尽”，是资源综合利用的价值取向。我国白果产品的开发还蕴藏着巨大的潜力，随着人们生活水平的提高和科学技术的进步，白果及其制剂所特有的保健、治疗和营养功能必将进一步为人类所利用，白果的综合干发利用前景将更加广阔。
发明内容
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其包括如下步骤：(1)脂溶性成分提取；(2)水溶性成分提取；(3)白果油的分离；(4)白果烷基酚酸的分离；(5)白果黄酮与内酯的分离；(6)白果多糖的分离；(7)白果蛋白的分离；(8)白果淀粉的提取分离。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的脂溶性成分提取，白果装入超声提取釜中进行物料超声提取，合并各次收集的滤液，并将最后合并的滤液放置于旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，制备出白果脂溶性成分浸膏I和最后收集的滤渣I；
所述的超声提取溶剂为90～95％乙醇；
所述的料液比，第一次超声提取为1∶10～15(g∶mL)，第二次超声提取为1∶8～12(g∶mL)，第三次超声提取为1∶6～10(g∶mL)，第四次超声提取为1∶4～8(g∶mL)；
所述的超声发生方式，它激式超声发声装置，径向振动柱状换能器；
所述的超声波功率位1000W，超声频率位30～60KHZ；
所述的提取方式，间隔2min，超声作用一次，超声作用时间3min，总提取时间30min；
所述的提取温度：50～60℃；
所述的搅拌方式：气升式搅拌。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的水溶性成分提取，滤渣I采用亚临界水提取，亚临界水提取装置中通入高纯氮气，以脱氧蒸馏水为萃取剂，料水比为1∶10～20(g∶mL)，提取温度100～150℃，提取时间30～60min，压力控制在3～10Mpa，得到含白果多糖和白果蛋白的萃取液及滤渣II，将得到含白果多糖和白果蛋白的萃取液离心，浓缩，醇沉，得到粗品，粗品用水溶解，加入叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，得到上相I、中相I和下相1；
所述的离心，以转速3000～5000r/min离心10～20min；
所述的浓缩，用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/3～1/10；
所述的醇沉，将含白果多糖和白果蛋白粗提浓缩液加入95～100wt％乙醇，使乙醇最终浓度为70～80wt％，搅拌均匀后，静置沉淀5～10h，抽滤，得到沉淀物，用无水乙醇洗涤1～3次，得到粗品；
所述的粗品用水溶解，将上述粗品加入去离子水溶解，配制成白果多糖和白果蛋白浓度为30～50wt％的溶液，得到含糖和蛋白溶液；
所述的叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，含糖和蛋白溶液与叔丁醇体积比1∶1～1∶3，硫酸铵质量分数30～50wt％，温度35～40℃，时间30min，pH值7，得到上相I、中相I和下相I。
本发明方法利用亚临界水萃取技术，是利用升高温度和压力，亚临界水的氢键被打开或减弱，水的极性(介电常数)降低(ε＜10)，对脂溶性组分溶解能力增加的特性通过控制亚临界水的温度和压力，使水的极性在较大范围内变化，从而使其能在一个较宽的范围对中等极性乃至非极性的组分具有良好的溶解性，实现选择性提取。亚临界水萃取是以价廉、无污染的水作为萃取剂，是一项绿色环保、前景广阔提取方法，与超临界流体提取相比，可以应用于中药材中极性强和相对分子质量较高的物质的提取，正好弥补CO2超临界流体萃取的不足。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的白果油的分离，将浸膏I加入石油醚回流提取四次，得到滤渣VI和滤液I～IV，滤液I～IV浓缩成浸膏II，将正己烷、乙醇和磷酸氢二钾水溶液按一定比例混和均匀，加入浸膏II中，搅拌均匀，静置一定时间后，分为三相，上相II、中相II和下相II，收集上相II，加入活性炭脱色，减压浓缩，得到白果油；
所述的提取温度60～100℃，提取时间60～90min；
所述的每次提取石油醚用量，5～10倍(mL∶g)
所述的滤液I～IV，在压力为-(0.08～0.1)MPa，温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15，得到浸膏II；
所述的正己烷、乙醇和磷酸氢二钾水溶液的操作条件为正己烷-乙醇-磷酸氢二钾-水(10∶20∶20∶50，w/w/w/w)，白果脂肪油和白果烷基酚酸分别富集于三液相体系的上相II和中相II；
所述的活性炭脱色，加入3～5％(w/w)活性炭回流脱色30min，抽滤，收集滤液；
所述的浓缩，滤液在真空减压浓缩设备的浓缩压力为-(0.08～0.1)MPa，浓缩温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15。
疏水性有机溶剂/亲水性低分子有机溶剂/无机盐/水三液相体系能将天然产物中的弱极性有效成分富集在上相，将中等极性的有效成分富集在中相，而极性较强的水溶性杂质则主要集中在下相，提高了有效成分的分离效率，简化了后续纯化工艺。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的白果烷基酚酸的分离，将收集的中相II在真空减压浓缩设备的浓缩压力为-(0.08～0.1)MPa，浓缩温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15，得到白果烷基酚酸粗品；粗品中加入石油醚(60～90℃)溶解，加入碱液反应，分层，收集水相，酸化，沉淀，抽滤，水洗，干燥，溶解，脱色，浓缩，结晶，得到白果烷基酚酸精品；
所述的加入碱液反应，石油醚溶解液中，加入10～20wt％的碱液在60～90℃反应30～60min，反应液分层，收集水相；
所述的碱液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或甲醇钠中之一；
所述的水相，加入盐酸或硫酸调节pH值2～4，放置，产生沉淀，抽滤，滤饼用纯化水洗至抽滤液pH值7左右；
所述的干燥，将滤饼在温度40～50℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，得到干燥物；
所述的溶解、脱色，将干燥物加入3～5倍(w/w)石油醚(60～90℃)溶解，溶解液中按料液比0.1～0.5∶1(g∶mL)加入凹凸棒石吸附剂脱色；
所述的脱色液在真空度-(0.08～0.1)MPa，温度30～60℃下，浓缩至原体积1/3～1/4，放置，结晶，抽滤，结晶物以少量石油醚洗涤，在温度40～50℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，得到干燥物。
发明利用酚类化合物与碱作用生成溶于水的酚钠盐，利用这一反应，使油脂中含酚酸类成分生成酚钠盐而溶于水，转移至水相中，与油脂中其他化合物的有机相分离，再用无机酸处理水相使酚类还原，得到高含量白果烷基酚酸。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(5)中所述的白果黄酮与内酯的分离，步骤(3)中所得的滤渣V用乙醇溶解，过滤，加30～45℃的温水均匀分散成50～100mg/mL的液体，以0.5mL/min的上样速度上样，静态吸附30～50min，梯度洗脱，收集洗脱液再次柱层析，洗脱液浓缩，干燥，得到白果黄酮和内酯；
所述的梯度洗脱，采用2.0～4.0BV的pH值5～7，温度15～25℃的纯化水洗涤，去除杂质，直至洗脱液清亮；
再用5～10wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分1，为强极性类化合物；
接着用20～40wt％的乙醇溶液2.0～5.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分2，为中等极性类化合物；
再用50～60wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分3，为中等极性类化合物；
最后用70～80wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分4，为弱极性类化合物；
再次上柱，合并组分2～3，浓缩除去乙醇，加水分散，使总黄酮和内酯总浓度在2.0～5.0mg/mL，经大孔树脂柱吸附，上柱流速为1.0～3.0BV/h，用纯化水15～25℃下对大孔树脂进行洗脱，除去水溶性杂质，得吸附饱和的树脂柱，用70～80wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥；
所述的大孔树脂，AB-8、D101、D140、HPD100、LX-38、LSA-12S、LX-68、S-8、FL-2、DM130、X-5、D201、HZ806、LSA-5B和NAK-12中之一；
所述的浓缩、干燥，在温度50～60℃，真空度-(0.09～0.095)MP下，真空浓缩至固形物含量50～60％时放出物料，转移至真空干燥箱内进行干燥，真空干燥条件为箱内温度85～95℃，真空度-(0.096～0.099)MP，真空干燥6～8h，到时关闭热源，待箱体冷却后开箱。
白果中黄酮和内酯含量很低，因此一并提取分离。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(6)中所述的白果多糖的分离，将步骤(2)中得到的下相I透析除去无机盐，水浴脱色，浓缩，醇沉，离心，干燥，得到白果多糖；
所述的水浴脱色，水浴温度控制在45～50℃，时长为90min，前60min以H2O2氧化法脱色，后30min以活性炭吸附法脱色，抽滤，收集滤液；
所述的离心，以转速3000～5000r/min离心10～20min；
所述的浓缩，用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/3～1/10；
所述的醇沉，将含白果多糖和白果蛋白粗提浓缩液加入95～100w％乙醇，使乙醇最终浓度为70～80wt％，搅拌均匀后，静置沉淀5～10h，抽滤，得到沉淀物，用无水乙醇洗涤1～3次，得到粗品；
所述的离心，以转速3000～5000r/min离心10～20min；
所述的干燥，所述的干燥，在温度50～60℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，制得白果蛋白。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(7)中所述的白果蛋白的分离，步骤(6)得到的中相I水浴脱色，浓缩，醇沉，离心，干燥，得到白果总蛋白，白果总蛋白以氯化钠溶液溶解，离心，清夜加入硫酸铵沉淀，所得沉淀透析，分离得到白果盐溶蛋白、球蛋白和清蛋白；
所述的水浴脱色，水浴温度控制在45～50℃，时长为90min，前60min以H202氧化法脱色，后30min以活性炭吸附法脱色，抽滤，收集滤液；
所述的浓缩，滤液用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/2～1/20；
所述的醇沉，加入无水乙醇，使乙醇的质量百分比浓度为75～85％，静置5～10h，以3000～5000r/min离心10～15min，得沉淀物，沉淀物以无水乙醇进行洗涤2～3次；
所述的干燥，在温度50～60℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，制得白果总蛋白；
所述的氯化钠溶液溶解，白果总蛋白中加入3～5倍(v/w)0.15～0.20mol/L氯化钠溶液，溶解后以3000～5000r/min离心10～15min，收集清夜；
所述的硫酸铵沉淀，清夜中加入硫酸铵，使其饱和度达到45～55％，析出蛋白，以3000～5000r/min离心10～15min，收集沉淀和清夜，沉淀为盐溶蛋白；清夜中加入硫酸铵，使其饱和度达到85～90％，析出蛋白，以3000～5000r/min离心10～15min，收集沉淀；沉淀经透析，得到清夜为球蛋白，透析得到的沉淀为清蛋白。
根据盐溶蛋白、球蛋白和清蛋白性质不同，对其进行了分离纯化，白果中90％以上均为球蛋白和清蛋白，盐溶蛋白含量较低。
一种白果活性成分的综合提取分离方法，其特征在于，步骤(8)中所述的白果淀粉的分离，步骤(2)中所得滤渣II用碱液匀浆提取，滤渣II用1～3％的氯化钠与0.2％的亚硫酸钠匀浆过滤，滤液静置，倾去上清液，沉淀用1％氯化钠洗涤三次，再用0.1％氢氧化钠洗涤依次，用纯化水洗涤3次，得到白果淀粉；
所得的淀粉用水分散，加入0.1～0.5mol/L氢氧化钠溶液，搅拌均匀，静置5min，加入1％氯化钠，用盐酸中和至pH值6～7，室温放置15～20h，分层，上层为直链淀粉，下层为支链淀粉；
所得的直链淀粉粗提液，加入正丁醇饱和的水溶液，常温搅拌1h，静置5h，沉淀离心，沉淀物再用正丁醇饱和的水溶液，常温搅拌1h，静置5h，离心，沉淀物如此重复3～4次，所得沉淀物中加入乙醇洗涤，抽滤，干燥；
所得的支链淀粉粗提液，离心，得到沉淀物计入1％氯化钠，搅拌，放置，分层，弃去清夜，沉淀物如此重复3～4次，所得沉淀物中加入乙醇洗涤，抽滤，干燥。
对白果中直链淀粉和支链淀粉进行了分离，直链淀粉是D-葡萄糖基以a-(1，4)糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基，分子量1～2×105，空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6个葡萄糖基。支链淀粉分子中除有a-(1，4)糖苷键的糖链外，还有a-(1，6)糖苷键连接的分支，分子中含300～400个葡萄糖基，分子量＞2×107，各分支也都是卷曲成螺旋形。直链淀粉具有抗润胀性，水溶性较差，不溶于脂肪。支链淀粉在冷水中不溶，与热水作用则膨胀而成糊状。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
下述实施例中，室温指15～25℃。
仪器与材料：TCLX200超声波中药提取仪(宁波振国制药设备制造有限公司)，waters高效液相色谱、Uv-260紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，800离心沉淀器(上海易用器械十厂)，匀浆器(上海净信实业发展有限公司)、水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)、真空干燥箱(南京沃环科技实业有限公司)、透析袋(上海亮惠包装材料有限公司)、大孔树脂(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)、药典筛(新乡市大汉振动机械有限公司)、硅胶、硅胶薄层板(青岛海洋化工有限公司)、点样毛细管(华西医科大学仪器厂)、凹凸棒(灵寿县玄光矿产品加工厂)、活性碳(溧阳市紫金活性炭有限公司)、真空水泵SHB-IIIG(郑州长城仪器有限公司)。对照品购自美国sigma公司和中国食品药品检定研究院，无水硫酸钠、乙醇、叔丁醇、硫酸铵、乙醚、石油醚(60～90℃)、异丙醇、氢氧化钠、盐酸、甲醇、乙酸乙酯、氯化钠、碳酸钠购自阿拉丁、百灵威、Aldrich、天津市科密欧化学试剂有限公司和国药集团化学试剂有限公司。
制备白果脂溶性成分浸膏，以500g生白果为原料，以90～95％乙醇为提取溶剂，将原料置于粉碎机中进行粉碎，经40～60目的筛网过筛，收集过筛的白果粉末，未过筛的白果颗粒再进行粉碎。料液比是指白果粉末的质量∶乙醇的体积，将白果粉末置于超声提取器中，按料液比为1∶10～15(g∶mL)的比例，将90～95％乙醇加入超声提取器中，与物料搅拌，混合均匀，在超声功率为1000W、超声频率为30～60KHZ、提取温度为50～60℃的条件下，进行第一次超声提取60～90min后，提取液过滤，收集第一次提取的滤液和滤渣；将第一次收集的滤渣置于超声提取器中，按料液比为1∶8～12(g∶mL)的比例，将90～95％乙醇加入超声提取器中，与物料搅拌，混合均匀，在超声功率为1000W、超声频率为30～60KHZ、提取温度为50～60℃条件下，进行第二次超声提取45～70min后，提取液过滤，收集第二次提取的滤液和滤渣；将第二次提取的滤渣置于超声提取器中，按料液比为1∶6～10(g∶mL)的比例，将90～95％乙醇加入超声提取器中，与物料搅拌，混合均匀，在超声功率为1000W、超声频率为30～60KHZ、提取温度为50～60℃条件下，进行第三次超声提取30～50min后，将提取液过滤，收集第三次提取的滤液和滤渣；将第三次提取的滤渣置于超声提取器中，按料液比为1∶4～8(g∶mL)的比例，将90～95％乙醇加入超声提取器中，与物料搅拌，混合均匀，在超声功率为1000W、超声频率为30～60KHZ、提取温度为50～60℃条件下，进行第四次超声提取30～40min后，收集第三次提取的滤液和滤渣；将四次提取的滤液合并，置于旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏I，浸膏I即为制备出的白果脂溶性成分，收集第四次提取的滤渣I。
将滤渣I置入亚临界水提取装置中，通入高纯氮气，以脱氧蒸馏水为萃取剂，料水比为1∶10～20(g∶mL)加入去离子水，提取温度100～150℃，提取时间10～120min，搅拌均匀后，将萃取釜盖拧紧，使萃取釜封闭，萃取釜的压力控制在3～10Mpa，然后将萃取釜放在温度加热控制仪上，此时，温度加热控制仪的预热温度为100～200℃，温度加热控制仪对萃取釜加热至使萃取釜中的物料温度为140℃，在140℃下保持10min后，将萃取釜取出，采用冷水在5min内冷却至室温，打开萃取釜底部阀门，萃取液流入搅拌罐内，将物料中的液渣进行分离，粗滤，得到含白果多糖和白果蛋白的液体及滤渣II。
将搅拌罐的滤液以转速3000～5000r/min离心10～20min，上清液用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/3～1/10，得到含白果多糖和白果蛋白粗提浓缩液；将含白果多糖和白果蛋白粗提浓缩液加入95～100wt％乙醇，使乙醇最终浓度为70～80wt％，搅拌均匀后，静置沉淀5～10h，抽滤，得到沉淀物，用无水乙醇洗涤1～3次，真空干燥，得到含白果多糖和白果蛋白的干燥物。将上述干燥物加入去离子水溶解，配制成白果多糖和白果蛋白浓度为30～50wt％的溶液，得到含糖和蛋白溶液，向其中加入叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，含糖和蛋白溶液与叔丁醇体积比1∶1～1∶3，硫酸铵质量分数30～50wt％，温度35～40℃，时间30min，pH值7，分离成三相，上相为色素，中相为蛋白，下相为多糖，分别收集下相多糖流出液和中相蛋白流出液。对中相蛋白进行水浴脱色，水浴温度控制在45～50℃，时长为90min，前60min以H2O2氧化法脱色，后30min以活性炭吸附法脱色，抽滤，滤液用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/2～1/20，浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇的质量百分比浓度为75～85％，静置5～10h，随后以3000～5000r/min离心10～15min，得沉淀物，沉淀物即为白果蛋白半成品；以无水乙醇对白果蛋白半成品进行洗涤，洗涤2～3次，取沉淀物，在温度50～60℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，得到白果总蛋白。白果总蛋白中加入3～5倍(v/w)0.15～0.20mol/L氯化钠溶液，溶解后以3000～5000r/min离心10～15min，收集清夜；清夜中加入硫酸铵，使其饱和度达到45～55％，析出蛋白，以3000～5000r/min离心10～15min，收集沉淀和清夜，沉淀为盐溶蛋白7.5g；清夜中加入硫酸铵，使其饱和度达到85～90％，析出蛋白，以3000～5000r/min离心10～15min，收集沉淀；沉淀经透析，得到清夜为球蛋白26.3g，透析得到的沉淀为清蛋白23.6g。
对下相多糖透析除去无机盐，多糖液进行水浴脱色，水浴温度控制在45～50℃，时长为90min，前60min以H2O2氧化法脱色，后30min以活性炭吸附法脱色，抽滤，滤液用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/2～1/20，浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇的质量百分比浓度为75～85％，静置5～10h，随后以3000～5000r/min离心10～15min，得沉淀物，沉淀物即为白果多糖半成品；以无水乙醇对白果多糖半成品进行洗涤，洗涤2～3次，取沉淀物，干燥，得到白果多糖29.6g。
将浸膏I和石油醚加入水浴回流提取装置中，加入浸膏I的量的5～10倍(mL∶g)石油醚，在60～100℃的水浴中进行第一次回流提取60～90min，进行第一次过滤，分别收集滤液I和滤渣III；将滤渣III加入水浴回流提取装置中，按照第一次收集的滤渣III的质量，加入5～10倍(mL∶g)石油醚，在60～100℃的水浴中进行第二次回流提取60～90min，进行第二次过滤，分别收集滤液II和滤渣IV；将滤渣IV加入水浴回流提取装置中，再按照第二次收集的滤渣IV的质量，加入5～10倍(mL∶g)石油醚，在60～100℃的水浴中进行第三次回流提取45～60min，进行第三次过滤，分别收集滤液III和滤渣V；将滤渣V加入水浴回流提取装置中，按照第三次收集的滤渣V的质量，加入5～10倍(mL∶g)石油醚，在60～100℃的水浴中进行第四次回流提取30～60min，进行第四次过滤，分别收集滤液IV和滤渣VI；滤渣VI即为得到脱脂浸膏，最后合并各次收集的滤液I～IV，在真空减压浓缩设备的浓缩压力为-(0.08～0.1)MPa，浓缩温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15，得到浸膏II。
将正己烷、乙醇和磷酸氢二钾水溶液按一定比例混和均匀，加入浸膏II中，搅拌均匀，静置一定时间后，分为三相，上相II、中相II和下相II，收集上相II，加入3～5％活性炭回流脱色30min，抽滤，滤液在真空减压浓缩设备的浓缩压力为-(0.08～0.1)MPa，浓缩温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15，得到白果油28.5g；所述的正己烷、乙醇和磷酸氢二钾水溶液的操作条件为正己烷-乙醇-磷酸氢二钾-水(10∶20∶20∶50，w/w/w/w)，白果脂肪油和白果烷基酚酸分别富集于三液相体系的上相II和中相II。
将收集的中相II加入3～5％活性炭回流脱色30min，抽滤，滤液在真空减压浓缩设备的浓缩压力为-(0.08～0.1)MPa，浓缩温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15，得到白果烷基酚酸粗品。粗品以石油醚溶解，溶解液中加入碱液反应，加入10～20wt％的氢氧化钠水溶液在60～90℃反应30～60min，反应液分层，收集水相；水相加入盐酸或硫酸调节pH值2～4，放置，产生沉淀，抽滤，滤饼用纯化水洗至抽滤液pH值7左右；将滤饼在温度40～50℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，得到干燥物；将干燥物加入3～5倍(w/w)石油醚(60～90℃)溶解，溶解液中按料液比0.1～0.5∶1(g∶mL)加入凹凸棒石吸附剂脱色；脱色液在真空度-(0.08～0.1)MPa，温度为30～60℃下，浓缩至原体积1/3～1/4，放置，结晶，抽滤，结晶物以少量石油醚洗涤，在温度40～50℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，得到精品白果烷基酚酸7.2g。
取HPD100大孔树脂用90～95％乙醇浸泡24h，充分溶胀，用无水乙醇淋洗至无浑浊，去离子水冲洗至流出液无白色浑浊，清亮为止，采用柱径高比为1∶10～15的层析柱，将处理后的HPD100大孔树脂为填料，加入到层析柱中，水洗涤平衡。将滤渣V用乙醇溶解，过滤，加30～45℃的温水均匀分散成50～100mg/mL的液体，以0.5mL/min的上样速度上样，静态吸附30～50min，采用2.0～4.0倍树脂体积的pH值为4～6，温度为15～25℃的水进行快速洗涤，去除杂质，直至洗脱液清亮。再用2.0～4.0倍树脂体积的5～10wt％的乙醇溶液洗脱HPD100大孔树脂，得组分1，为强极性类化合物；接着用2.0～4.0倍树脂体积的20～40wt％体积溶度的乙醇溶液洗脱树脂柱，得组分2，为中等极性类化合物；再用2.0～4.0倍树脂体积的50～60wt％体积溶度的乙醇溶液洗脱树脂柱，得组分3，为中等极性类化合物；最后用2.0～4.0倍树脂体积的70～80wt％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂柱，得组分4，为弱极性类化合物；合并组分2～3，浓缩除去乙醇，加水分散，再次上柱，补充水分使总黄酮和内酯浓度在2.0～5.0mg/mL，经S-8树脂柱吸附，上柱流速为1.0～3.0BV/h，用纯化15～25℃下对S-8树脂进行洗脱，除去杂质，得吸附饱和的S-8树脂柱；用70～80wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥；在温度50～60℃，真空度-(0.09～0.095)MP下，真空浓缩至固形物含量50～60％时放出物料，转移至真空干燥箱内进行干燥，真空干燥条件为箱内温度85～95℃，真空度-(0.096～0.099)MP，真空干燥6～8h，到时关闭热源，待箱体冷却后开箱，得到白果黄酮和内酯0.78g，黄酮含量35％，内酯含量4.3％。
滤渣II用3L1～3％的氯化钠与0.2％的亚硫酸钠匀浆过滤，滤液静置，倾去上清液，沉淀用1％氯化钠洗涤三次，再用0.1％氢氧化钠洗涤依次，用纯化水洗涤3次，得到白果淀粉372.6g。
100g淀粉用1000mL水分散，加入13.0L 0.5mol/L氢氧化钠溶液，搅拌均匀，静置5min，加入3600mL 1％氯化钠，用盐酸中和至pH值6～7，室温放置15～20h，分层，上层为直链淀粉，下层为支链淀粉。直链淀粉粗提液加入正丁醇饱和的水溶液，常温搅拌1h，静置5h，，沉淀离心，沉淀物再用正丁醇饱和的水溶液，常温搅拌1h，静置5h，离心，沉淀物如此重复3～4次，所得沉淀物中加入乙醇洗涤，抽滤，干燥，得到直链淀粉28.2g。支链淀粉粗提液离心，得到沉淀物计入1％氯化钠，搅拌，放置，分层，弃去清夜，沉淀物如此重复3～4次，所得沉淀物中加入乙醇洗涤，抽滤，干燥，得到支链淀粉34.6g。

Claims (9)

1.一种白果活性成分的综合提取分离方法，其包括如下步骤：(1)脂溶性成分提取；(2)水溶性成分提取；(3)白果油的分离；(4)白果烷基酚酸的分离；(5)白果黄酮与内酯的分离；(6)白果多糖的分离；(7)白果蛋白的分离；(8)白果淀粉的提取分离。
2.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的脂溶性成分提取，白果装入超声提取釜中进行物料超声提取，合并各次收集的滤液，并将最后合并的滤液放置于旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，制备出白果脂溶性成分浸膏I和最后收集的滤渣I；
所述的超声提取溶剂为90～95％乙醇；
所述的料液比，第一次超声提取为1∶10～15(g∶mL)，第二次超声提取为1∶8～12(g∶mL)，第三次超声提取为1∶6～10(g∶mL)，第四次超声提取为1∶4～8(g∶mL)；
所述的超声发生方式，它激式超声发声装置，径向振动柱状换能器；
所述的超声波功率位1000W，超声频率位30～60KHZ；
所述的提取方式，间隔2min，超声作用一次，超声作用时间3min，总提取时间30min；
所述的提取温度：50～60℃；
所述的搅拌方式：气升式搅拌。
3.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的水溶性成分提取，滤渣I采用亚临界水提取，亚临界水提取装置中通入高纯氮气，以脱氧蒸馏水为萃取剂，料水比为1∶10～20(g∶mL)，提取温度100～150℃，提取时间30～60min，压力控制在3～10Mpa，得到含白果多糖和白果蛋白的萃取液及滤渣II，将得到含白果多糖和白果蛋白的萃取液离心，浓缩，醇沉，得到粗品，粗品用水溶解，加入叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，得到上相I、中相I和下相I；
所述的离心，以转速3000～5000r/min离心10～20min；
所述的浓缩，用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/3～1/10；
所述的醇沉，将含白果多糖和白果蛋白粗提浓缩液加入95～100wt％乙醇，使乙醇最终浓度为70～80wt％，搅拌均匀后，静置沉淀5～10h，抽滤，得到沉淀物，用无水乙醇洗涤1～3次，得到粗品；
所述的粗品用水溶解，将上述粗品加入去离子水溶解，配制成白果多糖和白果蛋白总浓度为30～50wt％的溶液，得到含糖和蛋白溶液；
所述的叔丁醇和硫酸铵构成三液相体系，含糖和蛋白溶液与叔丁醇体积比1∶1～1∶3，硫酸铵质量分数30～50wt％，温度35～40℃，时间30min，pH值7，得到上相I、中相I和下相I。
4.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的白果油的分离，将浸膏I加入石油醚回流提取四次，得到滤渣VI和滤液I～IV，滤液I～IV浓缩成浸膏II，将正己烷、乙醇和磷酸氢二钾水溶液按一定比例混和均匀，加入浸膏II中，搅拌均匀，静置一定时间后，分为三相，上相II、中相II和下相II，收集上相II，加入活性炭脱色，减压浓缩，得到白果油；
所述的提取温度60～100℃，提取时间60～90min；
所述的每次提取石油醚用量，5～10倍(mL∶g)；
所述的滤液I～IV，在压力为-(0.08～0.1)MPa，温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15，得到浸膏II；
所述的正己烷、乙醇和磷酸氢二钾水溶液的操作条件为正己烷-乙醇-磷酸氢二钾-水(10∶20∶20∶50，w/w/w/w)，白果脂肪油和白果烷基酚酸分别富集于三液相体系的上相II和中相II；
所述的活性炭脱色，加入3～5％(w/w)活性炭回流脱色30min，抽滤，收集滤液；
所述的浓缩，滤液在真空减压浓缩设备的浓缩压力为-(0.08～0.1)MPa，浓缩温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15。
5.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的白果烷基酚酸的分离，将收集的中相II在真空减压浓缩设备的浓缩压力为-(0.08～0.1)MPa，浓缩温度为30～60℃下，浓缩成相对比重1.10～1.15，得到白果烷基酚酸粗品；粗品中加入石油醚(60～90℃)溶解，加入碱液反应，分层，收集水相，酸化，沉淀，抽滤，水洗，干燥，溶解，脱色，浓缩，结晶，得到白果烷基酚酸精品；
所述的加入碱液反应，石油醚溶解液中，加入10～20wt％的碱液在60～90℃反应30～60min，反应液分层，收集水相；
所述的碱液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或甲醇钠中之一；
所述的水相，加入盐酸或硫酸调节pH值2～4，放置，产生沉淀，抽滤，滤饼用纯化水洗至抽滤液pH值7左右；
所述的干燥，将滤饼在温度40～50℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，得到干燥物；
所述的溶解、脱色，将干燥物加入3～5倍(w/w)石油醚(60～90℃)溶解，溶解液中按料液比0.1～0.5∶1(g∶mL)加入凹凸棒石吸附剂脱色；
所述的脱色液在真空度-(0.08～0.1)MPa，温度30～60℃下，浓缩至原体积1/3～1/4，放置，结晶，抽滤，结晶物以少量石油醚洗涤，在温度40～50℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，得到干燥物。
6.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的白果黄酮与内酯的分离，步骤(3)中所得的滤渣V用乙醇溶解，过滤，加30～45℃的温水均匀分散成50～100mg/mL的液体，以0.5mL/min的上样速度上样，静态吸附30～50min，梯度洗脱，收集洗脱液再次柱层析，洗脱液浓缩，干燥，得到白果黄酮和内酯；
所述的梯度洗脱，采用2.0～4.0BV的pH值5～7，温度15～25℃的纯化水洗涤，去除杂质，直至洗脱液清亮；
再用5～10wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分1，为强极性类化合物；
接着用20～40wt％的乙醇溶液2.0～5.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分2，为中等极性类化合物；
再用50～60wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分3，为中等极性类化合物；
最后用70～80wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分4，为弱极性类化合物；
再次上柱，合并组分2～3，浓缩除去乙醇，加水分散，使总黄酮和内酯总浓度在2.0～5.0mg/mL，经大孔树脂柱吸附，上柱流速为1.0～3.0BV/h，用纯化水在15～25℃下对大孔树脂进行洗脱，除去水溶性杂质，得吸附饱和的树脂柱，用70～80wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥；
所述的大孔树脂，AB-8、D101、D140、HPD100、LX-38、LSA-12S、LX-68、S-8、FL-2、DM130、X-5、D201、HZ806、LSA-5B和NAK-12中之一；
所述的浓缩、干燥，在温度50～60℃，真空度-(0.09～0.095)MP下，真空浓缩至固形物含量50～60％时放出物料，转移至真空干燥箱内进行干燥，真空干燥条件为箱内温度85～95℃，真空度-(0.096～0.099)MP，真空干燥6～8h，到时关闭热源，待箱体冷却后开箱。
7.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的白果多糖的分离，将步骤(2)中得到的下相I透析除去无机盐，水浴脱色，浓缩，醇沉，离心，干燥，得到白果多糖；
所述的水浴脱色，水浴温度控制在45～50℃，时长为90min，前60min以H2O2氧化法脱色，后30min以活性炭吸附法脱色，抽滤，收集滤液；
所述的离心，以转速3000～5000r/min离心10～20min；
所述的浓缩，用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/3～1/10；
所述的醇沉，将含白果多糖和白果蛋白粗提浓缩液加入95～100w％乙醇，使乙醇最终浓度为70～80wt％，搅拌均匀后，静置沉淀5～10h，抽滤，得到沉淀物，用无水乙醇洗涤1～3次，得到粗品；
所述的离心，以转速3000～5000r/min离心10～20min；
所述的干燥，所述的干燥，在温度50～60℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，制得白果蛋白。
8.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述的白果蛋白的分离，步骤(6)得到的中相I水浴脱色，浓缩，醇沉，离心，干燥，得到白果总蛋白，白果总蛋白以氯化钠溶液溶解，离心，清夜加入硫酸铵沉淀，所得沉淀透析，分离得到白果盐溶蛋白、球蛋白和清蛋白；
所述的水浴脱色，水浴温度控制在45～50℃，时长为90min，前60min以H2O2氧化法脱色，后30min以活性炭吸附法脱色，抽滤，收集滤液；
所述的浓缩，滤液用10～50kD截留分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/2～1/20；
所述的醇沉，加入无水乙醇，使乙醇的质量百分比浓度为75～85％，静置5～10h，以3000～5000r/min离心10～15min，得沉淀物，沉淀物以无水乙醇进行洗涤2～3次；
所述的干燥，在温度50～60℃，真空度-(85.7～93.6)KPa条件下，干燥5～10h，制得白果总蛋白；
所述的氯化钠溶液溶解，白果总蛋白中加入3～5倍(v/w)0.15～0.20mol/L氯化钠溶液，溶解后以3000～5000r/min离心10～15min，收集清夜；
所述的硫酸铵沉淀，清夜中加入硫酸铵，使其饱和度达到45～55％，析出蛋白，以3000～5000r/min离心10～15min，收集沉淀和清夜，沉淀为盐溶蛋白；清夜中加入硫酸铵，使其饱和度达到85～90％，析出蛋白，以3000～5000r/min离心10～15min，收集沉淀；沉淀经透析，得到清夜为球蛋白，透析得到的沉淀为清蛋白。
9.如权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中所述的白果淀粉的分离，步骤(2)中所得滤渣II用碱液匀浆提取，滤渣II用1～3％的氯化钠与0.2％的亚硫酸钠匀浆过滤，滤液静置，倾去上清液，沉淀用1％氯化钠洗涤三次，再用0.1％氢氧化钠洗涤依次，用纯化水洗涤3次，得到白果淀粉；
所得的淀粉用水分散，加入0.1～0.5mol/L氢氧化钠溶液，搅拌均匀，静置5min，加入1％氯化钠，用盐酸中和至pH值6～7，室温放置15～20h，分层，上层为直链淀粉，下层为支链淀粉；
所得的直链淀粉粗提液，加入正丁醇饱和的水溶液，常温搅拌1h，静置5h，离心，沉淀物再用正丁醇饱和的水溶液，常温搅拌1h，静置5h，离心，沉淀物如此重复3～4次，所得沉淀物中加入乙醇洗涤，抽滤，干燥；
所得的支链淀粉粗提液，离心，得到沉淀物加入1％氯化钠，搅拌，放置，分层，弃去清夜，沉淀物如此重复3～4次，所得沉淀物中加入乙醇洗涤，抽滤，干燥。
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