CN102416027A - 银杏活性成分萃取分离方法及萃取的活性物质在治疗心脑血管疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏活性成分萃取分离方法及萃取的活性物质在治疗心脑血管疾病药物中的应用。包括如下步骤：1)银杏干叶磨粉，提取银杏叶活性成分黄酮类和萜内酯类化合物；2)去除银杏酚酸；3)分离银杏黄酮与内酯；4)高效液相色谱法纯化内酯。利用提取的高纯度银杏内酯药物分别在器官水平、大体水平和细胞水平其对成年大鼠和老年大鼠的心功能试验，首次证明白果内酯对SD成年大鼠及SD老年大鼠皆有心脏保护作用。其优点：利用高效液相色谱法制备出纯度大于98％的4种内酯。成功的把银杏叶提取物中银杏酸含量控制在1ppm以内，实现了黄酮与内酯的分离，分离后银杏黄酮的含量达到55％以上，银杏内酯含量达到25％以上，达到国际标准。

Description

银杏活性成分萃取分离方法及萃取的活性物质在治疗心脑血管疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及从植物中提取有效成分的方法，具体是从银杏叶中提取有效活性成分黄酮类和萜内酯类化合物的方法，及利用有效提取物银杏内酯研究其对机体血压、心脏血流动力学及单个心肌细胞收缩力的影响，属中药技术制备领域。 

背景技术

心脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病，其发病率和死亡率有逐年增加的趋势，无论在我国还是西方发达国家，均已超过肿瘤而居于人类死因的首位。 

银杏叶制剂的有效成份主要为黄酮及萜内酯类，简称银杏叶提取物(GbE)，萜内酯化合物可以再分为银杏内酯和白果内酯(Bilobalide)，银杏内酯再分为A、B、C、J、M五种，白果内酯仅一种。银杏酸是银杏叶提取物毒性作用的因素，这些毒性作用包括胃肠道副作用、头痛、皮肤刺激和水肿，已有多例在接触银杏叶或果实后出现过敏反应的报告。 

从技术先进性角度来看，银杏叶制剂至今已经历了大约五个发展阶段，即第一代将银杏叶烘干，粉碎原生药压片；第二代将银杏叶用水提取后浓缩成膏，然后烘干、治粒压片，但对其中的主要有效成分银杏黄铜和银杏内酯没有进行控制；第三代在第二代的基础上对主要有效成分银杏黄酮和银杏内酯进行定性控制，但无有害成分银杏酸含量标示；第四代控制有效成分银杏黄酮在44％以上，银杏内酯在6％以上，有害成分银杏酸控制在5ppm以下。中国药有效成分银杏黄酮在24％以上，银杏内酯在6％以上，有害成分银杏酸控制在10ppm以下；第五代控制典2010版要求银杏叶提取物中含总黄酮醇苷不得少于24％，含总内酯不得少于6％，银杏酸含量小于10ppm；美国药典对此要求是总黄酮醇苷为22-27％，含总内酯为5.4-12％，银杏酸含量小于10ppm；德国药典对此要求是总黄酮醇苷为22-27％，含总内酯为5-7％，银杏酸含量小于10ppm。由此可见，控制好总黄酮 醇苷、总内酯和银杏酸的含量是银杏叶提取物质量的关键因素。 

银杏叶提取物主要药理作用有：黄酮甙作为一种高效抗氧化物能清除自由基，抑制脂质过氧化；银杏内酯可拮抗血小板因子引起的血小板聚集、微血栓的形成，还可改变血液流变学，降低血液粘度，改变微循环障碍；增加5-羟色胺的传送，对脑部血液循环及脑细胞代谢有改善和促进作用；目前临床上主要用于：1)防治冠心病、心绞痛、心肌梗死；2)防治脑血栓、脑血管痉挛，脑外伤后遗症；3)改善老年人记忆力衰退和信息处理速度的降低问题；延缓早老性痴呆的发生；4)缓解眩晕、耳鸣和因血流减少所致的视力和听力衰退。 

DE-A3338995和相关美国专利号4,571,407使用白果内脂，一种结构与银杏内酯相关的倍半萜内酯治疗脑病，脑水肿，脱鞘神经病和脊髓病，在中脑动脉闭合前使用白果内酯在梗塞部位，皮质和梗塞面积明显减小。美国专利号5,264,216采用白果内酯能治疗下列病菌的某些感染：阴道毛滴虫、大肠杆菌、乳酸杆菌、卡氏肺囊虫、金黄色葡萄球菌、类链球菌。银杏叶提取物具有扩张冠状动脉和脑血管作用，能够改善微循环，促进心脑组织代谢，临床上使用银杏叶制剂治疗心血管疾病已经多年，例如可以治疗高血压等心血管病，治疗机制不是十分清楚。 

发明内容

本发明提供一种银杏活性成分萃取分离方法，减少有毒有机溶剂的使用，提高有效成分得出率、各单体纯度。 

本发明的技术方案如下：本发明从干银杏叶中提取分离有效成分方法的步骤如下：

1)银杏叶活性成分黄酮类和萜内酯类化合物的提取：银杏干叶磨粉，用70％乙醇以7倍量微沸提取两次，每次提取2小时，减压回收乙醇，水沉，过DA101大孔树脂柱，水洗，40％乙醇溶液以1BV/h的速度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥粉碎即得银杏叶提取物。所得银杏叶提取物总黄酮和总内酯含量分别在24％和6％以上。 

2)、去除银杏酚酸：采用溶剂法或树脂法； 

溶剂法：将步骤1)所得洗脱液，调节pH值为5，以石油醚为萃取剂萃取5 次，取水相，加一半体积95％乙醇减压蒸馏，即得低酸银杏叶提取物； 

树脂法：银杏叶提取物粉末50％乙醇溶解(乙醇的用量以刚好使得银杏叶提取物全溶)，盐酸调节pH为5，过AB-8柱70％乙醇洗脱，水沉10h取清液，浓缩干燥粉碎，得低酸银杏叶提取物。 

3)、银杏黄酮与内酯的粗分离：采用溶剂法或树脂法； 

溶剂法粗分离黄酮与内酯方法是：取银杏叶提取物，少量乙醇溶液溶解，缓慢加入有机溶剂正丁醇，过滤，取滤液，3％氨水溶液洗涤，浓缩回收有机相，酸化，减压干燥得内酯；减压蒸发弱碱洗涤液，盐酸酸化，结晶，减压干燥结晶，干燥结晶，得黄酮。 

树脂法粗分离黄酮与内酯方法是：将银杏叶提取物用20％乙醇溶解，调节PH值为4.5，过聚酰胺树脂柱，先以蒸馏水洗柱20min，速率1BV/h，分别以10％和60％的乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，蒸发干燥，分别得黄酮与内酯。 

4)纯化内酯即银杏内酯的族分离：利用高效液相色谱法纯化内酯：流动相选择体积比为55∶40∶5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂，流速为26ml/min，上样量为120mg。 

本发明上述方法制备出纯度大于98％的4种内酯；银杏叶提取物中银杏酸含量控制在1ppm以内，达到了国际标准；分离后银杏黄酮的含量达到55％以上，银杏内酯含量达到25％以上。 

本发明所提取的高纯度银杏内酯在治疗心脑血管疾病药物中的应用。 

本发明的有益效果是：本发明利用高效液相色谱法制备出了纯度大于98％的4种内酯。成功的把银杏叶提取物中银杏酸含量控制在1ppm以内，实现了黄酮与内酯的分离，分离后银杏黄酮的含量达到55％以上，银杏内酯含量达到25％以上，达到了国际标准。 

附图说明

图1-1是白果内酯对SD大鼠动脉血压的影响； 

图1-2是白果内酯对SD大鼠收缩压的影响； 

图1-3是白果内酯对SD大鼠舒张压的影响； 

图1-4是白果内酯对SD大鼠脉压的影响； 

图1-5是白果内酯对SD大鼠平均动脉压的影响； 

图1-6是白果内酯对SD大鼠心率的影响； 

图2-1是白果内酯对老年SD大鼠收缩压的影响； 

图2-2是白果内酯对老年SD大鼠舒张压的影响； 

图2-3是白果内酯对老年SD大鼠脉压的影响； 

图2-4是白果内酯对老年SD大鼠平均动脉压的影响； 

图2-5是白果内酯对老年SD大鼠心率的影响； 

图3-1是白果内酯抑制SD大鼠离体心脏血流动力学趋势； 

图5-3是白果内酯对心肌细胞收缩的抑制作用具有剂量依赖性； 

图6-1是单个游离老年心肌细胞在加入白果内酯前后心肌收缩幅度的变化。 

具体实施方式

以下结合具体实施例来说明本发明的技术方案，但不限制本发明的保护范围。 

实施例1： 

1)将银杏干叶粉碎，取银杏叶粗粉(粒度Φ0.8-2.0mm)100g，70％乙醇以7倍量微沸提取2次，每次提取2h，提取物质量为40.1g，对黄酮和内酯的提取率分别为80.8％和77.2％ 

2)取银杏叶乙醇提取滤出液约1000ml，减压蒸馏回收乙醇，水沉过滤，以1BV/h流速上质量为500g大孔树脂D101吸附柱，1000ml水洗柱，然后用质量分数70％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，蒸发至干，所得粗提取物总黄酮纯度达到25.6％，总内酯纯度达到6.3％。 

3)萃取法除酸，取实验所得大孔树脂洗脱液200ml，浓缩，以质量分数1％盐酸调节pH值至5.12，用石油醚萃取5次，取水相，加一半水相体积95％乙醇减压蒸馏，得浸膏，检测银杏酚酸含量为0.99ppm。 

4)银杏黄酮与内酯的粗分离 

取银杏叶提取物50g，少量乙醇溶液溶解，对应加入5倍质量正丁醇，过滤， 取滤液，质量分数3％氨水洗涤洗涤，浓缩回收有机相，酸化，减压干燥得内酯；减压蒸发弱碱洗涤液，盐酸酸化，结晶，干燥结晶，得黄酮。药典法检测黄酮和内酯的含量分别为58.66％和27.30％。 

5)纯化内酯 

实验室自制的银杏内酯粗提物，精制后，总内酯含量约为50％，其中BB、GA、GB、GC含量约为15.5％，14.5％，8.6％，11.8％。银杏内酯精制过程：银杏叶提取物粉末(总黄酮＞24％，总银杏内酯＞6％)3倍量50％乙醇溶解，过聚酰胺柱，10％乙醇洗脱，浓缩洗脱液，5倍水稀释，正丁醇萃取2次，质量分数5％乙酸钠溶液洗涤2次，取有机相浓缩得银杏内酯精制浸膏。 

取银杏精制浸膏以体积比为55∶40∶5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇混合溶液超声溶解，经0.45μm滤膜抽滤后进样，上样量为120mg，流动相流速为26ml/min，进行高效液相制备色谱分离。按制备型色谱条件洗脱，根据蒸发光散射检测器的检测信号在线收集产品流出液，各流出液经旋转薄膜蒸发器浓缩去溶剂后，将固体粉末进行重结晶。BB、GC用无水乙醇，GA、GB用质量分数95％乙醇溶液重结晶纯化。银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯经过一次重结晶纯度分别为：98.7％、98.4％、98.4％、98.5％。 

实施例2(应用试验)： 

(一)成年大鼠大体水平的研究 

成年SD大鼠(由徐州医学院实验动物中心提供)，体重200～250g，雌雄不拘，月龄4～6月，随机分为4组(每组7-11只)。生理盐水组；DMSO对照组；白果内酯组；心得安组。腹腔注射10％的水合氯醛4ml/kg麻醉大鼠。经颈总动脉插管，连接压力换能器，与MedLab-U/4C501生物信号采集处理系统相连接。白果内酯(纯度达98.5％)用DMSO溶液配置，每次加入DMSO的量不超过1‰，以2mg/kg的白果内酯10-2mol/L浓度经股静脉注射给药；心得安(购自Sigma公司)以生理盐水配制，以0.3mg/kg的心得安1μmol/L浓度经股静脉注射给药。以MedLab-U/4C501生物信号采集处理系统记录大鼠收缩压、舒张压及心率变化。 

结果：经股静脉给药后，SD大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压迅速降低，、心率迅速减慢，脉压升高，以后缓慢恢复正常。记录2分钟以内收缩压、舒张压、 平均动脉压、心率下降最低值(5s之内平均值)统计如下：白果内酯对SD大鼠动脉血压的影响，见图1-1。 

以下各图^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01。 

(1)白果内酯对SD大鼠收缩压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，收缩压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组作统计学比较，收缩压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组作统计学比较，不存在显著性差异；白果内酯对SD大鼠收缩压的影响，见图1-2。 

(2)白果内酯对SD大鼠舒张压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，舒张压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，舒张压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD大鼠舒张压的影响，见图1-3。 

(3)白果内酯对SD大鼠脉压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，脉压明显升高，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，脉压明显升高，P＜0.05，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD大鼠脉压的影响，见图1-4。 

(4)白果内酯对SD大鼠平均动脉压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，平均动脉压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，平均动脉压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD大鼠平均动脉压的影响，见图1-5。 

(5)白果内酯对SD大鼠心率的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，SD大鼠心率明显减慢，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，SD大鼠心率明显减慢，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对SD大鼠心率的影响，见图1-6。 

结论：本研究结果表明，白果内酯对麻醉状态SD大鼠有降低收缩压、舒张压、平均动脉压作用，脉压增大，减慢心率作用。 

(二)老年大鼠大体水平的研究 

老年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重(500～600)g，月龄18个月以上，选取收缩压＞115mmHg的SD大鼠(高血压模型)，雌雄不拘。实验方法与成年SD大鼠研究方法相同。 

结果：经股静脉给药后，老年SD大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压迅速降低，心率迅速减慢，脉压升高，以后缓慢恢复正常。记录2min以内收缩压、舒张压、平均动脉压、心率下降最低值(5s之内平均值)统计如下：以下各图^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01。 

(1)白果内酯对老年SD大鼠收缩压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠收缩压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组作统计学比较，老年SD大鼠收缩压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组作统计学比较，不存在显著性差异；白果内酯对老年SD大鼠收缩压的影响，见图2-1。 

(2)白果内酯对老年SD大鼠舒张压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠舒张压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，老年SD大鼠舒张压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对老年SD大鼠舒张压的影响，见图2-2。 

(3)白果内酯对老年SD大鼠脉压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠脉压明显升高，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，老年SD大鼠脉压明显升高，P＜0.05，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对老年SD大鼠脉压的影响，见图2-3。 

(4)白果内酯对老年SD大鼠平均动脉压的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠平均动脉压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较， 老年SD大鼠平均动脉压明显下降，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。(4)白果内酯对老年SD大鼠平均动脉压的影响，见图2-4。 

(5)白果内酯对老年SD大鼠心率的影响 

给药后，白果内酯组与生理盐水组(对照组)作统计学比较，老年SD大鼠心率明显减慢，P＜0.01，存在显著性差异；心得安组与生理盐水组比较，老年SD大鼠心率明显减慢，P＜0.01，存在显著性差异；白果内酯组与心得安组比较，不存在显著性差异。白果内酯对老年SD大鼠心率的影响，见图2-5。 

结论： 

本研究结果表明，白果内酯对麻醉状态老年SD大鼠有降低收缩压、舒张压、平均动脉压作用，脉压增大，减慢心率作用。 

(三)成年大鼠器官水平的研究 

成年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重200～250g，雌雄不拘，月龄4～6月。 

腹腔注射3％戊巴比妥钠(40mg·kg^-1)麻醉，迅速取出大鼠心脏，剪去左心耳，置于Langendorff灌流装置上，行主动脉逆行灌注Krebs Henseleit(K H)液(NaCl 119.1mmol/L，KCl 4.7mmol/L，MgSO₄0.94mmol/L，KH₂PO₄1.2mmol/L，NaHCO₃25.0mmol/L，葡萄糖11.5mmol/L，VitC0.1mmol/L，用前10～15min通95％O₂+5％CO₂混和气，平衡pH至7.4)，37℃恒温，8ml/min恒流灌注。经房室瓣插入带球囊的心导管抵左室，充盈球囊使左心室舒张末压小于10mmHg。接压力换能器并输入计算机，记录心脏收缩期左心室峰压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)和心率(HR)。平衡30min后，测定(K H)液灌流60min及给药罐流60min。 

结果 

白果内酯抑制SD大鼠离体心脏血流动力学趋势，见图3-1。 

(1)白果内酯与对照组比较，抑制SD大鼠离体心脏HR，统计学处理P＜0.01，存在显著性差异。(2)白果内酯与对照组比较，抑制SD大鼠离体心脏LVSP，统计学处理P＜0.01，存在显著性差异。(3)白果内酯与对照组比较，提高SD大鼠离体心脏LVEDP，统计学处理P＜0.01，存在显著性差异。见表3-1；^*表示 P＜0.05；^**表示P＜0.01。 

表3-1白果内酯对大鼠心脏血流动力学的影响 

结论 

血流动力学变化是心脏泵血功能的主要反映，白果内酯可以使心脏LVSP下降，LVEDP增高，表明心肌收缩功能减弱，心脏射血减少，致使舒张末期容积增加，进而引起心室扩张和舒张末期压力升高。 

(四)老年大鼠器官水平的研究 

老年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重(500～600)g，月龄18个月以上，选取收缩压＞115mmHg的SD大鼠(高血压模型)，雌雄不拘。 

实验方法与(三)成年鼠相同。 

结果 

(1)白果内酯与对照组比较，对SD大鼠离体心脏HR和LVSP影响不显著。 

(2)白果内酯与对照组比较，提高SD大鼠离体心脏LVEDP，统计学处理P＜0.05，存在显著性差异。(3)白果内酯与对照组比较，抑制SD大鼠离体心脏+dp/dtmax，统计学处理P＜0.05，存在显著性差异。(4)白果内酯与对照组比较，抑制SD大鼠离体心脏-dp/dtmax，统计学处理P＜0.05，存在显著性差异。见表4-1；^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01。 

表4-1白果内酯对老年大鼠心脏血流动力学的影响 

结论： 

白果内酯可以使心脏+dp/dtmax和-dp/dtmax下降，LVEDP增高，表明心肌收缩速度下降，舒张速率下降，射血量减少，舒张末期容积增加。白果内酯对老年大鼠影响比较青年大鼠作用要弱。 

(五)成年大鼠细胞水平的研究 

成年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重200～250g，雌雄不拘，月龄4～6月。 

实验方法： 

1心肌细胞分离与培养 

(1)取SD大鼠，腹腔注射5000U/Kg的肝素，10min后，用1％戊巴比妥钠麻醉，迅速开胸取心脏，立即放入冰冷的氧饱和的无钙液中。(2)悬挂心脏于Langendorff灌注装置上。经主动脉逆行灌流无钙液，5min后换酶液循环灌流20～30min。(3)当心脏变得松软，将心脏剪下置入KB液中，剪去心房和基底部组织，将心室组织剪成约1mm×1mm×1mm碎块，用粗开口吸管轻轻吹打，就可见单个细胞和细胞团脱落，然后用200目的尼龙网过滤，滤液于室温下静置20min，让细胞自然沉降，去上清，再加入KB液自然沉降，反复3次，然后将细胞在室温下静置1h待用。(4)细胞计数后，把细胞接种于12孔培养板中，每孔约2×104个细胞，置于CO₂培养箱中悬浮培养，培养基为无血清的高糖DMEM。 

2心肌细胞形态和存活率的观察形态观察：把分离或培养的心肌细胞涂片，在倒置显微镜下观察心肌细胞的形态结构。存活率计算：用血细胞计数板计数全部细胞，来计算收获量；再选取数个视野计算长杆状细胞与全部细胞的数量。长 杆状心肌细胞百分比＝(长杆状细胞数量÷全部细胞数量)×100％。 

3心肌细胞收缩功能的测定用刺激器对细胞进行刺激(0.5Hz，37℃)，选择那些横纹清晰、胞膜完整、长杆状的心肌细胞(放大400倍后)分析其收缩的状况，用计算机保存单个心肌细胞的收缩结果。最后用心肌细胞收缩软件分析，可得到心肌细胞收缩幅度的变化，心肌细胞收缩幅度＝〔(心肌细胞舒张长度-收缩末长度)心肌细胞静息长度)×100％。 

结果观察并记录了单个游离心肌细胞在加入白果内酯前后心肌收缩幅度的变化。结果显示，2μmol/L白果内酯、5μmol/L白果内酯、10μmol/L白果内酯均能显著抑制大鼠心肌细胞收缩(n＝11-16)，10μmol/L白果内酯使心肌细胞收缩幅度从加药前的9.83％降至加药后的6.61％最为显著，图6-3。剂量效应反应曲线表明，白果内酯对心肌细胞收缩的抑制作用具有剂量依赖性；图5-3。 

结论：白果内酯能够显著抑制成年SD大鼠心肌细胞收缩作用，对心肌细胞收缩的抑制作用具有剂量依赖性 

(六)老年大鼠细胞水平的研究 

老年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重(500～600)g，月龄18个月以上，收缩压＞115mmHg的高血压SD大鼠(高血压模型)，雌雄不拘。实验方法：与成年鼠相同。 

结果 

我们观察并记录了单个游离老年心肌细胞在加入白果内酯前后心肌收缩幅度的变化。结果显示，10μmol/L白果内酯显著抑制大鼠心肌细胞收缩，心肌细胞收缩幅度从加药前的8.99％降至加药后的6.45％(n＝16-17，P＜0.05)见图6-1。 

结论：10μmol/L白果内酯能够显著抑制老年SD大鼠心肌细胞收缩作用。 

(七)酶的测定 

成年SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，体重200～250g，雌雄不拘，月龄4～6月。 

随机分为2组(每组8～11只)。生理盐水组(对照组)、白果内酯组。腹腔注射10％的水合氯醛4ml·kg^-1麻醉大鼠。经颈总动脉插管，连接压力换能器，与MedLab-U/4C501生物信号采集处理系统相连接。白果内酯用DMSO溶液配置，每次加入DMSO的量不超过1‰，以2mg/kg的白果内酯10^-2mol/L浓度经 股静脉注射给药。 

成年SD大鼠给药前后各抽取2ml血液，采用比色法测定血清丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxidedis mudase，SOD)活性。操作按试剂盒说明书进行，用752-C型分光光度计测定吸收光度。SOD：波长550nm测定；MDA：波长532nm测定. 

结果 

表7-1白果内酯对SD大鼠血浆中SOD活性及MDA含量的影响(n＝10， 

注：▲与对照组比较^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01 

白果内酯显著提高血浆中超氧化物岐化酶(SOD)活性，P＜0.01；白果内酯降低血浆中MDA浓度，P＜0.05。 

结论：白果内酯提高SD大鼠血浆中超氧化物岐化酶(SOD)活性，降低血浆中MDA浓度。文献报道，提高SD大鼠血浆中超氧化物岐化酶(SOD)活性，可以清除高血压患者由于血压升高，血管灌流不足，导致机体组织缺血产生大量的超氧阴离子、羟自由基、过氧化脂质(Lipoperoxides，LPO)和MDA等活性毒副物质，降低血压使血压恢复正常。 

Claims (4)

1.一种银杏活性成分的萃取分离方法，以干银杏叶为原料制取，包括以下工艺步骤：

1)银杏叶活性成分黄酮类和萜内酯类化合物的提取：银杏干叶磨粉，用70％乙醇以7倍量微沸提取两次，每次提取2小时，减压回收乙醇，水沉，过DA101大孔树脂柱，水洗，40％乙醇溶液以1BV/h的速度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥粉碎即得银杏叶提取物；

2)去除银杏酚酸：采用溶剂法除酸，所述溶剂法除酸是：浓缩步骤1)所得洗脱液，调节pH值为5，以石油醚为萃取剂萃取5次，取水相，加一半水相体积的95％乙醇减压蒸馏，即得低酸银杏叶提取物；

3)银杏黄酮与内酯粗分离：采用溶剂法分离；所述溶剂法分离黄酮与内酯是：取银杏叶提取物，用乙醇溶液充分溶解，缓慢加入有机溶剂正丁醇，过滤，取滤液，用3％氨水溶液洗涤，浓缩回收有机相，酸化，减压干燥得内酯；减压蒸发弱碱洗涤液，盐酸酸化，结晶，减压干燥结晶，干燥结晶，得黄酮；

4)纯化内酯，即银杏内酯的族分离：利用高效液相色谱法纯化内酯：流动相选择体积比为55∶40∶5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂，流速为26ml/min，上样量为120mg。

2.根据权利要求1所述的银杏活性成分的萃取分离方法，其特征在于步骤2)去除银杏酚酸还可以采用树脂法除酸，具体为：银杏叶提取物粉末50％乙醇溶解(乙醇的用量以刚好使得银杏叶提取物全溶)，盐酸调节pH为5，过AB-8柱70％乙醇洗脱，水沉10h取清液，浓缩干燥粉碎，得低酸银杏叶提取物。

3.根据权利要求1所述的银杏活性成分的萃取分离方法，其特征在于步骤3)银杏黄酮与内酯粗分离还可以采用树脂法分离，具体方法是：将银杏叶提取物用20％乙醇溶解，调节pH值为4.5，过聚酰胺树脂柱，先以蒸馏水洗柱20分钟，速率1BV/h，分别以10％和60％的乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，蒸发干燥，分别得黄酮与内酯。

4.本发明所提取的高纯度银杏内酯在治疗心脑血管疾病药物中的应用。

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