CN109512901A - 了哥王提取物及其在制备镇痛抗炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种了哥王提取物，其主要提取方法为：将了哥王根茎粗粉用50％～70％的乙醇在超声条件下提取，得到乙醇提取液；将乙醇提取液浓缩至无醇味的膏体后，用水稀释，加入乙酸乙酯萃取，分离，得到乙酸乙酯萃取物和剩余液A，将乙酸乙酯萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物A；在剩余液A中加入正丁醇萃取，分离，得到正丁醇萃取液，将正丁醇萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物B；合并萃取物A和萃取物B，即得到所述了哥王提取物。与常规的煎煮法以及乙醇提取法相比，本发明的了哥王提取物提取率高，提取速度快，适合工业化生产，而且毒副作用低，更具有良好的镇痛抗炎效果。

Description

了哥王提取物及其在制备镇痛抗炎药物中的应用
技术领域
本发明属于中草药领域，尤其涉及了哥王提取物及其在制备镇痛抗炎药物中的应用。
背景技术
中草药为自然的产物，保持了其自然结构和活性，是经过几千年筛选后保留下来的，被誉为中华民族优秀文化的瑰宝，用现代科学的方法研究中药抗炎作用及机理是当今世界新药开发的热点之一。中药的药理研究，一直在药理学中占有重要的地位，并已经取得了许多成就。许多中草药，如白芍、柴胡、连翘等及其有效化学成分如生物碱、黄酮、皂苷、萜类、香豆素、挥发油、及糖蛋白类等都具有抗炎作用。与单味抗炎药相比，中草药或其提取物抗炎药更能从多种途径纠正机体的病理状态，维持内环境的稳定，抗菌、消炎作用明显，且毒副作用小。
了哥王为瑞香科植物了哥王(Wikstromia indica(L.)C.A.Mey.)的干燥根或根皮，又名南岭荛花、地棉皮、九信菜、雀仔麻、山雁皮等。了哥王具有清热解毒，散结逐淤，消肿止痛之功效。在临床上常用于治疗流行性感冒、上呼吸道感染、急慢性支气管炎、急性扁桃体炎以及慢性肝炎、肝硬化与多种癌症的辅助治疗。但是未经炮制或者提取的了哥王是有一定毒性的，在历代本草中均有记载，如《岭南采药录》就有“其性味苦寒、微辛、有毒”的记载。虽然该药疗效确切，但因其毒性较大临床应用受到一定的限制。通过炮制或者提取是降低其毒性的有效方法。
经研究报道，了哥王的主要成分为香豆素类、木脂素类、黄酮类、挥发油，此外还含有酸、醇或酯类、醌类、甾体类、萜类、二芳基庚烷类等化合物，包括5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮、山奈酚、南荛苷、芜花素、小麦黄素、荛花三香豆素、西瑞香素、伞形花内醋、牛芳苷元、罗汉松树脂酚、松脂酚、南荛酚、β-谷甾醇、胡萝卜甾醇、7-酮基-β-7基谷甾醇、豆甾烷-3,7-二醇、5-豆甾烯-3β，7a-二醇、了哥王多糖体-1、灰绿曲霉酰胺等几十种化学成分。
目前，了哥王的临床应用大多以煎剂为主，即用水煎煮，但本发明人经过大量的研究发现了哥王的大多有效成分不仅不易溶于水，导致提取率低，而且其中的很多有效成分容易被热破坏。中国专利CN201210094476公开了一种了哥王胶囊，其主要是通过乙醇回流提取和大孔树脂纯化的方式获得了哥王提取物，该提取方法耗时长，有效成分提取率低，而且依然存在一定程度的毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于：通过研究和试验不同的提取方法，以得到提取率高、提取速度快、毒副作用低、且具有明显镇痛抗炎效果的了哥王提取物。
本发明目的通过以下方案实现：
一种了哥王提取物，其制备方法如下：
(1)将了哥王根茎粗粉置于容器中，加入8～10倍量的50％～70％的乙醇，在超声条件下提取15～45分钟，得到乙醇提取液；
(2)将步骤(1)所得的乙醇提取液浓缩至无醇味的膏体后，用5～8倍量的水稀释得到稀释液，加入体积比1:1的乙酸乙酯萃取0.5～2小时，分离，得到乙酸乙酯萃取物和剩余液A，将所述乙酸乙酯萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物A；
(3)在步骤(3)所得的剩余液A中加入体积比1:1的正丁醇萃取0.5～2小时，分离，得到正丁醇萃取液，将所述正丁醇萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物B；
(4)合并步骤(2)所得的萃取物A和步骤(3)所得的萃取物B，即得到所述了哥王提取物。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(1)为加入8倍量的55％的乙醇，在超声条件下提取30分钟。
本发明还提供了上述了哥王提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。
本发明还提供了一种抗炎镇痛药物，其包括上述了哥王提取物。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物为口服制剂。
按医疗、制剂不同要求及药材自身性质，对单味药材进行加工处理是现代医学的重要组成部分。提取的目的是降低某些中药的毒性，或者提高某些药物的治疗效果。了哥王属有毒药材，虽药理作用广泛、疗效确切，但应用不慎会引发安全性问题。中草药的提取方法对生药化学成分有着较大的影响，或是使某些成分的溶解度和浸出量发生变化，或是导致某些成分消失或转化、生成新的化学成分，所以提取过程对于中草药的应用非常重要。了哥王提取时一定要注意去毒与存效并重，不可偏废，否则，顾此失彼，可能造成毒去效失，甚至效失毒存的结果，达不到临床应用的目的。
经过检测，本发明的了哥王提取物中至少含有黄酮类成分，包括柚皮素、二氢黄酮、芫花素、槲皮素、槲皮苷、双黄酮类化合物等；香豆素类成分，包括伞形花内酯、西瑞香素、西瑞香素葡萄糖苷、荛花三豆香素等；木脂素类成分；酚羟基类成分；胡萝卜苷；谷甾醇等。经过试验，本发明的了哥王提取物具有良好的镇痛抗炎效果，而且毒副作用低。正是由于抗炎镇痛效果明显且毒副作用低，因此可以开发制备成为口服制剂。此外，与现有的煎煮法以及乙醇提取法相比，本发明的了哥王提取物提取率高，提取速度快。正是由于提取率高，且提取速度快，可以应用于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未详细注明的实验条件和操作，通常按照本领域常规的实验条件和操作进行。
实施例1：
(1)将洗净的了哥王根皮干燥后粉碎，过10目筛，得了哥王茎皮粗粉；
(2)称取了哥王粗粉2kg，置于容器中，加入8倍体积的55％(体积分数)的乙醇超声提取30分钟，放置冷却；
(3)过滤，滤液进行减压蒸馏，浓缩至没有醇味，得到了哥王乙醇提取物浸膏，用8倍量的水稀释得到稀释液，加入体积比1:1的乙酸乙酯，萃取0.5小时，分离，得到乙酸乙酯萃取物和剩余液，将乙酸乙酯萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物A50.8g；
(4)在步骤(3)所得的剩余液中加入体积比1:1的正丁醇，萃取0.5小时，分离，得到正丁醇萃取液，将正丁醇萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物B 105.8g；
(5)合并步骤(2)所得的萃取物A和步骤(3)所得的萃取物B，即得到了哥王提取物。
实施例2：
实施例2的方法步骤同于实施例1，只是步骤(2)中采用了95％的乙醇进行提取。最后得到萃取物A37.3g，萃取物B 78.8g。
实施例3：
实施例3的方法步骤同于实施例1，只是步骤(2)中采用了75％的乙醇进行提取。最后得到萃取物A43.5.8g，萃取物B 85.4g。
实施例4：
实施例4的方法步骤同于实施例1，只是步骤(2)中不采用超声形式，而是采用回流的形式。最后得到萃取物A 32.3g，萃取物B 59.8g。
实施例5：
实施例5的方法步骤同于实施例1，只是步骤(2)超声的时间为1小时。
此外，发明人采用高效液相色谱法测定实施例1～5中了哥王萃取物中的代表性物质西瑞香素和总黄酮的含量，结果如下：
表1：西瑞香素和总黄酮含量测定
实施例 西瑞香素含量(g) 总黄酮含量(g)
实施例1 2.6 102.8
实施例2 1.9 71.5
实施例3 2.0 95.8
实施例4 1.5 65.7
实施例5 2.76 104.4
本发明人在研究中发现，最初的乙醇提取过程对于提取物最后的得率以及最终的药效有比较大的影响，在乙醇的浓度选择上，发现55％左右的乙醇的提取效率最佳，可能该浓度范围对药材细胞渗透能力较好，且有效成分的溶解性能较好。另外，超声方式相对于回流方式，可以明显提高提取物的得率和有效性。延长超声时间后，提取物的得率和有效性略有增加，不过考虑到成本和效率，超声时间30分钟比较适宜。
实施例6：
(1)称取了哥王粗粉2kg，置于容器中，加入8倍体积的55％的乙醇超声提取30分钟，放置冷却；
(2)过滤，滤液进行减压蒸馏，浓缩至没有醇味，得到了哥王乙醇提取物浸膏；
(3)真空干燥，得到乙醇提取物340g。
也就是说，与实施例1相比，不进行后续的乙酸乙酯和正丁醇萃取步骤，只是获得乙醇提取物。
实施例7：
(1)称取了哥王粗粉2kg，置于容器中，加入乙酸乙酯回流提取3小时；
(2)过滤，滤液进行减压蒸馏，真空干燥，得到乙酸乙酯提取物20.4g。
也就是说，与实施例1相比，直接采用乙酸乙酯进行萃取，不进行前期的乙醇提取。
实施例8：
(1)将洗净的了哥王根皮干燥后粉碎，过10目筛，得了哥王茎皮粗粉；
(2)称取了哥王粗粉2kg，置于容器中，加入8倍体积的55％(体积分数)的乙醇超声提取30分钟，放置冷却；
(3)过滤，滤液进行减压蒸馏，浓缩至没有醇味，得到了哥王乙醇提取物浸膏，用8倍量的水稀释得到稀释液，加入体积比1:1的乙酸乙酯，萃取0.5小时，分离，挥干溶剂，干燥，得到乙酸乙酯萃取物16.2g；
也就是说，与实施例1相比，实施例8不进行正丁醇的萃取。
实施例9：抗炎效果检测
选NIH雌性小鼠90只，体重20g左右，随机分为6组，每组15只，即空白对照组(0.9％生理盐水，20ml/kg)，实施例1了哥王提取物组，实施例6了哥王提取物组，实施例7了哥王提取物组，实施例8了哥王提取物组和阳性对照组(吲哚美辛，0.2g/kg,20ml/kg)。
动物的喂养条件：清洁通风环境，湿度50±5％，室温23±1℃，光照周期为12小时，水食自取。
实施例1了哥王提取物组，实施例6了哥王提取物组，实施例7了哥王提取物组、实施例8了哥王提取物组用蒸馏水配成混悬液(根据各自的提取率，各自配置成对应等量生药的浓度)。
小鼠连续灌胃给药4天,每天1次，实验前小鼠禁食不禁水12h。于末次给药后60min用二甲苯(0.02m1/只)均匀涂在每只小鼠右耳正反两面致炎，左耳不涂作对照，致炎后30min脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径9mm的打孔器在相同位置取左右两耳片。于分析天平上称重，计算左耳片和右耳片重量的差值(肿胀度)及抑制率。计算均数与标准差，比较组间差异。
肿胀度(mg)＝左耳片重-右耳片重
通过观察可见，各实验组小鼠右耳，经二甲苯涂布后，迅速有不同程度变红、变大现象，鼠耳部分血管清晰可见。实施例1了哥王提取物组，实施例6了哥王提取物组，实施例7了哥王提取物组，实施例8了哥王提取物组和阳性对照组对二甲苯所引起的小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制作用，与空白对照组比较均有统计学差异。但不同组别的抑制率有所不同，其中实施例1组和实施例6组的抗炎效果最为接近阳性对照组。
表2：肿胀抑制率测定
了哥王不同提取物均能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，抗炎效果好，但是以实施例1和实施例6的提取物的效果最佳。
实施例10：镇痛效果检测
选NIH雌性小鼠90只，体重20g左右，随机分为6组，每组15只，即空白对照组(0.9％生理盐水，20ml/kg)，实施例1了哥王提取物组，实施例6了哥王提取物组，实施例7了哥王提取物组，实施例8了哥王提取物组和阳性对照组(罗通定,0.04g/kg)。
动物的喂养条件：清洁通风环境，湿度50±5％，室温23±1℃，光照周期为12小时，水食自取。
实施例1了哥王提取物组，实施例6了哥王提取物组，实施例7了哥王提取物组、实施例8了哥王提取物组用蒸馏水配成混悬液(根据各自的提取率，各自配置成对应等量生药的浓度)。
小鼠给药4天,每天1次，实验前小鼠禁食不禁水12h。第4天末次给药30min后，腹腔注射0.7％冰醋酸10ml/kg，观察15min内出现的扭体次数。扭体反应的表现为腹部收缩内凹，身体扭曲，后肢伸展。各给药组与空白对照组比较。计算各药的镇痛抑制百分率，观察药物的镇痛作用。
结果显示，腹腔注射0.7％的冰醋酸能使小鼠出现明显的扭体反应。了哥王不同组别提取物均能对抗醋酸刺激所致的疼痛反应，使小鼠扭体次数明显减少。但不同组别的抑制率有所不同，其中实施例1组和实施例6组的镇痛效果最为接近阳性对照组。
表2：对醋酸致小鼠疼痛的镇痛效果
组别 扭体次数 抑制率(％)
空白对照组 28.2±6.0 0
实施例1 14.2±4.3 50.3％
实施例6 15.1±5.2 46.8％
实施例7 26.3±6.8 7.2％
实施例8 19.5±5.5 31.4％
阳性对照组 13.3±5.2 53.5％
了哥王不同提取物均能明显抑制醋酸致小鼠疼痛，镇痛效果好，但是以实施例1和实施例6的提取物的效果最佳。
实施例11：毒副作用检测
取SD大鼠36只，雌雄各半，常规饲养适应1周后，随机分为3组，每组12只，即空白对照组(0.9％生理盐水，20ml/kg)，实施例1了哥王提取物组，实施例6了哥王提取物组。
动物的喂养条件：清洁通风环境，湿度50±5％，室温23±1℃，光照周期为12小时，水食自取。
实施例1了哥王提取物组，实施例6了哥王提取物组用蒸馏水配成混悬液(根据各自的提取率，各自配置成对应等量生药的浓度)。
实验动物每日灌胃1次，连续给药14天。实验期间，观察实验动物状况，包括精神状态、活动情况、毛色变化、饮食量、饮水量等，每隔2日称量体重，量其肛温。在第14天给药后，每组随机取6只，禁食，自由饮水，于第15天腹腔注射3.0％戊巴比妥钠(每100g体重注射0.2mL)，麻醉后腹主动脉取血，解剖大鼠，取肝组织，称其质量，计算脏器系数。每组余下6只大鼠，于第15天停止给药，正常供给饲料与水，于第28天腹主动脉取血、取肝脏，计算各脏器系数。
结果显示，给药期间空白组大鼠精神活跃，活动正常，饮食量大，毛发光滑，体重增长快。实施例6了哥王提取物组大鼠的精神萎靡，活动少，饮食量减少，体重下降，停药后以上症状逐渐好转，精神状态明显改变，活动量、饮食量增加，体重逐渐增加。实施例1了哥王提取物组精神状态较空白组略差，活动量、饮食量也有所减少，体重增长也慢一些，但相较于实施例6了哥王提取物组明显要好。
给药14天后，与空白组比较，实施例6了哥王提取物组大鼠的脏器系数明显增加，而实施例1了哥王提取物组的脏器系数无统计学差异。停药恢复2周后，各组肝脏系数无统计学差异。
表3：了哥王不同提取物对大鼠肝脏系数的影响
组别 给药后肝指数 停药恢复后肝指数
空白对照组 3.00±0.02 3.59±0.13
实施例1 3.09±0.16 3.63±0.22
实施例6 3.72±0.32 3.63±0.22
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种了哥王提取物，其制备方法如下：
(1)将了哥王根茎粗粉置于容器中，加入8～10倍量的50％～70％的乙醇，在超声条件下提取15～45分钟，得到乙醇提取液；
(2)将步骤(1)所得的乙醇提取液浓缩至无醇味的膏体后，用5～8倍量的水稀释得到稀释液，加入体积比1:1的乙酸乙酯，萃取0.5～2小时，分离，得到乙酸乙酯萃取物和剩余液A，将所述乙酸乙酯萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物A；
(3)在步骤(2)所得的剩余液A中加入体积比1:1的正丁醇，萃取0.5～2小时，分离，得到正丁醇萃取液，将所述正丁醇萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物B；
(4)合并步骤(2)所得的萃取物A和步骤(3)所得的萃取物B，即得到所述了哥王提取物。
2.如权利要求1所述的了哥王提取物，其特征在于：步骤(1)为加入8倍量的55％的乙醇，在超声条件下提取30分钟。
3.一种如权利要求1或2所述的了哥王提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。
4.一种抗炎镇痛药物，其特征在于：包括如权利要求1或2所述的了哥王提取物。
5.如权利要求4所述的抗炎镇痛药物，其特征在于：所述药物为口服制剂。
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