CN115493919A - 一种c肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及磁微粒化学发光体外诊断技术领域，提出了一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷5‑6g、氯化钠8‑10g、乙二胺四乙酸二钠1‑1.5g、聚乙烯吡咯烷酮6‑15g、山梨糖醇4‑6g、胰蛋白胨0‑20g、动物血清20‑50mL、防腐剂1‑2mL、水900‑1000mL。通过上述技术方案，解决了现有技术中的冻干校准品使用前需要复溶导致结果出现偏差以及无法长期保存的问题。

Description

一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液
技术领域
本发明涉及磁微粒化学发光体外诊断技术领域，具体的，涉及一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液。
背景技术
胰岛素是由胰岛β细胞分泌的一种蛋白质，是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。因此，体外准确检测胰岛素的含量显得尤为重要。体外注射的胰岛素在过冷或过热条件下均可引起变性，应存放在阴凉的环境中，存放温度应低于25℃，并且应在一个月内使用完，否则将影响治疗效果，因此胰岛素的保存尤为重要。目前检测用胰岛素校准品均为冻干粉形式，复溶后只能稳定保存两周，保存时间短，稳定性差。
C肽（C-Peptide）又称连接肽，由胰岛β细胞分泌，它与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原。胰岛素原裂解成1个分子的胰岛素和1个分子的C肽，因此C肽与自身胰岛素摩尔量是一致的。C肽用于评估胰岛B细胞的分泌功能比测定胰岛素更可靠，测定C肽水平对糖尿病人治疗的选择更有参考价值，而且C肽测定可以用于了解胰岛素移植和胰腺移植是否存活。但是，C肽的化学稳定性非常依赖于氨基酸的组成和序列。一般而言，冻干肽通常比溶液中的对应物更稳定。防止或最小化肽降解的一般方法是将肽以-20℃或更优选-80℃的冻干形式储存，因此，市场上C肽校准品均已冻干形式存在，如果肽在溶液中，则应通过冷冻各个等分试样来避免冻融循环。
C肽和胰岛素是蛋白质类激素，化学稳定性依赖于氨基酸的排列序列和组成。冻干肽通常比溶液中的对应物更稳定，现在市场上胰岛素和C肽磁微粒化学发光试剂盒中的校准品均以冻干粉形式存在。如深圳新产业生物医学工程股份有限公司、北京热景生物技术有限公司、杭州泰格医药科技股份有限公司、北京北方生物技术研究所有限公司以及达瑞生物科技有限公司等公司中的C肽和胰岛素磁微粒化学发光试剂盒中的校准品均为冻干品。这种冻干校准品稀释液的配方如表1所示：
表1 冻干校准品稀释液的配方
Figure DEST_PATH_IMAGE001
冻干校准品存在的缺点：
a)生产工艺复杂，增加企业生产成本；
b)使用前需要复溶，给操作带来不便；
c)复溶过程中操作者操作误差可能对准确度带来影响，导致检测结果出现偏差；
d)复溶后校准品易被降解，未启封时2-8℃下保存直到失效日期；启封复溶后2-8℃下只能保存1周。
发明内容
本发明提出一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，解决了现有技术中的冻干校准品使用前需要复溶且易出现操作误差以及稳定性差的问题。
本发明的技术方案如下：
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷5-6g、氯化钠8-10g、乙二胺四乙酸二钠1-1.5g、聚乙烯吡咯烷酮6-15g、山梨糖醇4-6g、胰蛋白胨0-20g、动物血清20-50mL、防腐剂1-2mL、水900-1000mL。
作为进一步的技术方案，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷5-6g、氯化钠8-10g、乙二胺四乙酸二钠1-1.5g、聚乙烯吡咯烷酮6-9g、山梨糖醇4-6g、胰蛋白胨15-20g、绵羊血清20-50mL、防腐剂1-2mL、水900-1000mL。
作为进一步的技术方案，所述防腐剂为防腐剂Proclin300。
作为进一步的技术方案，所述动物血清为绵羊血清。
作为进一步的技术方案，还包括pH调节剂。
作为进一步的技术方案，所述pH调节剂为氢氧化钠。
本发明还提出一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液的制备方法，包括以下步骤：
S1、将三羟甲基氨基甲烷加入水中，搅拌至完全溶解；
S2、调节pH至7-7.4；
S3、加入除防腐剂外的其余组分，搅拌至溶解后加入防腐剂即可。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种C肽和胰岛素试剂盒通用的液态校准品稀释液，首次将聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、绵羊血清和胰蛋白胨作为稳定剂用于胰岛素和C肽校准品稀释液中，三者具有协同作用，共同提升胰岛素和C肽校准品的稳定性。
2、本发明的校准品稀释液无需冻干，在生产时无需进行冻干工序，缩短了生产周期，降低了生产成本。同时在使用时也无需经过复溶环节，多次定标的校准曲线可重复性优于冻干校准品的校准曲线，避免了复溶时带来的准确度偏差。
3、本发明的校准品稀释液在2-8℃条件下可稳定保存12个月，为胰岛素和C肽校准品的稳定性提供了有力保障。使用后的校准品仍可以长期保存，可至试剂盒有效期。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明具体实施方式中所用的试剂和检测仪器均为本领域市售产品，所用检测方法均为本领域常规方法。
实施例1
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，配方如表2所示。
表2 实施例1中校准品稀释液的配方
Figure 646174DEST_PATH_IMAGE002
制备方法：
S1、将三羟甲基氨基甲烷加入水中，搅拌至完全溶解；
S2、加入氢氧化钠调节pH至7.2；
S3、加入除Proclin300外的其余组分，搅拌至溶解后加入Proclin300即可。
实施例2
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，配方如表3所示。
表3 实施例2中校准品稀释液的配方
Figure 579495DEST_PATH_IMAGE003
制备方法：
S1、将三羟甲基氨基甲烷加入水中，搅拌至完全溶解；
S2、加入氢氧化钠调节pH至7.2；
S3、加入除Proclin300外的其余组分，搅拌至溶解后加入Proclin300即可。
实施例3
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，配方如表4所示。
表4 实施例3中校准品稀释液的配方
Figure 795844DEST_PATH_IMAGE004
制备方法：
S1、将三羟甲基氨基甲烷加入水中，搅拌至完全溶解；
S2、加入氢氧化钠调节pH至7.3；
S3、加入除Proclin300外的其余组分，搅拌至溶解后加入Proclin300即可。
实施例4
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，配方如表5所示。
表5 实施例4中校准品稀释液的配方
Figure 382683DEST_PATH_IMAGE005
制备方法：
S1、将三羟甲基氨基甲烷加入水中，搅拌至完全溶解；
S2、加入氢氧化钠调节pH至7.1；
S3、加入除Proclin300外的其余组分，搅拌至溶解后加入Proclin300即可。
对比例1
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，配方如表6所示。
表6 对比例1中校准品稀释液配方
Figure 605854DEST_PATH_IMAGE006
对比例2
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，配方如表7所示，制备方法与实施例1相同。
表7 对比例2中校准品稀释液配方
Figure 949723DEST_PATH_IMAGE007
对比例3
一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，配方如表8所示，制备方法与实施例1相同。
表8 对比例3中校准品稀释液配方
Figure 941950DEST_PATH_IMAGE008
实验一：胰岛素校准品热加速稳定性实验
取一定量的胰岛素，分别加入制备得到的校准品稀释液中，配制成不同浓度的系列校准品，进行热加速稳定性验证，实验结果如下表所示。
表9 实施例1胰岛素校准品热加速稳定性
Figure 168532DEST_PATH_IMAGE009
表10 实施例2胰岛素校准品热加速稳定性
Figure 754365DEST_PATH_IMAGE010
表11 实施例3胰岛素校准品热加速稳定性
Figure 498330DEST_PATH_IMAGE011
表12 实施例4胰岛素校准品热加速稳定性
Figure 856DEST_PATH_IMAGE012
表13 对比例1胰岛素校准品热加速稳定性
Figure 804864DEST_PATH_IMAGE013
表14 对比例2胰岛素校准品热加速稳定性
Figure 81255DEST_PATH_IMAGE014
表15 对比例3胰岛素校准品热加速稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE015
实验二：C肽校准品热加速稳定性实验
取一定量的C肽，分别加入制备得到的校准品稀释液中，配制成不同浓度的系列校准品，进行热加速稳定性验证，实验结果如下表所示。
表16 实施例1 C肽校准品热加速稳定性
Figure 105275DEST_PATH_IMAGE016
表17 实施例2 C肽校准品热加速稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE017
表18 实施例3 C肽校准品热加速稳定性
Figure 744198DEST_PATH_IMAGE018
表19 实施例4 C肽校准品热加速稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE019
表20 对比例1 C肽校准品热加速稳定性
Figure 594474DEST_PATH_IMAGE020
表21 对比例2 C肽校准品热加速稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE021
表22 对比例3 C肽校准品热加速稳定性
Figure 810691DEST_PATH_IMAGE022
根据实验一和实验二的数据可以发现，实施例1中稀释的C肽和胰岛素校准品的降幅在9%以内，符合性能指标的要求，此配方校准品稀释液中所有组分均是最优配方。实施例2的效果与实施例1相比有所下降，但与实施例1效果相差不大。而对比例1中稀释的校准品降幅较大，其对胰岛素和C肽抗原的保护作用较差，不利于推广应用，对比例2和对比例3中相比于实施例1，缺少PVP或绵羊血清，稳定性反而不如对比例1的校准品，说明对于本发明的体系，只有同时添加PVP和绵羊血清时效果最佳。
实验三：实施例1与冻干校准品热加速稳定性对比
对本发明的实施例1得到的胰岛素和C肽试剂盒校准品稀释液稀释的与市场上冻干校准品在37℃条件下实时放置两周的稳定性进行考核对比，其稳定性考核结果如下表所示。
表23 本发明与市场胰岛素校准品热加速的稳定性数据
Figure DEST_PATH_IMAGE023
表24 本发明与市面上C肽校准品热加速的稳定性数据
Figure DEST_PATH_IMAGE025
本发明提供的液态胰岛素校准品加速两周后降幅最高在5.73%，而冻干校准品加速两周后降幅最高在11.1%；本发明提供的液态C肽校准品加速两周后降幅最高在7.07%，冻干校准品加速两周后降幅最高在12.4%。
通过数据可以看出，虽然冻干校准品和本发明稀释的液态校准品加速两周后的降幅均符合要求，但本发明提供的校准品稀释液稀释的液态校准品降幅更小，稀释液对校准品中抗原的保护作用更好，校准品更稳定。
实验四：实施例1与冻干校准品追踪稳定性对比
对本发明实施例1的胰岛素和C肽试剂盒校准品稀释液稀释的与市场上冻干校准品在2-8℃条件下实时放置12个月的稳定性进行考核对比，其稳定性考核结果如下表所示。
表25 本发明与市场胰岛素校准品追踪稳定性数据
Figure DEST_PATH_IMAGE027
表26 本发明与市面上C肽校准品追踪稳定性数据
Figure DEST_PATH_IMAGE029
本发明提供的液态胰岛素校准品实时放置13个月后降幅最高在7.95%，而冻干校准品实时放置13个月降幅最高在13.53%；本发明提供的液态C肽校准品实时放置13个月后降幅最高在8.39%，冻干校准品加速两周后降幅最高在12.33%。
通过数据可以看出，冻干校准品和本发明稀释的液态校准品均可以在2-8℃条件下稳定放置13个月，并且液态校准品的降幅要小于冻干校准品的降幅。说明液态校准品更稳定，本发明提供的稀释液对校准品的保护作用更强。
综上所述，本发明提供的一种胰岛素和C肽试剂盒校准品稀释液对校准品有更好的保护作用，37℃两周加速后稳定性更好，2-8℃13个月实时稳定性更优。因此，本发明的校准品稀释液稳定性好、操作简便，拥有更广泛的应用前景。
应用例：检测胰岛素或C肽含量
（1）制备胰岛素或C肽系列校准品
取一定量的胰岛素或C肽抗原，分别加入制备得到的校准品稀释液中，配制成不同浓度的系列校准品。
（2）制备包被有抗胰岛素和抗C肽抗体的磁微粒混悬液
a)吸取100uL 10mg/mL的羧基磁珠，用1mL 0.1M MES清洗三次后加入1mLl MES，加入过量的EDC和NHS进行活化；
b)活化完成后放在磁分离器上静置2min，吸弃上清，用MES缓冲液洗涤两遍；
c)洗涤完成后加入1mL MES，加入100ug胰岛素和C肽抗体，震荡反应4h；
d)反应结束后放到磁分离器上，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1%牛血清蛋白（BSA）的PBS缓冲液清洗一遍，加入1mL BSA溶液进行封闭，反应1h；
e)封闭结束后用磁珠清洗液清洗三遍，加入1mL磁珠保存液后放到2-8℃，留取待用，使用时按磁珠包被抗体/磁珠稀释液1/50倍稀释。
（3）制备标记有抗胰岛素和抗C肽抗体的吖啶酯标记液
a)称取吖啶酯固体颗粒，加入一定量的二甲基亚砜溶解吖啶酯，使吖啶酯终浓度为4mM；
b)在400ul吖啶酯标记液中加入5ul的吖啶酯和100ug的抗体，室温孵育1h；
c)反应结束后加入50ul甘氨酸进行终止，反应0.5h；
d)进行吖啶酯的纯化，将标记液转移到处理好的透析袋中，压紧透析袋，放到1L吖啶酯纯化缓冲液中进行透析，每两小时更换一次透析液，直至透析液的发光值小于10万；
e)纯化完成后将标记液吸取到EP管中，加入等体积甘油，留取待用，使用时按吖啶酯抗体/吖啶酯稀释液=1/200倍稀释。
（4）制备发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液
a)发光底物A液配制：向纯化水冲洗干净的棕色瓶中加入981.55g纯化水，加入3.45mL HNO3，称取16.45g浓度为30%的H2O2至50mL离心管，将其倒入瓶中，颠倒混匀后取瓶中液体洗刷离心管3次，并将涮洗液重新倒回瓶中，颠倒混匀，留取待用；
b)发光底物B液配制：向纯化水冲洗干净的棕色瓶中加入997g纯化水，加入12g氢氧化钠粉末，称取3.2g曲拉通X100至15mL离心管，将离心管扔进瓶中，颠倒混匀，留取待用；
c)洗液的配制配方：
按照10L基准量计：
磷酸氢二钠40g
磷酸二氢钠229.9g
氯化钠1800g
吐温20 100mL
Proclin-300 10mL
洗液的配制方法：
配制桶中加入体外诊断试剂用纯化水8L，准确称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，吐温20、Proclin300，匀速搅拌，充分溶解后定容至10L，2℃-8℃避光保存备用。
（5）检测胰岛素或C肽含量
采用以上相关试剂进行胰岛素或C肽含量的检测，具体步骤为：
a)取一定量的磁珠稀释液加到试剂船的A腔体中，包被抗体和磁珠稀释液稀释比例按1/50倍加入胰岛素或C肽抗体；
b)取一定量的吖啶酯稀释液加到试剂船的D腔体中，标记抗体和吖啶酯稀释液稀释比例按1/200倍加入胰岛素或C肽抗体；
c)全自动化学发光仪检测发光强度；
d)采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为X轴，以校准品发光强度对数值为Y轴，建立定标曲线，根据待测样本的发光强度值回算相应的浓度值。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，其特征在于，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷5-6g、氯化钠8-10g、乙二胺四乙酸二钠1-1.5g、聚乙烯吡咯烷酮6-15g、山梨糖醇4-6g、胰蛋白胨0-20g、动物血清20-50mL、防腐剂1-2mL、水900-1000mL。
2.根据权利要求1所述的一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，其特征在于，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷5-6g、氯化钠8-10g、乙二胺四乙酸二钠1-1.5g、聚乙烯吡咯烷酮6-9g、山梨糖醇4-6g、胰蛋白胨15-20g、绵羊血清20-50mL、防腐剂1-2mL、水900-1000mL。
3.根据权利要求1所述的一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，其特征在于，所述防腐剂为防腐剂Proclin300。
4.根据权利要求1所述的一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，其特征在于，所述动物血清为绵羊血清。
5.根据权利要求1所述的一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，其特征在于，还包括pH调节剂。
6.根据权利要求5所述的一种C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，其特征在于，所述pH调节剂为氢氧化钠。
7.一种如权利要求1所述的C肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将三羟甲基氨基甲烷加入水中，搅拌至完全溶解；
S2、调节pH至7-7.4；
S3、加入除防腐剂外的其余组分，搅拌至溶解后加入防腐剂即可。
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