CN115093475A - 阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液及其制备方法 - Google Patents

阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白‑1提取液，包括以下主要成分：三羟甲基氨基甲烷，牛血清白蛋白，蔗糖，氯化钠，聚乙烯吡咯烷酮，吐温‑20，乙二胺四乙酸二钠，Marimastat，Ilomastat，ProClin300及纯化水，并调节pH至适宜数值。还公开了该提取液的制备方法。本发明提供的胰岛素样生长因子结合蛋白‑1提取液，能够提高IGFBP‑1洗脱后的稳定性，延长定性检测的样本存放时间，并满足定量检测IGFBP‑1的需求。

Description

阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，特别是涉及一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液及其制备方法。
背景技术
胰岛素样生长因子结合蛋白-1，又称IGFBP-1，由234个氨基酸组成，分子量约25KD，其脱磷酸化形式主要存在于羊水中，是孕期羊水中的一种标志性蛋白质。当发生胎膜破裂时，羊水从胎膜的破口漏到宫颈阴道中，阴道分泌物中含有的IGFBP-1成为胎膜早破诊断的标志，由于其在羊水中的含量极高，因此灵敏度非常高，临床常用于检测常规手段无法测出的疑似破水。
目前检测IGFBP-1手段主要为定性检测，定量检测较少，其主要原因是IGFBP-1蛋白不稳定。IGFBP-1富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的PEST序列易水解，而用于胎膜早破诊断的IGFBP-1为脱磷酸化形式，相较于磷酸化IGFBP-1，脱磷酸化形式的PEST序列更易受到蛋白酶的影响。由于IGFBP-1以上特性，临床检测IGFBP-1推荐提取样本后1小时内检测，否则可能发生明显降解，且亦有研究发现发生羊水感染时基质金属蛋白酶(MMPs)显著升高，导致IGFBP-1降解为21KD、17KD及12KD的三种片段，可能出现假阴性结果。
发明人通过试验观察，发现IGFBP-1不稳定的特性主要有两点重要原因，一是因为IGFBP-1在生理上就是通过降解为片段来实现生理学功能，本身易水解，但这种水解速度在使用纯品蛋白进行观察时并不像临床样本这样明显，通过添加保护物质可以解决；二是因为临床样本如阴道分泌物或羊水中存在的蛋白酶会加速原因一中的水解平衡。因此，IGFBP-1从分泌物中提取后稳定性无法保证，会导致定量检测结果不准确。
因此亟需提供一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液及其制备方法来解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液及其制备方法，可延长定性检测的样本存放时间，并满足定量检测IGFBP-1的需求。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，按质量分数包括以下组分：
Figure BDA0003737270810000021
其中，缓冲液基质的pH值调至7.6～8.2，优选的，pH值为7.8～8.0。
其中，三羟甲基氨基甲烷为适宜该pH值范围的缓冲液基质成分；牛血清白蛋白与蔗糖的作用是增加IGFBP-1蛋白的稳定性，改善IGFBP-1水解平衡，降低水解速度；氯化钠的作用是提高提取液的均一度与分散性；聚乙烯吡咯烷酮的作用是增加稳定性；吐温-20的作用是保证IGFBP-1从棉签上全部洗脱；乙二胺四乙酸二钠、Marimastat和Ilomastat的作用是抑制基质金属蛋白酶对IGFBP-1的降解作用；ProClin300为防腐剂。各成分在以上用量范围内，成本可控，不存在昂贵物质，适宜作为提取液使用。
在本发明一个较佳实施例中，所述缓冲液基质的pH值为7.8～8.0。
在本发明一个较佳实施例中，所述缓冲液基质的含量为10～20mmol/L。
进一步的，所述缓冲液基质采用三羟甲基氨基甲烷。
在本发明一个较佳实施例中，所述抑制降解剂采用Marimastat或/和Ilomastat。
在本发明一个较佳实施例中，所述乙二胺四乙酸二钠的含量为0.2％～0.5％(w/v)。
优选的，所述乙二胺四乙酸二钠的含量为0.3％～0.4％(w/v)。
在本发明一个较佳实施例中，所述防腐剂为ProClin300。
优选的，该提取液中各组分的优选含量如下：
Figure BDA0003737270810000022
Figure BDA0003737270810000031
本发明的使用方法为：将阴道分泌物棉拭子在本提取液中旋转洗脱60秒。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取纯化水，加入三羟甲基氨基甲烷，充分溶解混匀；
(2)称取牛血清白蛋白、蔗糖、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮及乙二胺四乙酸二钠并加入步骤(1)的溶液中充分溶解混匀；
(3)称取吐温-20加入步骤(2)的溶液中充分溶解混匀；
(4)吸取25nmol/L～100nmol/L的Marimastat和25nmol/L～100nmol/L的Ilomastat，加入步骤(3)的溶液中充分混匀；
(5)吸取ProClin300加入溶液中充分混匀；
(6)用稀盐酸调节溶液pH至7.6～8.2，再定容至一定体积。。
本发明的有益效果是：本发明提供的胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，可明显改善IGFBP-1从阴道分泌物中洗脱后的稳定性，在2℃～8℃冷藏保存的情况下可维持至少12h，因此可延长定性检测的样本存放时间，并满足定量检测IGFBP-1的需求。
附图说明
图1是实施例1至5低浓度组的蛋白保护能力测试数据曲线图；
图2是实施例1至5高浓度组的蛋白保护能力测试数据曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：
一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，按质量分数包括以下组分：
Figure BDA0003737270810000041
其中，三羟甲基氨基甲烷的pH值调至7.8～8.0。
该1L提取液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取800ml纯化水，加入1.21g三羟甲基氨基甲烷，充分溶解混匀；
(2)称取10g牛血清白蛋白、20g蔗糖、8g氯化钠、2g聚乙烯吡咯烷酮及4g乙二胺四乙酸二钠并加入溶液中充分溶解混匀；
(3)称取0.5g吐温-20加入溶液中充分溶解混匀；
(4)吸取50μl的10mmol/L Marimastat和50μl的10mmol/L Ilomastat，加入溶液中充分混匀；
(5)吸取0.4ml的ProClin300加入溶液中充分混匀；
(6)用稀盐酸调节溶液pH至8.0，再定容至1L。
实施例2：
一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液①，按质量分数包括以下组分：
磷酸盐缓冲液(PBS) 10mmol/L，pH7.4
吐温-20 0.05％
ProClin300 0.04％
实施例3：
一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液②，按质量分数包括以下组分：
Figure BDA0003737270810000051
实施例4：
一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液③，按质量分数包括以下组分：
Figure BDA0003737270810000052
实施例5：
一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液④，按质量分数包括以下组分：
Figure BDA0003737270810000053
下面对以上实施例制备的提取液进行如下性能测试：
1、洗脱能力测试：
实施例1制备的IGFBP-1提取液，通过两种方式加入IGFBP-1蛋白。
(1)1ml提取液中直接加入20ng高浓度蛋白液，经测试提取液中IGFBP-1浓度为18ng/ml；1ml提取液中直接加入200ng高浓度蛋白液，经测试提取液中IGFBP-1浓度为206ng/ml。
(2)将20ng高浓度蛋白液用阴道棉拭子吸收，再放入1ml提取液中进行洗脱，经测试提取液中IGFBP-1浓度为19ng/ml；将200ng高浓度蛋白液用阴道棉拭子吸收，再放入1ml提取液中进行洗脱，经测试提取液中IGFBP-1浓度为202ng/ml。
以上测试证明该提取液的成分对IGFBP-1提取没有影响，可保证棉拭子上的蛋白被全部洗脱。
2、蛋白保护能力测试：
作为比对，在各组提取液中均加入同一份羊水样本，使终浓度一致，再添加终浓度均为5pmol/L的MMP-3、MMP-8及MMP-9，配制后放在2～8℃进行定时监测。IGFBP-1数值(均值)变化为：
表1低浓度组
Figure BDA0003737270810000061
与该表相对应的数据曲线图参见图1。
表2高浓度组
Figure BDA0003737270810000062
Figure BDA0003737270810000071
与该表相对应的数据曲线图参见图2。
分析以上数据可得出：
(1)提取液①及提取液②提取IGFBP-1后，临床样本中含有的蛋白酶会加速IGFBP-1在稀释环境下的降解，在提取后几乎瞬时就会水解，并在数小时内不断降低，但可比较出在pH8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲系统中降解速度慢于pH7.4的磷酸盐缓冲系统。
(2)提取液③相比提取液①和提取液②，瞬时水解降低，降解速率也明显变慢，表明牛血清白蛋白、蔗糖及聚乙烯吡咯烷酮起到了稳定及保护蛋白的作用，但随着时间推移显示出受蛋白酶影响缓慢降解的趋势。
(3)实施例1制备的提取液对MMPs催化蛋白降解的抑制作用强于提取液④，可保持IGFBP-1至少在12h内没有明显变化。
因此本发明提取液对IGFBP-1的保护效果优于其它4组。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (8)

1.一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，其特征在于，按质量分数包括以下组分：
Figure FDA0003737270800000011
其余为纯化水；
其中，缓冲液基质的pH值调至7.6～8.2。
2.根据权利要求1所述的阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，其特征在于，所述缓冲液基质的pH值为7.8～8.0。
3.根据权利要求1所述的阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，其特征在于，所述缓冲液基质的含量为10～20mmol/L。
4.根据权利要求1至3任一项所述的阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，其特征在于，所述缓冲液基质采用三羟甲基氨基甲烷。
5.根据权利要求1所述的阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，其特征在于，所述抑制降解剂采用Marimastat或/和Ilomastat。
6.根据权利要求1所述的阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，其特征在于，所述乙二胺四乙酸二钠的含量为0.3％～0.4％(w/v)。
7.根据权利要求1所述的阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液，其特征在于，所述防腐剂为ProClin300。
8.一种阴道分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白-1提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取纯化水，加入三羟甲基氨基甲烷，充分溶解混匀；
(2)称取牛血清白蛋白、蔗糖、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮及乙二胺四乙酸二钠并加入步骤(1)的溶液中充分溶解混匀；
(3)称取吐温-20加入步骤(2)的溶液中充分溶解混匀；
(4)吸取25nmol/L～100nmol/L的Marimastat和25nmol/L～100nmol/L的Ilomastat，加入步骤(3)的溶液中充分混匀；
(5)吸取ProClin300加入溶液中充分混匀；
(6)用稀盐酸调节溶液pH至7.6～8.2，再定容至一定体积。
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