CN115420886B - 基于二氧化钛微球提取血浆中脂质体并测定游离药物、包裹药物和总药物含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于二氧化钛微球提取血浆中脂质体并测定游离药物、包裹药物和总药物含量的方法,属于分析检测技术领域。本发明将二氧化钛微球、稀释液、酸性缓冲溶液与含有脂质体的血浆样本混合进行孵育,经固液分离得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球以及液体物料;将所述表面富集有脂质体的二氧化钛微球进行破乳处理,测定所得破乳体系中药物含量,得到所述包裹药物含量;测定所述液体物料中药物含量,得到所述游离药物的含量。本发明利用二氧化钛微球与脂质体结合,从而实现对脂质体的高效提取,基于此可以简单、准确地对脂质体内包裹的药物含量进行单独测定,在此基础上还可以得到血浆中游离药物含量。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域,具体涉及基于二氧化钛微球提取血浆中脂质体并测定游离药物、包裹药物和总药物含量的方法。
背景技术
多西他赛(docetaxel,DTX)是由紫杉针叶提取物经半合成得到的活性化合物,目前为紫杉醇类抗乳腺癌治疗的一线药物,其作用机制与紫杉醇类似,但抗肿瘤活性比紫杉醇更强。目前多西他赛市售制剂为注射剂,主要用于治疗晚期乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈癌以及小细胞肺癌,对胃癌、胰腺癌以及黑色素瘤等也有一定疗效。多西他赛的水溶性较差,故其市售制剂的处方为多西他赛、乙醇和吐温-80。但由于乙醇和吐温-80的存在,在临床应用过程中患者易发生过敏反应以及体液潴留等严重不良反应。
脂质体是一种由磷脂双分子层包裹形成的囊泡结构,其中磷脂双分子层由具有亲水头部和疏水尾部的类脂分子自组装形成,亲水头部紧密排列形成膜的外表面层和内表面层,疏水尾部处于膜的中间。这种特殊的膜结构使得脂质体不仅可以携带亲水性物质,还可以携带疏水性物质和两亲性物质。因此脂质体在实现靶向给药、缓释给药、提高难溶性药物与多肽药物的生物利用度、减轻药物不良反应等方面表现出良好的应用前景。目前多西他赛脂质体已经应用于临床研究,其处方中辅料包括脂溶性辅料、水溶性辅料和长循环辅料,其中脂溶性辅料和水溶性辅料能够将多西他赛包裹,从而增加多西他赛的水溶性,长循环辅料能够延长多西他赛在体内的时间。
近年来虽然在脂质体的设计、合成方面不断取得进展,但脂质体在体内的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程尚不十分清楚。药物的药效和毒性主要取决于药物在体内的浓度,而药物在体内的浓度主要取决于给药剂量和药物的ADME过程,因此药代动力学研究对于药物的药效和毒性评价至关重要。对于脂质体而言,进入机体后至少存在三种形态,即释放出的游离药物、脂质体颗粒(即完整的脂质体)以及构成脂质体的聚合物材料。因此分离血浆中包裹在脂质体里与游离的药物对脂质体的药代动力学研究至关重要。
常规使用的蛋白质沉淀法只能测定脂质体中药物的总含量,而无法单独测定包裹在脂质体里的药物含量,不便于分析生物体内脂质体的分布情况。固相萃取(SPE)是分离血浆中脂质体包裹的药物和游离药物的常用方法。脂质体表面通常被亲水基团所覆盖,极性大,在反相SPE柱上没有保留,而游离药物极性小,能够保留在反相SPE柱上,利用二者保留行为的差异,可以实现有效分离。但固相萃取的回收率较差,难以实现较低的定量下限(LLOQ),且实验过程复杂不具备普适性。因此,如何简单、准确地对脂质体内包裹的药物含量进行单独测定,是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于二氧化钛微球提取血浆中脂质体并测定游离药物、包裹药物和总药物含量的方法,本发明利用二氧化钛微球与脂质体结合,从而实现对脂质体的高效提取,基于此可以简单、准确地对脂质体内包裹的药物含量进行单独测定,在此基础上还可以得到血浆中游离药物含量。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种基于二氧化钛微球分离血浆中脂质体并测定游离药物和包裹于脂质体内药物含量的方法,包括以下步骤:
将二氧化钛微球、稀释液、酸性缓冲溶液与含有脂质体的血浆样本混合,将所得混合料液进行孵育,经固液分离得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球以及液体物料;
将所述表面富集有脂质体的二氧化钛微球进行破乳处理,测定所得破乳体系中药物含量,得到所述包裹药物含量;
测定所述液体物料中药物含量,得到所述游离药物的含量。
优选地,所述二氧化钛微球的粒径为5~10μm。
优选地,所述二氧化钛微球具有孔结构,孔径为8~10nm。
优选地,所述含有脂质体的血浆样本中脂质体的浓度为15~8000ng/mL;
优选地,所述二氧化钛微球与含有脂质体的血浆样本的用量比为3mg:(35~45)μL。
优选地,所述稀释液和酸性缓冲溶液的总体积与含有脂质体的血浆样本的体积比为(1~6):1。
优选地,所述酸性缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液,所述稀释液为生理盐水稀释液。
优选地,所述混合料液的pH值为2.5~7。
优选地,所述孵育的温度为2~8℃,时间为5~60min。
优选地,所述破乳处理采用的破乳剂包括甲醇、乙醇或乙腈。
本发明提供了一种基于二氧化钛微球分离血浆中脂质体并测定游离药物和包裹药物含量的方法。本发明将二氧化钛微球、稀释液、酸性缓冲溶液与含有脂质体的血浆样本混合进行孵育,经固液分离得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球以及液体物料;将所述表面富集有脂质体的二氧化钛微球进行破乳处理,测定所得破乳体系中药物含量,得到所述包裹于脂质体内的药物含量;测定所述液体物料中药物含量,得到所述游离药物的含量。在本发明中,脂质体是一种由磷脂双分子层包裹形成的囊泡结构,其中磷脂双分子层是由磷酸根基团和胆固醇等构成,脂质体表面的磷酸根基团能够与二氧化钛特异性配位结合,使脂质体富集于二氧化钛微球表面,从而实现对血浆中脂质体的高效提取,基于此可以简单、准确地对血浆中脂质体内包裹的药物含量进行单独测定,在此基础上还可以得到血浆中游离药物含量。
具体实施方式
本发明提供了一种基于二氧化钛微球分离血浆中脂质体并测定游离药物和包裹于脂质体内药物含量的方法,包括以下步骤:
将二氧化钛微球、稀释液、酸性缓冲溶液与含有脂质体的血浆样本混合,将所得混合料液进行孵育,经固液分离得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球以及液体物料;
将所述表面富集有脂质体的二氧化钛微球进行破乳处理,测定所得破乳体系中药物含量,得到所述包裹药物含量;
测定所述液体物料中药物含量,得到所述游离药物的含量。
本发明提供含有脂质体的血浆样本。在本发明中,所述脂质体包载的药物优选为难溶性药物,所述难溶性药物可以为阿霉素类药物或多西他赛,即对应的脂质体为阿霉素类脂质体或多西他赛脂质体;在本发明的实施例中,具体是以多西他赛脂质体(DTX-L)冻干粉为例进行说明。在本发明中,所述含有脂质体的血浆样本中脂质体的浓度优选为15~8000ng/mL,更优选为15~4000ng/mL。本发明对所述含有脂质体的血浆样本的制备方法没有特殊限定,采用本领域技术人员熟知的方法制备即可。在本发明中,以脂质体为DTX-L冻干粉为例,具体是将DTX-L冻干粉、稀释液(记为第一稀释液)与血浆样本混合,得到DTX-L血浆样本;所述第一稀释液优选为生理盐水稀释液,所述生理盐水稀释液的浓度优选为0.045wt%,具体是采用水将浓度为0.9wt%的生理盐水稀释20倍得到。在本发明的实施例中,具体是将所述第一稀释液与DTX-L冻干粉混合,得到浓度为1.27mg/mL的DTX-L混悬液;采用所述第一稀释液对所述DTX-L混悬液进行稀释,得到浓度为300~80000ng/mL的DTX-L工作液;将所述DTX-L工作液与血浆样本混合,得到DTX-L血浆样本;所述DTX-L工作液与血浆样本的体积比,以满足上述浓度范围为基准。
得到含有脂质体的血浆样本后,本发明将二氧化钛微球、稀释液(记为第二稀释液)、酸性缓冲溶液与所述含有脂质体的血浆样本混合,将所得混合料液进行孵育,经固液分离得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球以及液体物料。在本发明中,所述二氧化钛微球的粒径优选为5~10μm;所述二氧化钛微球具有孔结构,孔径优选为8~10nm。在本发明中,所述二氧化钛微球与含有脂质体的血浆样本的用量比优选为3mg:(35~45)μL,更优选为3mg:40μL。在本发明中,所述第二稀释液和酸性缓冲溶液的总体积与含有脂质体的血浆样本的体积比优选为(1~6):1,更优选为4:1。本发明优选通过控制各组分在上述配比范围内混合进行孵育,有利于使脂质体与二氧化钛微球微腔结合面积增大,提高提取效果。
在本发明中,所述第二稀释液优选与所述第一稀释液相同,在此不再赘述。在本发明中,所述酸性缓冲溶液优选为乙酸-乙酸钠缓冲溶液。在本发明中,所述二氧化钛微球、第二稀释液、酸性缓冲溶液与所述含有脂质体的血浆样本混合的方式优选包括:将第二稀释液与酸性缓冲溶液混合,得到含酸性缓冲溶液稀释液;将所述含酸性缓冲溶液稀释液与二氧化钛微球以及含有脂质体的血浆样本混合。在本发明中,进行所述孵育时混合料液的pH值优选为2.5~7;由于脂质体在中性环境中比较稳定,而二氧化钛微球提取脂质体在酸性环境下结合效率较高,因此pH值对于提取效率有重要影响,而且当采用色谱法检测药物含量时,酸性环境有利于使色谱图的峰形更优。
在本发明中,所述孵育的温度优选为2~8℃;时间优选为5~60min,更优选为10~20min;所述孵育优选在震荡条件下进行。所述孵育完成后,本发明将所得产物体系进行固液分离,得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球以及液体物料。在本发明中,所述固液分离的方式优选为离心,本发明对所述离心的操作条件没有特殊限定,能够实现固液分离即可。本发明优选将固液分离后所得固体物料进行洗涤,得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球。在本发明中,所述洗涤采用的洗涤试剂优选为PBS缓冲液;所述洗涤优选在振荡条件下进行,所述洗涤的次数优选为2~3次。在本发明中,所述孵育过程中,脂质体表面的磷酸根基团能够与二氧化钛特异性配位结合,使脂质体富集于二氧化钛微球表面,从而实现对脂质体的高效提取。
得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球后,本发明将所述表面富集有脂质体的二氧化钛微球进行破乳处理,测定所得破乳体系中药物含量,得到所述包裹药物含量。在本发明中,所述破乳处理采用的破乳剂优选包括甲醇、乙醇或乙腈,更优选为甲醇。本发明优选将所述表面富集有脂质体的二氧化钛微球与破乳剂混合,进行破乳处理。在本发明中,当测定所述药物含量采用内标物法时,优选在含有内标物的条件下进行破乳处理,具体是将内标物工作液与破乳剂混合,得到含内标破乳剂;将所述含内标破乳剂与表面富集有脂质体的二氧化钛微球混合,进行破乳处理。本发明对所述内标物的种类没有特殊限定,根据药物种类进行选择即可;在本发明的实施例中,以检测多西他赛为例,采用的内标物为紫杉醇,具体是将紫杉醇溶解于二甲基亚砜中,得到浓度为5mg/mL的内标储备液,采用甲醇对所述内标储备液进行稀释,得到浓度为300ng/mL的内标工作液,4℃保存。在本发明中,所述破乳处理优选包括依次进行的涡旋处理和超声处理;所述涡旋处理的时间优选为1min;所述超声处理的时间优选为5min。在本发明中,所述破乳处理过程中,脂质体结构可以充分被打开,释放出包裹在脂质体内部的药物。
所述破乳处理后,本发明优选将所得物料进行第一离心,去除所得上清液中溶剂,将所得剩余物复溶,得到复溶液;将所述复溶液进行第二离心,测定所得上清液中药物含量,根据所述上清液中药物含量,得到包裹在脂质体内部的药物含量。本发明对所述第一离心和第二离心的操作条件没有特殊限定,能够实现固液分离即可。在本发明中,去除第一离心所得上清液中溶剂的方法优选为将所述上清液置于离心浓缩仪中浓缩至干,所述浓缩优选在45℃条件下进行。在本发明中,所述复溶采用的复溶剂优选为乙腈-甲酸-水溶液,所述乙腈-甲酸-水溶液中乙腈的体积分数优选为50~70%,甲酸的体积分数优选为0.1~0.2%。本发明对测定第二离心所得上清液中药物含量的方法没有特殊限定,采用本领域技术人员熟知的方法即可;在本发明的实施例中,以检测多西他赛为例,具体可以采用UPLC-MS/MS方法检测其含量。
所述孵育后经固液分离得到液体物料,本发明测定所述液体物料中药物含量,得到所述游离药物的含量。本发明优选将所述液体物料与上述步骤中采用洗涤试剂洗涤所述固体物料后所得清洗液合并,测定所得合并液中药物含量,得到所述游离药物的含量。本发明对所述药物含量的测定方法没有特殊限定,采用上述方法进行检测即可,在此不再赘述。
在本发明中,TiO2本身是两性物质,在不同的pH值环境下,可以是路易斯酸亦或是路易斯碱:在酸性环境时,钛原子带正电荷,成为路易斯酸,可以表现为结合阴离子;在碱性环境时,成为路易斯碱,可以表现为结合阳离子。调节pH值产生变化,可以控制让钛原子结合磷酸根基团,从而实现磷酸肽富集。根据脂质体的结构以及路易斯酸碱相互作用,磷酸根基团采用双齿配位结合方式作用于TiO2微球表面,使脂质体与TiO2的结合,从而实现对脂质体的高效提取,基于此可以简单、准确地对脂质体内包裹的药物含量进行单独测定,在此基础上还可以得到血浆中游离药物含量。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例所用多西他赛脂质体(DTX-L)冻干粉为东曜药业有限公司提供,样品名称为TID214,样品批号024-001-2;其中,所述DTX-L冻干粉样品的指标参数为API为7.5mg/瓶,粒径分布为183.6nm,PDI:0.296,zeta电位为-6.45mV,检测方法马尔文NanoZS90;包封率为91.7%,检测方法层析法;复溶后API浓度为1.27mg/mL,溶解方法如上文所述。
实施例1
(1)将内标物紫杉醇(PTX,Internal Standard,IS)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,得到浓度为5mg/mL的内标储备液,4℃保存;
采用水将浓度为0.9wt%的生理盐水稀释20倍,得到浓度为0.045wt%的生理盐水稀释液,将所述生理盐水稀释液与DTX-L冻干粉混合,配制得到浓度为1.27mg/mL的DTX-L混悬液,采用所述生理盐水稀释液对所述DTX-L混悬液进行稀释,得到DTX-L浓度为300~80000ng/mL的DTX-L工作液;取空白大鼠血浆,将所述DTX-L工作液加入到所述空白大鼠血浆中,在冰浴条件下,用移液枪轻轻吹打使二者混匀,得到DTX-L血浆样本(DTX-L浓度为15~4000ng/mL);
(2)将所述生理盐水稀释液与乙酸-乙酸钠缓冲溶液混合,得到pH值为3的含缓冲溶液生理盐水稀释液;将3mg的TiO2微球(粒径为5~10μm,孔径为8~10nm,购自GLscience,货号为2020-75000)放入1.5mL EP管中,加入160μL所述含缓冲溶液生理盐水稀释液充分涡旋,然后加入40μL所述DTX-L血浆样本,在4℃恒温条件下,采用旋转混合仪振荡孵育15min,得到孵育液;将所述孵育液进行离心,得到上清液和沉淀物;所述沉淀物使用PBS缓冲液振荡清洗3次,每次清洗后经离心分离,最终所得沉淀物即为表面富集有DTX-L的TiO2微球;收集每次清洗后所得清洗液与前述上清液合并,得到合并液;
(3)以甲醇作为破乳剂对所述内标储备液进行稀释,得到内标物浓度为300ng/mL的内标工作液;将300μL所述内标工作液与表面富集有DTX-L的TiO2微球混合,涡旋1min,然后超声5min,使富集在TiO2微球的DTX-L充分溶解在甲醇中;然后将所得物料进行离心,收集上清液于EP管中,用离心浓缩仪在45℃条件下浓缩至干,得到浓缩物;
(4)将水与乙腈混合,得到乙腈体积分数为70%的乙腈-水溶液,将所述乙腈-水溶液与甲酸混合,得到甲酸体积分数为0.1%的乙腈-甲酸-水溶液;采用0.045mL乙腈-甲酸-水溶液将所述浓缩物复溶,将所得物料进行离心,取上清液进行UPLC-MS/MS分析,得到包裹在脂质体内部的多西他赛含量;参照上述方法测定所述合并液中多西他赛含量,得到血浆中游离多西他赛的含量。
对比例1
测定血浆中药物浓度的常规方法为蛋白沉淀法,具体操作如下:
(1)将内标物紫杉醇(PTX,Internal Standard,IS)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,得到浓度为5mg/mL的内标储备液,4℃保存;
采用水将浓度为0.9%的生理盐水稀释20倍,得到浓度为0.045%的生理盐水稀释液,将所述生理盐水稀释液与DTX-L冻干粉混合,配制得到均一稳定的DTX-L混悬液,采用所述生理盐水稀释液对所述DTX-L混悬液进行稀释,得到DTX-L浓度为150~80000ng/mL的DTX-L工作液;取空白大鼠血浆,将所述DTX-L工作液加入所述空白大鼠血浆中,充分涡旋使二者混匀,得到DTX-L血浆样本(DTX-L的浓度为7.5~4000ng/mL);
(2)以甲醇作为破乳剂,对所述内标储备液进行稀释,得到内标物浓度为300ng/mL的内标工作液;将300μL所述内标工作液与DTX-L血浆样本混合,涡旋震荡使之充分沉淀,其中,所述含内标破乳剂与DTX-L血浆样本的体积比为3:1;然后将所得物料进行离心,收集上清液50μL,进行UPLC-MS/MS检测,得到脂质体中全部多西他赛的含量。
实施例2
多西他赛脂质体在SD大鼠体内药代动力学研究,具体步骤如下:
大鼠静脉给药DTX-L 2mg/kg,采血时间点分别为0h、0.033h、0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h;采用大鼠眼眶静脉丛取血方式,使用0.5mm玻璃毛细管,每个采血时间点取血150μL置于制作好的1.5mL肝素钠EP管中,大鼠经取血后,全血样品置于离心机中,4℃条件下于4000rpm离心10min,取血浆40μL于1.5mL EP管中,采用实施例1中二氧化钛提取法进行检测;并取血浆20μL于1.5mLEP管中,采用对比例1中蛋白沉淀法进行检测加以对比。具体结果见表1。
表1大鼠静脉给药2mg/kg剂量多西他赛脂质体后多西他赛的血药浓度
由以上对比例和实施例可知,蛋白沉淀法只能测定DTX-L中总的多西他赛的含量,即包裹在DTX-L里与游离多西他赛的总含量;而本发明提供的TiO2提取法可以单独测定包裹在DTX-L里的多西他赛的含量,便于分析生物体内脂质体的分布情况。具体来说,本发明至少具有以下优势:
(1)本发明通过采用TiO2微球提取血浆中脂质体,可以成功分离并检测不同部分的药物含量(如脂质体内包裹的药物含量,进而可以获知游离药物含量),且其方法简单易行,成本较低,操作方便,绿色环保。本发明以多西他赛脂质体为例,采用TiO2微球提取血浆中多西他赛脂质体,具有较高的提取效率,提取效率平均在93%以上。
(2)本发明采用的TiO2微球在酸性环境下与脂质体结合,在碱性环境结合打开,故TiO2微球可以重复利用,有利于降低成本;本发明在对多西他赛脂质体包裹的多西他赛含量进行测定的过程中,破乳后将所得物料进行离心,收集上清液浓缩至干得到浓缩物,采用少量有机溶剂(即乙腈-甲酸-水溶液)对所述浓缩物复溶后再进行分析检测,废弃的有机溶剂较少,符合绿色化学的原则。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.基于二氧化钛微球提取血浆中脂质体并测定游离药物、包裹药物和总药物含量的方法,包括以下步骤:
将二氧化钛微球、稀释液、酸性缓冲溶液与含有脂质体的血浆样本混合,将所得混合料液进行孵育,经固液分离得到表面富集有脂质体的二氧化钛微球以及液体物料;所述二氧化钛微球与含有脂质体的血浆样本的用量比为3mg:(35~45)μL;所述稀释液和酸性缓冲溶液的总体积与含有脂质体的血浆样本的体积比为(1~6):1;所述酸性缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液;所述稀释液为生理盐水稀释液;所述脂质体包载的药物为难溶性药物,所述难溶性药物为阿霉素类药物或多西他赛;所述含有脂质体的血浆样本中脂质体的浓度为15~8000ng/mL;所述混合料液的pH值为2.5~3;所述含有脂质体的血浆样本中脂质体的浓度为15~8000ng/mL;所述二氧化钛微球具有孔结构,孔径为8~10nm;
将所述表面富集有脂质体的二氧化钛微球进行破乳处理,测定所得破乳体系中药物含量,得到所述包裹药物含量;
测定所述液体物料中药物含量,得到所述游离药物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述二氧化钛微球的粒径为5~10μm。
3.根据权利要求1~2任一项所述的方法,其特征在于,所述孵育的温度为2~8℃,时间为5~60min。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述破乳处理采用的破乳剂包括甲醇、乙醇或乙腈。
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